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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201810643550.3 (22)申请日 2018.06.21 (71)申请人 南京市妇幼保健院 地址 210004 江苏省南京市莫愁路天妃巷 123号 (72)发明人 周雪黄骁昊唐冉冉 (74)专利代理机构 北京华际知识产权代理有限 公司 11676 代理人 李浩 (51)Int.Cl. C12Q 1/6886(2018.01) C12Q 1/6883(2018.01) (54)发明名称 滋养细胞侵袭力异常的生物标志物及其应 用 (57)摘要 本发明涉及滋养细胞侵袭力异常的。
2、生物标 志物及其应用， 证实miR-181b普遍差异表达于滋 养细胞侵袭力异常的妊娠相关疾病组织中， S1PR1是miR-181b的直接效应靶基因， 通过miR- 181b-S1PR1通路影响滋养细胞侵袭能力的分子 机制的发现， 为由滋养细胞侵袭异常引发的妊娠 相关疾病的防治提供了新线索和潜在的干预靶 标。 权利要求书1页 说明书5页 附图4页 CN 108949973 A 2018.12.07 CN 108949973 A 1.一种miRNA标志物在制备滋养细胞侵袭力异常相关疾病的诊断试剂中的应用， 其特 征在于该标志物为miR-181b。 2.用于测量miR-181b的表达水平的试剂在制造。
3、用于预测对象发生滋养细胞侵袭力异 常相关疾病的可能性的试剂盒中的应用， 其中如果miR-181b的表达水平相对于正常对照显 著升高或者降低， 那么认为所述对象发生滋养细胞侵袭力异常相关疾病的可能性增加。 3.根据权利要求1或2所述的应用， 所述疾病选自自然流产、 子痫前期、 绒癌。 4.一种滋养细胞侵袭力异常相关疾病的诊断试剂盒， 其特征在于该试剂盒含有检测 miR-181b的试剂。 5.根据权利要求4所述的试剂盒， 所述疾病选自自然流产、 子痫前期、 绒癌。 6.miR-181b在制备调节S1PR1表达水平的试剂中的应用， 其中使miR-181b过表达的试 剂导致S1PR1的表达水平下降， 。
4、使miR-181b低表达的试剂导致S1PR1的表达水平上升。 7.根据权利要求6所述的应用， 所述试剂被用于改变滋养细胞侵袭力。 8.根据权利要求6或7所述的应用， 所述试剂被用于治疗滋养细胞侵袭力异常相关疾 病。 9.根据权利要求8所述的应用， 所述疾病选自自然流产、 子痫前期、 绒癌。 权利要求书 1/1 页 2 CN 108949973 A 2 滋养细胞侵袭力异常的生物标志物及其应用 技术领域 0001 本发明涉及滋养细胞侵袭力异常的生物标志物及其机理研究， 尤其涉及miR-181b 及其下游靶基因S1PR1在作为滋养细胞侵袭力异常标志物的应用。 背景技术 0002 滋养细胞的侵袭是胚胎。
5、着床和胎盘形成必不可少的过程， 这种侵袭和肿瘤细胞的 侵袭转移惊人的相似， 但不同于肿瘤细胞的是， 滋养细胞的侵袭受到精细的调控， 具有严格 的时空限制。 滋养细胞的侵袭力适中， 是生理妊娠建立、 维持和适时终止的成败关键， 而侵 袭力失衡则会引发多种妊娠相关疾病， 并涉及孕期的各个阶段： 侵袭力过弱可导致不孕、 流 产、 早产、 胎儿生长受限、 子痫前期等病理妊娠； 过强又会发生胎盘植入和滋养细胞肿瘤 (如： 绒癌)等,这些疾病均是威胁母儿生命安危的罪魁祸首之一。 据统计， 孕早期自然流产 的发生率高达2-4； 到中晚孕阶段， 早产9.6、 胎儿生长受限5-10、 子痫前期3-5 等的发生率。
6、都呈现逐年上升态势。 因此， 从滋养细胞侵袭角度， 寻找妊娠相关疾病有效的防 治措施刻不容缓。 0003 已发现， 滋养细胞侵袭力不仅与氧化应激、 低氧、 激素等因素相关， 且受S1PR1、 CsA、 CXCL3等基因及MEK、 ERK、 Wnt等信号通路的调控作用。 随着对调控信息研究的深入， 一 类长度仅22个碱基、 在转录后水平负向调控基因表达的小RNA(microRNA又称miRNA)进入研 究者的视野。 随着miRNA功能认知的增加， 其在妊娠相关疾病中的作用与机制也逐渐被揭 示。 研究发现： miR-210通过调控Ephrin-A3a、 Homeobox-A9表达抑制滋养细胞的迁移。
7、和侵 袭； miR-29b下调MCL1、 MMP2、 VEGFA、 ITGB1表达， 影响滋养细胞的侵袭、 凋亡和血管生成； miR-195低表达于子痫前期患者胎盘组织， 并可以影响ActRIIA表达降低滋养细胞侵袭力。 0004 然而纵观现有的研究， 均是从单一疾病(如： 子痫前期、 胎儿生长受限等)出发评估 miRNA与滋养细胞侵袭力的相关性， 缺乏对该类妊娠相关疾病的全面分析。 如果能集合多种 滋养细胞侵袭力异常的疾病， 全面筛选与其相关的miRNA， 不仅可以增加对胚胎着床、 胎盘 形成的了解， 还可为自然流产、 子痫前期、 胎儿生长受限及绒癌等疾病的防治提供新的靶 标， 故成为我们研。
8、究的方向。 发明内容 0005 本发明提供了一种miRNA标志物在制备滋养细胞侵袭力异常相关疾病的诊断试剂 中的应用， 其特征在于该标志物为miR-181b。 0006 本发明还提供了用于测量miR-181a的表达水平的试剂在制造用于预测对象发生 滋养细胞侵袭力异常相关疾病的可能性的试剂盒中的应用， 其中如果miR-181a的表达水平 相对于正常对照显著升高或者降低， 那么认为所述对象发生滋养细胞侵袭力异常相关疾病 的可能性增加。 0007 进一步， 本发明提供一种滋养细胞侵袭力异常相关疾病的诊断试剂盒， 其特征在 于该试剂盒含有检测miR-181b的试剂。 说明书 1/5 页 3 CN 10。
9、8949973 A 3 0008 优选地， 所述疾病选自自然流产、 子痫前期、 绒癌。 0009 此外， 本发明发现miR-181b在制备调节S1PR1表达水平的试剂中的应用， 其中使 miR-181b过表达的试剂导致S1PR1的表达水平下降， 使miR-181b低表达的试剂导致S1PR1的 表达水平上升。 0010 进一步地， 所述试剂被用于改变滋养细胞侵袭力。 0011 更进一步地， 所述试剂被用于治疗滋养细胞侵袭力异常相关疾病。 0012 优选地， 所述疾病选自自然流产、 子痫前期、 胎儿生长受限及绒癌。 0013 本发明具有以下积极效果： 0014 1.miRNA是一种新型生物标志物，。
10、 不仅稳定、 微创、 易于检测， 且定量精确， 将大大 提高滋养层细胞侵袭力异常诊断的敏感性和特异性， 该类小分子RNA生物标志物的成功开 发是对以蛋白为主的传统生物标志物的颠覆， 将为妊娠相关疾病的防治开创全新局面。 0015 2.本发明提供的miRNA标志物miR-181b可用作准确诊断滋养细胞侵袭力异常相关 疾病的诊断标志物， 可避免侵入性诊断， 并可在早期进行辅助诊断， 从而为临床医生进一步 深入检查提供依据， 为快速准确掌握患者的疾病状态和病情严重程度、 及时采取更具个性 化的防治方案提供支持， 延缓和阻止疾病进展。 0016 3.除了诊断外， 本发明证实了对于miR-181b的过表。
11、达或者沉默可改变滋养细胞侵 袭力， 为妊娠相关疾病的治疗提供了新的治疗策略。 0017 4.本发明进一步证实了miR-181b对于S1PR1的调节效应， 为进一步深入研究滋养 细胞侵袭力的相关分子机制和信号通路提供了思路。 附图说明 0018 图1为miR-181b随滋养细胞侵袭力改变的表达变化规律。 其中a:miR-181b和miR- 181a、 miR-181d在绒癌组织中的表达， (*P0.05vs NP， *P0.05vs NP)； b:miR-181b在侵袭力不同的滋养细胞株中的表达， (#P0.05vs JAR)。 0019 图2为上调JEG-3和HTR-8/Svneo细胞中miR。
12、-181b表达， 细胞的侵袭力改变情况。 a: transwell试验提示细胞侵袭能力改变； b:侵袭指数， (*P0.05vs Scramble)； c:明胶酶谱 实验示侵袭相关蛋白MMP-2/MMP-9活性改变。 0020 图3为miR-181b靶基因生物信息学预测。 a:软件预测miR-181b可能的靶基因； b: S1PR1基因的生物信息学特点。 0021 图4为S1PR1等3个预测靶标在过表达miR-181b滋养细胞上的表达情况。 a:S1PR1在 过表达miR-181b的JEG-3、 HTR-8/Svneo细胞株上的表达， (*P0.05vs Scramble)； b:CXCL3 。
13、在过表达miR-181b的JEG-3、 HTR-8/Svneo细胞株上的表达； c:PPP3R1在过表达miR-181b的 JEG-3、 HTR-8/Svneo细胞株上的表达。 0022 图5为S1PR1随滋养细胞侵袭力改变的表达变化规律。 (*P0.05vs NP； *P5倍) 的miRNAs进行定量PCR验证。 10条miRNAs定量结果显示， 其差异趋势与芯片数据趋势基本一 致。 在这10条miRNAs中， miR-181b吸引了我们的注意。 miR-181b组间差异分别高达9.4(胎 盘)和8.7(绒毛)倍。 进一步以Real time PCR技术验证， 结果与芯片相符。 图中： NP。
14、为正常胎 盘， PE为子痫前期胎盘， NV为正常绒毛， SA为自然流产绒毛。 众所周知， miR-181家族是一个 进化中极其保守的明星分子， 在多种疾病尤其在恶性肿瘤的发生、 发展及其临床诊疗方面 扮演着重要的角色； 已有大量研究证实miR-181家族与肿瘤细胞的迁移侵袭密切相关。 miR- 181b在滋养细胞侵袭力不足疾病组织中的特异性高表达， 提示其对滋养细胞侵袭力可能也 具有类似的功能。 0027 实施例2： miR-181b在不同滋养细胞侵袭异常相关疾病中的表达 0028 为了进一步评估这三者与滋养细胞侵袭力的相关性， 我们在滋养细胞侵袭过强的 绒癌标本上对其进行了验证。 0029 。
15、收集50例自然流产绒毛组织(滋养细胞侵袭力不足)， 以正常绒毛组织(滋养细胞 侵袭力正常)作为对照； 同时收集50例子痫前期胎盘组织(滋养细胞侵袭力不足)、 50例绒癌 组织标本(滋养细胞侵袭力过度)， 以正常胎盘组织(滋养细胞侵袭力正常)作为对照。 采用 Real time PCR或Western Blot技术检测胎盘、 绒毛和绒癌组织标本中miR-181b的表达， 评 价与滋养细胞侵袭力之间的关系。 0030 其中， 子痫前期的诊断参照乐杰主编的 妇产科学 (第7版)中的标准： 妊娠20周 以后， 血压140/90mmHg， 间隔6小时， 并有尿蛋白， 尿蛋白300mg/24小时或随意尿 。
16、30mg/dL， 间隔4小时再测一次。 本研究中的子痫前期组和正常妊娠组均为单胎初产妇， 择期 剖宫产分娩， 无吸烟及孕期大量药物服用史， 无孕期感染史及内科疾病。 0031 绒癌确诊主要依据参照乐杰主编的 妇产科学 (第7版)中的组织学诊断： 在子 宫肌层或子宫外转移灶见成片滋养细胞侵润及坏死出血。 本研究中涉及的绒癌病人均未接 受输血、 免疫治疗。 0032 自然流产是指未使用人工方法， 因某种原因胚胎或胎儿自动脱离而排出的现 象。 本研究中所采集的绒毛组织均来自孕早期(妊娠12周前)初次流产的病人， 孕期均无吸 烟及大量药物服用史， 无孕期感染史及内科疾病， 孕酮及免疫相关指标正常， 并。
17、经染色体核 型分析法排除染色体异常(我院产前诊断中心常规开展此项工作)。 0033 结果发现在滋养细胞侵袭过强的绒癌标本上， miR-181a、 miR-181d无显著差异， 而 miR-181b呈现特异性低表达(见图1a)。 在此基础上， 我们又检测了miR-181b在JAR绒癌滋养 细胞株(低侵袭力)、 JEG-3绒癌滋养细胞株(高侵袭力)和HTR-8/Svneo早孕绒毛滋养细胞株 说明书 3/5 页 5 CN 108949973 A 5 (高侵袭力)中的表达。 结果显示， miR-181b高表达于低侵袭性的JAR细胞， 而低表达于高侵 袭性的JEG-3和HTR-8/Svneo细胞(见图1。
18、b)。 以上结果和分析提示， miR-181b不但表达于滋 养细胞中， 而且还与多种妊娠相关疾病的滋养细胞侵袭力异常有关。 图中： NP为正常胎盘， CH为绒癌组织， JEG-3、 JAR为绒癌滋养细胞株， HTR为HTR-8/Svneo早孕绒毛滋养细胞株。 0034 实施例3： miR-181b对滋养细胞侵袭力的影响 0035 生物信息学分析发现， miR-181b在不同物种(人、 大鼠、 小鼠、 斑马鱼)间均高度保 守， 且同源性在95以上(参见表1)， 意味着其潜在功能的重要性。 但文献复习发现， 目前并 没有关于miR-181b与滋养细胞侵袭力研究的报道。 0036 表1 miR-18。
19、1b物种保守性分析 0037 0038 为了获得更多支持依据， 我们以两种高侵袭性JEG-3、 HTR-8/Svneo细胞为工具细 胞， 采取过表达和沉默的策略改变细胞中miR-181b的表达。 0039 1.miR-181b过表达对滋养细胞侵袭力的影响： 0040 构建miR-181b慢病毒表达载体， 空载慢病毒为对照， 包被成慢病毒颗粒， 分别感染 JEG-3和HTR-8/SVneo滋养细胞， MTT法排除转染毒性对细胞的影响； 采用Real time PCR技 术验证细胞内成熟miR-181b过表达。 主要评估： 滋养细胞侵袭力： Transwell法检测HTR-8/ SVneo细胞侵袭。
20、功能改变。 0041 2.miR-181b表达沉默对滋养细胞侵袭力的影响： 0042 构建miR-181b表达沉默的慢病毒载体， 空载慢病毒为对照， 包被成慢病毒颗粒， 分 别感染JEG-3和HTR-8/SVneo滋养细胞， MTT法排除转染毒性对细胞的影响； 采用Real time PCR技术评估细胞内miR-181b的沉默效率。 主要评估： 滋养细胞侵袭力： Transwell法检测 HTR-8/SVneo细胞侵袭功能改变。 0043 结果发现上调细胞miR-181b表达后， 两种细胞的侵袭能力均明显下降(图2a、 2b) 且侵袭相关蛋白MMP-2/MMP-9的活性亦下降(图2c)。 图中。
21、： Blank为空白对照组， Scramble为 阴性对照组， miR-181b为miR-181b mimics组， HTR为HTR-8/Svneo早孕绒毛滋养细胞株。 0044 实施例4： miR-181b的下游作用靶点的分析 0045 MiR-181b影响滋养细胞侵袭力的具体机制尚不明确， 为此， 我们首先借助生物信 息学分析的方法， 寻找其下游调控靶标。 软件分析显示： CXCL3、 S1PR1、 PPP3R1基因在3 UTR 说明书 4/5 页 6 CN 108949973 A 6 均含有与miR-181b结合的核心序列 “GAAUGU” (见图3a)， 且已有报道CXCL3、 S1P。
22、R1、 PPP3R1基 因均参与滋养细胞功能的调节。 因此我们选取这三个基因进行深入研究， 借助建立的miR- 181b过表达JEG-3、 HTR-8/Svneo细胞， 检测三者表达变化。 结果发现CXCL3、 PPP3R1并不受 miR-181b影响(见图4b、 4c)， 而S1PR1在两种细胞中表达均显著下降(见图4a)， 提示S1PR1可 能为miR-181b的直接作用靶点。 图4中： Blank为空白对照组， Scramble为阴性对照组， miR- 181b为miR-181b mimics组， JEG-3为绒癌滋养细胞株， HTR为HTR-8/Svneo早孕绒毛滋养细 胞株。 004。
23、6 更直接的实验验证， 通过UTR萤光素酶报告基因实验验证S1PR1是miR-181b的靶基 因： 通过构建miR-181b模拟物(mimics)、 含S1PR13 UTR的萤光素酶报告基因序列(野生型) 及参照序列(突变型)， 转染HEK293细胞和HTR-8/SVneo滋养细胞； 原位杂交法检测miR-181b 表达， 免疫组化法检测S1PR1的表达； 检测萤光素酶活性的变化来验证miR-181b对S1PR1表 达的调控作用。 结果表明： miR-181b的过表达导致S1PR1的表达降低。 0047 为进一步论证S1PR1与滋养细胞侵袭力关系， 探索S1PR1的组织表达规律， 我们检 测了。
24、其在子痫前期胎盘、 自然流产绒毛及绒癌组织中的表达。 发现S1PR1在侵袭力降低的组 织(子痫前期胎盘和自然流产绒毛)中下调(见图5)， 在侵袭力升高的组织(绒癌)中表达上 调(见图5)， 与miR-181b表达规律相反， 符合其调控方式。 图5中： NP为正常胎盘， PE为子痫前 期胎盘， CH为绒癌组织， SA为自然流产绒毛， NV为正常绒毛。 结合上述信息学分析和实验结 果， 我们初步判断S1PR1为miR-181b的下游作用靶点。 0048 为了进一步判断S1PR1作为miR-181b下游靶基因影响滋养细胞侵袭力的可能性， 我们又从生物信息和基因功能的角度进行了论证。 TargetSc。
25、an在线分析发现S1PR1与miR- 181b的结合序列 “GAAUGU” 在多个物种中均高度保守(见图3b)； 文献复习发现， S1PR1全称鞘 氨醇激酶受体(Sphingosine-1-phosphate receptor)， 可以通过与其配体S1P结合活化 MEK-ERK-MMP-2信号通路， 影响HepG2(肝癌细胞系)、 MCF10A(乳腺上皮细胞系)及滋养细胞 的迁移和侵袭。 至此， 我们认为已有充分理由认为S1PR1是miR-181b下游的靶基因。 0049 基于上述分析和实验结果， 我们提出 “miR-181b调控S1PR1表达， 影响滋养细胞侵 袭力， 参与妊娠相关疾病的发生。
26、” 。 0050 尽管本发明的实施方案已公开如上， 但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列 运用。 它完全可以被适用于各种适合本发明的领域。 对于熟悉本领域的人员而言， 可容易地 实现另外的修改。 因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下， 本发明并不限 于特定的细节和这里示出与描述的图例。 说明书 5/5 页 7 CN 108949973 A 7 图1 图2 说明书附图 1/4 页 8 CN 108949973 A 8 图3 说明书附图 2/4 页 9 CN 108949973 A 9 图4 说明书附图 3/4 页 10 CN 108949973 A 10 图5 说明书附图 4/4 页 11 CN 108949973 A 11 。