一种高稳定性藻蓝蛋白类融合荧光蛋白质的制备方法.pdf

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1、(10)授权公告号 CN 101838661 B (45)授权公告日 2012.03.28 CN 101838661 B *CN101838661B* (21)申请号 200910019914.1 (22)申请日 2009.03.14 C12N 15/70(2006.01) C12P 21/02(2006.01) C12R 1/89(2006.01) C12R 1/19(2006.01) (73)专利权人 中国科学院海洋研究所 地址 266071 山东省青岛市市南区南海路 7 号 (72)发明人 秦松 陈华新 刘少芳 (74)专利代理机构 沈阳科苑专利商标代理有限 公司 21002 代理人 俞。

2、鲁江 CN 101121931 A,2008.02.13, 全文 . CN 101121932 A,2008.02.13, 全文 . CN 101144077 A,2008.03.19, 全文 . US 2003027285 A1,2003.02.06, 全文 . 关翔宇， 秦松等 . 光学活性藻蓝蛋白 亚基 的体内重组 .中国海洋大学学报 .2008, 第 38 卷 ( 第 4 期 ), 第 605-608 页 . 林凡， 秦松 . 乳糖诱导重组别藻蓝蛋白基因 在大肠杆菌中的表达 .海洋科学 .2005, 第 29 卷 ( 第 11 期 ), 第 22-27 页 . 唐志红， 秦松等 . 乳。

3、糖诱导重组别藻蓝蛋白 (rAPC) 在大肠杆菌 (Escherichia coli) 中的表 达 . 海洋与湖沼 .2006, 第 37 卷 ( 第 6 期 ), 第 524-528 页 . X.Y. Guan， S. Qin 等 .A potent anti-oxidant property: fluorescent recombinant -phycocyanin of Spirulina. Journal of Applied Microbiology .2009, 第 106 卷 ( 第 4 期 ), 第 1093-1100 页 . 朱红裕， 李强 . 外源蛋白在大肠杆菌中的可 溶性表。

4、达策略 .过程工程学报 .2006, 第 6 卷 ( 第 1 期 ), 第 150-155 页 . Yu Yang， Song Qin 等 .Combinational biosynthesis of a fluorescent cyanobacterial holo-allophycocyanin in Escherichia coli.Biotechnology Letter .2008, 第 30 卷 ( 第 6 期 ), 第 1001-1004 页 . Guan X， Qin S 等 .Combinational biosynthesis of a fluorescent cyanob。

5、acterial holo-alpha-phycocyanin in Escherichia coli by using one expression vector.Appllied Biochemistry and Biotechnology .2007, 第 142 卷 ( 第 1 期 ), 第 52-59 页 . 于平， 秦松等 . 极大螺旋藻 (Spirulina maxima) 藻蓝蛋白基因的克隆及其同源性分 析 .科技通报 .2003, 第 19 卷 ( 第 6 期 ), 第 457-460 页 . (54) 发明名称 一种高稳定性藻蓝蛋白类融合荧光蛋白质的 制备方法 (57) 摘。

6、要 本发明公开一种高稳定性藻蓝蛋白类融合 荧光蛋白质的制备方法， 属于分子生物学技术领 域。包括以下步骤 ： 1) 将藻蓝蛋白脱辅基蛋白基 因和麦芽糖结合蛋白融合， 并与色基裂合酶基因 (cpcE和cpcF)克隆到表达载体的第一个表达框， 藻胆素生物合成酶基因 (hoxl 和 pcyA) 克隆到同 一载体的第二个表达框， 得到一个含有多个相关 基因的表达质粒 ； 2) 将上述表达质粒转化大肠杆 菌后， 筛选得到高产菌， 应用此工程菌发酵， 经蛋 白的分离纯化， 得到荧光类融合藻蓝蛋白。 本发明 有以下优点 ： 1. 提高了重组荧光蛋白的水溶性和 稳定性 ； 2. 缩短生产周期， 节约能源， 利。

7、用率高。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 郭磊 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 8 页 附图 3 页 CN 101838661 B1/1 页 2 1. 一种荧光类融合藻蓝蛋白的生物合成方法， 其特征包括以下步骤 ： 1) 将藻蓝蛋白脱辅基蛋白基因和麦芽糖结合蛋白融合， 并与色基裂合酶基因 cpcE 和 cpcF 克隆到表达载体的第一个表达框， 藻胆素生物合成酶基因 hox1 和 pcyA 克隆到同一载 体的第二个表达框， 得到一个含有多个相关基因的表达质粒 ； 2) 将上述表达质粒转化大肠杆菌后， 筛选得到高产菌， 应用此工。

8、程菌发酵， 经蛋白的分 离纯化， 得到荧光类融合藻蓝蛋白 ； 所述工程菌发酵为 ： 将筛选得到菌种于液体 LB 培养基中， 以 37震荡培养 12 小时， 再 以体积比 5的接种量转入发酵罐中发酵培养， 诱导前培养温度设为 37， 转速随发酵时 间由 300-500rpm 递增 ； 发酵开始 4h 后， 菌体生长至对数期， 以 0.08g/(L min) 速率进行补 料葡萄糖 ； 发酵 7h 时将罐内温度缓慢降至 25， 然后加入诱导剂 IPTG 至终浓度 1mmol/L， 降低转速至 150rpm， 诱导培养 10h。 2. 按照权利要求 1 的方法， 其特征在于 ： 所述藻蓝蛋白脱辅基蛋白。

9、基因是指 Synechocystis PCC6803。 权 利 要 求 书 CN 101838661 B1/8 页 3 一种高稳定性藻蓝蛋白类融合荧光蛋白质的制备方法 技术领域 0001 本发明属于生物技术中荧光蛋白质材料领域， 具体涉及一种高稳定性藻蓝蛋白类 融合荧光蛋白质的制备方法。 0002 技术背景 0003 藻胆蛋白主要存在于原核的蓝藻、 真核的红藻、 隐藻和甲藻 (Pyrrophyta) 中。 根据吸收光谱的不同， 可将藻胆蛋白分为 4 大类 ： 即藻红蛋白 (phycoerythrin， PE)， 藻红蓝蛋白 (phycoerythrocyanin， PEC)， 藻蓝蛋白 (ph。

10、ycocyanin， PC) 和别藻蓝蛋白 (allophycocyanin， APC)。藻胆蛋白脱辅基蛋白含有 和 亚基。藻胆蛋白中的色基称 为藻胆素(phycobilin)， 藻胆素的A或D环， 或A、 D两环同时与脱辅基蛋白的半胱氨酸残基 通过硫醚键共价连接。藻胆素与脱辅基蛋白共价结合形成特定的构象， 使得不同种类的藻 胆蛋白呈现不同的光学特性。藻红蛋白主要吸收约 560nm 的可见光， 发射光约 580nm 的荧 光 ； 藻红蓝蛋白吸收约 570nm 的可见光， 发射光约 630nm 的荧光 ； 藻蓝蛋白吸收约 620nm 的 可见光， 发射光约640nm的荧光 ； 别藻蓝蛋白吸收约6。

11、50660nm的可见光， 发射光约660 670nm 的荧光。 0004 藻胆蛋白具有提高人体免疫力， 促进动物细胞再生的功能 ； 可以抑制癌细胞生长， 减轻肿瘤化疗的副作用 ； 同时也是一种无毒副作用的理想的光敏剂 ； 藻胆蛋白作为一种天 然色素， 也可以应用于食品和化妆品中。 由于有强烈的荧光特性， 藻胆蛋白还可以制备成荧 光探针， 在免疫学、 细胞生物学和分子生物学研究中有着广泛的应用。 0005 目前使用的藻胆蛋白类荧光蛋白质主要从蓝藻和红藻中提取 ( 高纯度藻胆蛋 白的分离方法， CN1344723， 2002.04.17 ； 一种水华蓝藻制备藻蓝蛋白的方法， CN1563083， 。

12、2005.01.12) ； 由于天然的蓝藻和红藻亚基存在着单聚体、 三聚体和六聚体等多种形 式， 不利于对其功能的研究和利用。专利 “一种制备别藻蓝蛋白荧光蛋白质的方法， 200710029673.X， 2007.8.9， 提供了一种利用基因工程方法生产重组藻蓝蛋白的方法， 得到 的荧光类蛋白质具有结构单一的特点， 但是利用此种方法表达的重组荧光类藻蓝蛋白， 易 形成大量包涵体， 得率低 ； 更重要的是得到的重组荧光类藻蓝蛋白水溶性和稳定 性差， 不 利于进一步的开发研究。 发明内容 0006 为了解决上述不足， 本发明通过脱辅基藻蓝蛋白和麦芽糖结合蛋白的融合， 提高 了重组蛋白的稳定性和水溶。

13、性。 0007 所采用技术路线为 ： 0008 1) 将藻蓝蛋白脱辅基蛋白基因和麦芽糖结合蛋白融合， 并与色基裂合酶基因 (cpcE和cpcF)克隆到表达载体的第一个表达框， 藻胆素生物合成酶基因(hox1和pcyA)克 隆到同一载体的第二个表达框， 得到一个含有多个相关基因的表达质粒 ； 0009 2) 将上述表达质粒转化大肠杆菌后， 筛选得到高产菌， 应用此工程菌发酵， 经蛋白 的分离纯化， 得到荧光类融合藻蓝蛋白 ； 说 明 书 CN 101838661 B2/8 页 4 0010 所述藻蓝蛋白脱辅基蛋白基因是指Synechocystis PCC6803或与其同源的基因。 0011 本发。

14、明与现有技术相比， 具有以下优点 ： 0012 1. 通过脱辅基藻蓝蛋白和麦芽糖结合蛋白的融合， 提高了重组荧光蛋白的水溶性 和稳定性 ； 在大肠杆菌中表达时包涵体少， 目的蛋白表达量高， 有利于纯化， 目的蛋白得率 高。 0013 2. 不使用藻类为原料而是利用大肠杆菌生产新型重组光活性蛋白， 大肠杆菌易于 培养， 生长快， 可以大大缩短生产周期 ； 与藻类相比， 大肠杆菌细胞壁易于破碎， 纯化过程可 以节约能源， 利用率高。 0014 3. 只使用一种抗生素的选择压力， 菌种较稳定。得到的重组蛋白含有 His-tag 标 记， 体系中没有类似蛋白， 通过离子螯合色谱一步纯化便可获得目的蛋白。

15、， 且纯度较高。 0015 4. 本发明简化了质粒构建过程， 构建单一质粒， 菌种较稳定， 可以规模化发酵生产 一种新型重组光活性蛋白， 最大吸收波长为 621nm， 最大激发光波长 650nm， 具有优良的荧 光性质用于新型荧光探针领域 ； 具有生物学活性， 主要体现在抗氧化方面， 为藻胆蛋白类色 素蛋白质功能材料应用于食品、 化妆品、 医药和生物工程领域提供了一种简单有效的新方 法。 附图说明 0016 图 1 重组质粒的构建示意图 0017 图 2 重组蛋白的表达 SDS-PAGE 和锌电泳 0018 图 3 重组蛋白纯化的 SDS-PAGE 和锌电泳 0019 图 4 重组蛋白溶解性比。

16、较 SDS-PAGE 电泳图 0020 图 5 重组蛋白和天然藻蓝蛋白的吸收光谱 0021 图 6 重组蛋白和天然藻蓝蛋白的激发光谱 具体实施方式 ： 0022 下面通过实施例具体说明本发明 ： 0023 a. 基因的克隆 0024 从美国国立生物信息中心 (National Center for BiotechnologyInformation， NCBI)数据库(http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/)获取Synechocystis sp.PCC6803的cpcA、 cpcE、 cpcF、 ho1、 pcyA基因的序列， 序列长分别为0.49kb、 0.88kb、 0.62。

17、kb、 0.72kb和0.75kb 由此设计引物， 所用的引物和反应条件如表1， 以Synechocystis sp.PCC6803基因组DNA为 模板， PCR 克隆对应的基因。 0025 b. 重组质粒的构建 0026 将 Synechocystis sp.PCC6803 中脱辅基藻蓝蛋白 cpcA 基因克隆于 Novagen 公司 的 pCDFDuet 载体中， 基因插入载体的步骤为 ： 把上一步经过 PCR 扩增得到的 cpcA 基因片 段进行电泳 (120V， 40 分钟 )， 回收 cpcA 的 PCR 产物片段 ； 所得片段用设计的限制性内切酶 BamH I 和 Sac I 进行。

18、双酶切， 同时把载体 pCDFDuet 用同样的限制性内切酶进行酶切， 分别 回收酶切后cpcAPCR产物片段和酶切后的载体pCDFDuet ； 酶切后的cpcA PCR产物片段和酶 切后的载体 pCDFDuet 按 3l 1l 混合， 在 T4 连接酶作用下连接一定时间 (16下 16 说 明 书 CN 101838661 B3/8 页 5 小时)， 即得到质粒pCDFDuet-cpcA ； 把质粒pCDFDuet-cpcA转化进入大肠杆菌， 利用含有抗 生素的平板筛选出圆形单菌落， 挑取单克隆， SDS-PAGE 电泳和测序验证。 0027 将克隆的色基裂合酶 (cpcE 和 cpcF) 。

19、按上述程序依次连接于 pCDFDuet-cpcA 载体 的第一个表达框中， 并将麦芽糖结合蛋白基因 (mbp) 连接于 cpcA 基因的 5 - 端 ； 将藻胆 素生物合成酶基因 (hox1 和 pcyA) 依次连接于 pCDFDuet-cpcA-cpcE-cpcF 载体的第二个表 达框中， 所得质粒叫做 pCDF-mbp-cpcA-cpcE-cpcF， ho1-pcyA， 如图 1 所示。 0028 c. 重组质粒的转化与重组菌的筛选 0029 将质粒 pCDF-mbp-cpcA-cpcE-cpcF， ho1-pcyA 转化大肠杆菌 BL21， 质粒转化入大 肠杆菌的转化方式如下 ： 从新鲜。

20、涂布的平板上挑取大肠杆菌菌株 BL21 的单菌落， 接种于 5ml LB 液体培养基， 37震荡培养过夜 ； 取 100l 饱和培养物， 无菌转接至 5ml LB 液体 培养基， 37震荡培养至 OD600为 0.6 左右， 冰上放置 10min ； ， 离心 5min(5000g， 4 ) 弃去 上清， 收集沉淀菌体 ； 用 1ml1mol/L CaCl2无菌溶液重悬菌体， 离心 30s(10000g， 4 ) 弃去 上清， 菌体沉淀用 100l 预冷的 0.1mol/L CaCl2重悬， 加入步骤 2) 所得质粒， 混匀后冰浴 30min， 42热激 90s， 冰浴 5min 后加入 40。

21、0l LB 液体培养基， 37低速震荡培养 1h， 转速 梯度增加至正常， 涂布菌液在含有相应抗生素的 LB 固体平板上， 倒置于 37培养箱至形成 可见的单克隆菌斑。挑取单克隆， 经测序验证即得到大肠杆菌工程菌。 0030 挑取 20 个菌落， 分别接种于 5ml 含有相应抗生素的 LB 液体培养基中， 震荡培养 至饱和 ； 分别从中取出 100l 转接至 5ml 含有相应抗生素的液体培养基中 ； 37震荡培养 至 OD600为 0.8-1.0， 加入 IPTG 诱导表达， 避光 28 120 转 / 分， 表达 8-10 小时。离心收集 细胞， 细胞加入缓冲液重悬 ； 通过光谱仪测定荧光量。

22、 ( 参见图 5)， 选取荧光量较高的菌株保 种。 0031 d. 重组菌的 5L 规模发酵 0032 5L 发酵罐表达别藻蛋白类新型重组光活性蛋白的程序如下 ： 取保存的菌种 100l 无菌接种于 5ml 液体 LB 培养基， 37震荡培养 12 小时， 然后转接于含 200ml 液体 LB 培养基的三角瓶， 37震荡培养 6 小时。工程菌的发酵在 5L 自动发酵罐中进行， 体积比 5的接种量， 诱导前培养温度设为37， 转速随发酵时间由300-500rpm递增， pH均自动控 制 ； 发酵开始 4h 后， 菌体生长至对数期， 原培养基中的碳源接近耗尽时， 以 0.08g/(Lmin) 葡萄。

23、糖的速率进行补料。发酵开始约 7h 时， 先将罐内温度缓慢降至 25， 然后加入诱导剂 IPTG 至终浓度 1mmol/L， 降低转速至 150rpm， 诱导培养 10h 以上。 0033 e. 重组蛋白的分离纯化 0034 按照每升结合缓冲液(20mmol/L磷酸钠， 0.5mol/L氯化钠， 20mmol/L咪唑， pH7.4) 加入湿菌体 50g 的比例将菌体重悬， 超声破碎细胞 30min， 12000rpm， 4条件下离心， 收集 上清液， 上样于 Ni2+亲和色谱柱， 用 5 倍柱体积的结合缓冲液冲洗色谱柱后， 用洗脱缓冲液 (20mmol/L 磷酸钠， 0.5mol/L 氯化钠，。

24、 500mmol/L 咪唑， pH 7.4) 洗脱， 洗脱液经 G-25 脱盐柱 脱盐后即得到目的蛋白。 0035 表 1 0036 说 明 书 CN 101838661 B4/8 页 6 0037 重组蛋白的表达形式分析 0038 图 2 为重组蛋白的表达 SDS-PAGE 和锌电泳 ； 0039 图 3 为重组蛋白纯化的 SDS-PAGE 和锌电泳 ； 0040 如图 4 所示， 重组蛋白菌体加入适量破碎缓冲液， 经超声波破碎后， 取 50l 破碎 液加入等体积2SDS-PAGE上样缓冲液， 煮沸10min， 离心后取上清为总蛋白(T) ； 另取破碎 液离心， 取上清加入等体积 2SDS-。

25、PAGE 上样缓冲液， 煮沸 10min， 离心后取上清为可溶性 蛋白 (S)。每样上样 15l。电泳采用 12分离胶。箭头所示为目的蛋白条带。M 为蛋白 Marker， 左边数字为蛋白分子量。T 为总蛋白条带 ； M 为可溶性蛋白条带。总蛋白与可溶性 说 明 书 CN 101838661 B5/8 页 7 蛋白亮度基本一致(图4)， 证明重组蛋白是以可溶性蛋白形式表达， 而非包涵体形式表达。 0041 重组蛋白与天然藻蓝蛋白的光谱学性质比较 0042 如图5所示， 重组蛋白(a)与天然藻蓝蛋白(b)在500-800nm波长的吸收图谱。 两 者的最大吸收波长一致， 为 623nm。 0043 。

26、如图 6 所示， 重组蛋白 (a) 与天然藻蓝蛋白 (b) 在 400-800nm 波长的荧光发射图 谱， 激发波长为 620nm。两者的最大发射波长一致， 为 650nm。 0044 如图 5 和 6 所示， 光谱学试验结果表明， 重组蛋白与天然蛋白有相似的光谱学特 征。 0045 序列表 0046 SEQUENCE LISTING 0047 中国科学院海洋研究所 0048 一种高稳定性藻蓝蛋白类融合荧光蛋白质的制备方法 0049 0050 200910019914.1 0051 2009-03-14 0052 12 0053 PatentIn version 3.1 0054 1 0055。

27、 29 0056 DNA 0057 人工合成 0058 0059 gene 0060 (1).(29) 0061 0062 1 0063 tgtgtggatc cgatgaaaac ccccctaac 29 0064 2 0065 29 0066 DNA 0067 人工合成 0068 0069 gene 0070 (1).(29) 0071 0072 2 0073 acaaggagct caactagctt agggcgttg 29 0074 3 0075 45 说 明 书 CN 101838661 B6/8 页 8 0076 DNA 0077 人工合成 0078 0079 gene 0080。

28、 (1).(45) 0081 0082 3 0083 gtagagctca aggagatata ccatgcagga ttctgaatca aaaac 45 0084 4 0085 32 0086 DNA 0087 人工合成 0088 0089 gene 0090 (1).(32) 0091 0092 4 0093 agcgtcgacg ttcataatag agaatccatc ag 32 0094 5 0095 50 0096 DNA 0097 人工合成 0098 0099 gene 0100 (1).(50) 0101 0102 5 0103 cgcgtcgaca aggagatata。

29、 ccatgacaaa ggttgaggaa ctaattttag 50 0104 6 0105 37 0106 DNA 0107 人工合成 0108 0109 gene 0110 (1).(37) 0111 0112 6 0113 aataagcttg cggccgctca tcctagccag actagcc 37 0114 7 说 明 书 CN 101838661 B7/8 页 9 0115 29 0116 DNA 0117 人工合成 0118 0119 gene 0120 (1).(29) 0121 0122 7 0123 tgcatatgag tgtcaactta gcttcccag。

30、 29 0124 8 0125 29 0126 DNA 0127 人工合成 0128 0129 gene 0130 (1).(29) 0131 0132 8 0133 ttgatatcct agccttcgga ggtggcgag 29 0134 9 0135 51 0136 DNA 0137 人工合成 0138 0139 gene 0140 (1).(51) 0141 0142 9 0143 ttgatatcaa taaggagata tcacatggcc gtcactgatt taagtttgac c 51 0144 10 0145 32 0146 DNA 0147 人工合成 0148 0。

31、149 gene 0150 (1).(32) 0151 0152 10 0153 tgctcgagtt attggataac atcaaataag ac 32 说 明 书 CN 101838661 B8/8 页 10 0154 11 0155 32 0156 DNA 0157 人工合成 0158 0159 gene 0160 (1).(32) 0161 0162 11 0163 gcaggatccg atgaaaatcg aagaaggtaa ac 32 0164 12 0165 26 0166 DNA 0167 人工合成 0168 0169 gene 0170 (1).(26) 0171 0172 12 0173 attggatcct cgatcccgag gttgtt 26 说 明 书 CN 101838661 B1/3 页 11 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 101838661 B2/3 页 12 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 101838661 B3/3 页 13 图 5 图 6 说 明 书 附 图 。