技术领域
本发明涉及含有聚对苯二甲酸乙二醇酯聚合物和至少一种其他成分的混合PET塑料制品、例如废塑料的再循环方法。更具体地，本发明涉及至少解聚这样的混合PET塑料制品的聚对苯二甲酸乙二醇酯聚合物并回收所生成的单体和/或低聚物的生物学方法，所述单体和/或低聚物可以进一步再加工以供合成新的聚合物和制造新的塑料制品。
背景技术
塑料是便宜而耐用的材料，其可用于制造用于范围广泛的应用的各种各样的产品，因此塑料的生产在过去的数十年间已经急剧增加。超过50％的这些塑料用于一次性使用的抛弃式应用，例如包装材料、农用薄膜、一次性消费品或用于在制造的一年内丢弃的短寿命产品。因为牵涉所述聚合物的耐久性，大量的塑料堆积在全世界的垃圾填埋场和天然栖息地，产生日益增加的环境问题。取决于当地的环境因素，如紫外线暴露水平、温度、合适的微生物的存在等等，即使可降解的和可生物降解的塑料都可以持续数十年。
近年来，由对苯二甲酸和乙二醇产生的芳族聚酯，聚对苯二甲酸乙二醇酯，更著名的是PET，已经广泛用于制造若干人类消费产品，包括制造包装食品和饮料，尤其是大小方便的软饮料、果汁和水，托盘或自立袋，和制造用于纺织品、织物、垫子或地毯的纤维，等等。
PET是世界上最为闭环再循环的塑料。一般而言，PET废物受到连续的处理，产生再循环的PET(rPET)。PET废物(主要是瓶子)被收集、分类、压包、压碎、洗涤、切成小碎片、熔融和挤塑成球粒并供销售。然后，再循环的PET可以用于建造制衣业的织物或新包装材料例如瓶子或泡罩包装，等等。这种方法适于只含有PET的纯塑料流。然而，这种方法不适用于含有不同于PET的其他组分的塑料产品。
还存在使PET塑料废物再循环的另一种方法，称为“化学再循环”，允许利用化学催化剂回收所述聚合物的成分。所生成的单体和/或低聚物然后可以用于再制造塑料或制造其他合成化学品。然而，到目前为止，这样的化学再循环只在纯化的聚合物上进行，对由聚合物和其他化合物和添加剂的混合物构成的复合塑料制品无效。
由于它重量低、强度高、透气性低和由于PET对人类健康没有有害效应的事实，PET被广泛用于制造由PET和其他组分、包括但不限于其他聚合物、金属粒子、玻璃粒子或纤维、木组分、碳纤维等构成的混合塑料制品。
例如，对于某些饮料包装材料例如啤酒瓶或苏打水而言，PET将聚乙烯醇(PVOH)层或聚酰胺层夹在中间以降低所述包装材料的透氧性。类似地，一些硬质食品包装材料，例如食品托盘含有聚乙烯(PE)层作为均由PET构成的托盘和盖之间的焊接剂。一些软质食品包装材料还含有由拉伸PET制造的聚酯膜，所述拉伸PET由金属薄膜金属化以降低渗透性并使它反光和不透明。用金属化PET制成的绝缘毯还在例如紧急情况下用于保持身体温暖。在不同的方式中，PET还被熔融或填充玻璃粒子或纤维，以变得更硬和更耐久并因此可以用于其他行业。类似地，最近已经开发了木塑复合材料，其中木材和PET被熔融并模塑成木材形式。因为木纤维充当增强材料，这些木材形式更刚性。因为塑料包封并结合了木，这些木材形式还更抗水分渗透和真菌腐烂降解，使得这种新的混合塑料表现出木和塑料二者的一些最佳性质。
然而，目前已经开发的机械或化学再循环方法不适于含有PET和其他成分的混合物的这些复合塑料制品种类，所述混合物在再循环之前不能容易地彼此分离。
因此，对于不需要初步分类和昂贵的预处理并且可以用于使不同的混合塑料制品中含有的PET再循环的混合塑料制品再循环方法，存在需求。
发明内容
本发明提出了使混合PET塑料再循环的生物学方法。更具体地，本发明显示了特殊的解聚酶可以用于有效解聚混合PET塑料制品而产生乙二醇和/或对苯二甲酸和/或低聚物和/或其衍生物的单体，包括对苯二甲酸甲基-2-羟乙酯(MHET)和/或对苯二甲酸双(2-羟乙基)酯(BHET)和/或苯甲酸2-羟乙酯(HEB)和/或对苯二甲酸二甲酯(DMT)和/或苯甲酸(BA)。本发明的方法允许回收形成混合PET塑料制品的聚合物的单体和/或低聚物，并将它们再加工以合成新的聚合物和制品。
在这方面，本发明的目的是提供使至少一种含有聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)和至少一种其他组分的混合塑料制品(以下称为“混合PET塑料制品”)再循环的方法，所述方法包括将所述混合PET塑料制品暴露于解聚酶和回收单体和/或低聚物。有利地，所述回收的单体和/或低聚物至少部分产生于所述PET聚合物解聚。
在具体的实施方式中，所述方法包括以下步骤：
-将所述混合PET塑料制品与解聚酶在适合于所述解聚酶的条件下接触一定时间，以至少解聚所述混合PET塑料制品的PET聚合物；
-回收所生成的单体和/或低聚物；和任选
-将所述回收的单体和/或低聚物再加工成一种或几种聚合物。
所述解聚酶可以是解聚PET的任何聚合酶，例如角质酶、脂肪酶或酯酶，优选角质酶。此外，根据具体实施方式，几种解聚酶可以一起或相继地组合使用。
在具体实施方式中，本发明的方法通过所述混合PET塑料制品与表达并分泌所述解聚酶的微生物接触来实施。根据本发明，所述微生物可以是表达并分泌重组解聚酶的重组微生物和/或具有防止消耗所生成的单体/低聚物的代谢改性的重组微生物。
有利地，构成所述混合PET塑料制品的其他组分选自聚合物如聚酯、聚酰胺、聚烯烃和乙烯基聚合物、金属化合物、无机化合物、纤维、纸、玻璃化合物、木、木化合物如木质素、纤维素或半纤维素、淀粉、及其衍生物。
本发明的另一个目的是允许所述混合PET塑料制品的至少两种不同的聚合物再循环，其中所述至少两种不同的聚合物被同时或相继降解。
本发明的方法的另一个目的是允许至少两种混合PET塑料制品同时或相继地再循环。
这些以及本发明的其他目的和实施方式在具体实施方式、包括概括给出的其优选实施方式之后，将变得更加显而易见。
具体实施方式
本发明涉及通过至少解聚含有PET聚合物的混合PET塑料制品的PET聚合物来使所述塑料制品再循环的完整再循环方法，其中产生可再聚合的单体和/或低聚物混合物并可以进一步回收。
定义
本公开将通过参考以下定义来更好地了解。
在本发明的环境内，术语“混合PET塑料制品”是指包含聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)和至少一种其他组分的任何物品或产品或材料(例如塑料板、管子、棒、异型材、型材(shape)、大块体、纤维等)。在本发明的环境中，混合PET塑料制品包括由聚对苯二甲酸乙二醇酯聚合物和其他组分以它们不能容易地分离这样的方式相对于彼此安排而构成的所有塑料制品种类。优选地，所述混合塑料制品是制造的产品如包装材料、农用薄膜、一次性物品等、地毯碎片、织物、纺织品等。此外，所述混合PET塑料制品的聚合物可以是结晶和/或半结晶的聚合物或者非晶聚合物或者结晶和/或半结晶和非晶聚合物的混合物。
“聚合物”是指其结构由多个重复单元通过共价化学键连接而构成的化合物或化合物的混合物。在本发明的环境内，术语聚合物包括由单一类型的重复单元构成(即均聚物)或不同重复单元的混合物构成(即共聚物)的天然或合成聚合物。合成聚合物包括源自于石油的聚合物，例如聚烯烃、脂族或芳族聚酯、聚酰胺、聚氨酯和聚氯乙烯。天然聚合物包括木质素和聚糖，例如纤维素、半纤维素、淀粉及其衍生物。
根据本发明，“低聚物”是指含有2至约20个单体单元的分子。有利地，用本发明的方法收回的低聚物包括对苯二甲酸甲基-2-羟乙酯(MHET)和/或对苯二甲酸双(2-羟乙基)酯(BHET)和/或苯甲酸2-羟乙酯(HEB)和/或对苯二甲酸二甲酯(DMT)。
“聚对苯二甲酸乙二醇酯”或“聚对苯二甲酸乙二醇酯聚合物”，也缩写为PET或PETE，可互换使用，并且是指从乙二醇(MEG)和对苯二甲酸二甲酯(DMT)或纯化的对苯二甲酸(PTA)的单体产生的聚酯家族的热塑性聚合物树脂。PET可以作为非晶聚合物和作为半结晶聚合物二者存在。在本发明的环境中，也包括PET的均聚物和共聚物。共聚物的实例是二醇改性的聚对苯二甲酸乙二醇酯(PETG)，其中环己烷二甲醇代替乙二醇加入所述聚合物骨架，或间苯二酸改性的聚对苯二甲酸乙二醇酯，其中间苯二酸代替了对苯二甲酸酯单元的一些连键，或双轴取向的PET(BOPET)、或取向的PET(OPET)，等等。
关于塑料制品的“再循环方法”或“完整再循环方法”是指降解所述塑料制品的至少一种聚合物以得到可再聚合的单体和/或低聚物的方法，所述可再聚合的单体和/或低聚物有利地被收回以便再利用。
在本说明书中，“重组微生物”是指其基因组已经通过插入至少一个核酸序列或单元而被修饰的微生物，所述至少一个核酸序列或单元相当于至少一个不同于现有微生物中天然存在的基因的核酸序列的基因或其部分。所述核酸序列或单元已经利用重组DNA技术装配和/或插入所述微生物或其祖先中，重组DNA技术(也称为基因克隆或分子克隆)是指将DNA从一个生物体转移到另一个生物体的技术。“重组微生物”还包括其基因组已经通过失活至少一个核酸序列或单元而被修饰的微生物。重组微生物可以通过本身在本领域中已知的各种方法而产生，并随后不再使用重组DNA技术在培养中维持或复制或扩增。另外，所述重组微生物可以从宏基因组文库发行。
关于酶的“突变体”是指其中至少一个氨基酸与野生型酶不同的酶。
术语“核酸”、“核酸序列”、“多核苷酸”、“寡核苷酸”和“核苷酸序列”可互换使用并且是指脱氧核糖核苷酸和/或核糖核苷酸的序列。所述核苷酸序列可以首先通过例如重组、酶和/或化学技术制备，并随后在宿主细胞或体外系统中复制。所述核苷酸序列优先包含编码(多)肽的开放阅读框。所述核苷酸序列可以含有其他序列例如转录终止子、信号肽、内含子、结合结构域等。
在本发明的环境内，关于酶或(多)肽的术语“源自于微生物”表明所述酶或(多)肽已经从这样的微生物中分离，或者所述酶或(多)肽包含从这样的微生物分离或鉴定的酶或(多)肽的所有或生物活性部分的氨基酸序列。
术语“载体”是指用作媒介以将重组遗传物质转移到宿主细胞中的DNA或RNA分子。所述载体的主要类型是质粒、噬菌体、病毒、粘粒和人工染色体。称为表达载体(表达构建物)的载体特别适合于在靶细胞中表达异源序列，并且一般具有驱动所述异源序列表达的启动子序列。一般而言，存在于表达载体中的调节元件包括转录启动子、核糖体结合位点、终止子和/或操纵子。优选地，表达载体还含有在宿主细胞中自主复制的复制起点、选择性标记、有限数量的可用限制酶位点、和/或对于高拷贝数的潜力。在不同的宿主中提供适当的多肽表达水平的表达载体是本领域公知的。本领域中公知的细菌表达载体包括pET11a(Novagen)，lamda gt11(Invitrogen)
表达载体可以利用标准技术引入宿主细胞中。这样的技术的实例包括转化、转染、脂质转染、原生质体融合和电穿孔。将核酸引入细胞中并表达所述核酸以产生蛋白质的技术的实例在参考文献中提供，例如Ausubel，《分子生物学现行方案》(Current Protocols in molecular biology)，John wiley，1987-1998，和Sambrook等，在《分子克隆，实验室手册第二版》(Molecular cloning，A laboratory Manual 2nd Edition)，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989中。
混合塑料制品
本发明公开了降解至少一种混合PET塑料制品以产生单体和/或低聚物的新方法，所述单体和/或低聚物可以再利用，例如用于生成聚合物和/或制造新物品。
本发明人已经开发了适合于降解混合PET塑料制品的再循环方法，无需将PET与其他组分初步分离。本发明的方法可以有利地应用于直接来自塑料废物收集和/或后工业废物的混合PET塑料制品。更具体地，本发明的方法可以应用在家庭塑料废物的混合物上，包括塑料瓶、塑料袋和塑料包装材料、软和/或硬塑料，甚至被食物残渣、表面活性剂等沾污的塑料废物。根据本发明，所述再循环方法也可以用于使含有100重量％的PET的塑料制品再循环，即使所述塑料制品混合有其他塑料制品，包括不含PET的塑料制品。
所述混合PET塑料制品中的PET含量可以从5重量％至小于100重量％不等，优选从10至95重量％。例如，在软质食品包装材料如小袋中，PET含量从14重量％至约65重量％，PET与PVC、OPS、LDPE、OPP、OPET、铝、PP等相结合。
在第一种实施方式中，PET含量占所述混合PET塑料制品总重量的小于50重量％。优选地，PET含量占从5至45重量％，更优选从10给40重量％，更加优选从10至35重量％。
在第二种实施方式中，PET含量占所述混合PET塑料制品总重量的多于50重量％。优选地，PET含量占从55至95重量％，更优选从65至95重量％，更加优选从75至95重量％。
根据本发明，所述混合PET塑料制品的其他组分优选选自聚合物例如聚酯(不同于PET)、聚酰胺、聚烯烃或乙烯基聚合物、金属化合物、玻璃化合物、纤维、纸、矿物质、木或木化合物例如木质素、纤维素或半纤维素、和淀粉及其衍生物。经典地，除了所述其他组分之外，所述混合PET塑料制品还可以含有其他物质或添加剂，例如增塑剂、无机或有机填料、去氧剂、相容剂、胶粘剂或墨水。
在具体实施方式中，所述混合塑料制品除了PET之外还包含另一种聚酯和/或至少一种聚酰胺和/或至少一种聚烯烃和/或至少一种乙烯基聚合物。
因此，所述混合PET塑料制品可以含有其他聚酯，优选选自聚对苯二甲酸丙二醇酯(PTT)、聚对苯二甲酸丁二醇酯(PBT)、聚对苯二甲酸乙二醇异山梨糖醇酯(PEIT)、聚乳酸(PLA)、聚(L-乳酸)(PLLA)、聚(D-乳酸)(PDLA)、聚(D,L-乳酸)(PDLLA)、PLA立构复合物(scPLA)、聚乙醇酸(PGA)、聚羟基链烷酸酯(PHA)、聚(3-羟基丁酸酯)(P(3HB)/PHB)、聚(3-羟基戊酸酯)(P(3HV)/PHV)、聚(3-羟基己酸酯)(P(3HHx))、聚(3-羟基辛酸酯)(P(3HO))、聚(3-羟基癸酸酯)(P(3HD))、聚(3-羟基丁酸酯-共聚-3-羟基戊酸酯)(P(3HB-co-3HV)/PHBV)、聚(3-羟基丁酸酯-共聚-3-羟基己酸酯)(P(3HB-co-3HHx)/(PHBHHx))、聚(3-羟基丁酸酯-共聚-5-羟基戊酸酯)(PHB5HV)、聚(3-羟基丁酸酯-共聚-3-羟基丙酸酯)(PHB3HP)、聚羟基丁酸酯-共聚-羟基癸酸酯(PHBO)、聚羟基丁酸酯-共聚-羟基十八酸酯(PHBOd)、聚(3-羟基丁酸酯-共聚-3-羟基戊酸酯-共聚-4-羟基丁酸酯)(P(3HB-co-3HV-co-4HB))、聚琥珀酸丁二醇酯(PBS)、聚琥珀酸己二酸丁二醇酯(PBSA)、聚己二酸对苯二甲酸丁二醇酯(PBAT)、聚呋喃酸乙二醇酯(PEF)、聚己内酯(PCL)、聚(己二酸乙二醇酯)(PEA)、聚萘二甲酸乙二醇酯(PEN)、聚对苯二甲酸环己二醇乙二醇酯(PCT)以及这些材料的掺合物/混合物。
替代或附加地，所述混合PET塑料制品可以含有聚酰胺(也称为尼龙)，优选选自聚酰胺-6或聚(β-己内酰胺)或聚己酰胺(PA6)、聚酰胺-6,6或聚(己二酰己二胺)(PA6,6)、聚(11-氨基十一碳酰胺)(PA11)、聚十二碳内酰胺(PA12)、聚(己二酰丁二胺)(PA4,6)、聚(癸二酰戊二胺)(PA5,10)、聚(壬二酰己二胺)(PA6,9)、聚(癸二酰己二胺)(PA6,10)、聚(十二碳酰己二胺)(PA6,12)、聚(己二酰间苯二甲胺)(PAMXD6)、聚己二酰己二胺/聚对苯二甲酰己二胺共聚物(PA66/6T)、聚己二酰己二胺/聚间苯二甲酰己二胺共聚物(PA66/6I)以及这些材料的掺合物/混合物。
在具体实施方式中，所述混合PET塑料制品含有从1至45重量％的聚酰胺，优选从2％至30％，并更加优选从2至20重量％的聚酰胺。
在另一种具体实施方式中，所述混合PET塑料制品含有从55至90重量％的聚酰胺，优选从65％至90％，并更加优选从70至90重量％的聚酰胺。
替代或附加地，所述混合PET塑料制品还可以含有聚烯烃，优选选自聚乙烯(PE)、聚丙烯(PP)、聚甲基戊烯(PMP)、聚丁烯-1(PB-1)、聚异丁烯(PIB)、乙烯丙烯橡胶(EPR)、乙烯丙烯二烯单体橡胶(EPDM)、环状烯烃共聚物(COC)以及这些材料的掺合物/混合物。
在具体实施方式中，所述混合PET塑料制品含有从1至45重量％的聚烯烃，优选从2％至40％，并更加优选从5至35重量％的聚烯烃。
在另一种具体实施方式中，所述混合PET塑料制品含有从55至90重量％的聚烯烃，优选从60％至90％，并更加优选从70至90重量％的聚烯烃。
替代或附加地，所述混合PET塑料制品还可以含有由含碳-碳双键的小分子的乙烯基单体制造的乙烯基聚合物，所述乙烯基聚合物优选选自聚乙烯(PE)、聚丙烯(PP)、聚苯乙烯(PS)、聚氯乙烯(PVC)、聚偏氯乙烯(PVdC)、乙烯乙酸乙烯酯(EVA)、乙烯乙烯醇(EVOH)、聚乙烯醇(PVOH)以及这些材料的掺合物/混合物。
在另一种具体实施方式中，所述混合PET塑料制品含有至少一种选自邻苯二甲醛聚合物(OPA)、聚氯三氟乙烯(PCTFE)和橡胶的其他聚合物。
优选地，所述其他聚合物选自聚对苯二甲酸丙二醇酯(PTT)、聚乳酸(PLA)、聚酰胺-6(PA6)、聚酰胺-6,6(PA6,6)、聚(己二酰间苯二甲胺)(MXD6)、聚乙烯(PE)、聚丙烯(PP)、聚氯乙烯(PVC)、乙烯乙烯醇(EVOH)、邻苯二甲醛聚合物(OPA)、聚苯乙烯(PS)、聚氯三氟乙烯(PCTFE)、橡胶、及其衍生物。
替代或附加地，根据本发明，所述混合PET塑料制品可以含有选自金属化合物、无机化合物、玻璃化合物、天然或合成纤维、纸、木、木化合物如木质素、纤维素或半纤维素、淀粉、和/或其衍生物的其他化合物。
在具体实施方式中，所述混合PET塑料制品含有从5至45重量％的纤维，优选从10％至35％，并更加优选从25至45重量％的纤维。在另一种具体实施方式中，所述混合PET塑料制品含有从55至95％重量的纤维，优选从60％至90％，更优选从65至90重量％的纤维。有利地，所述纤维选自碳纤维、亚麻纤维、大麻纤维、木纤维、纸纤维、禾秆纤维、黄麻纤维、棉纤维、粘胶纤维、玻璃纤维、金属纤维、芳纶纤维、硼纤维、陶瓷纤维、液晶聚合物纤维、聚酯纤维及其混合物等。优选地，所述混合PET塑料制品包含棉纤维和/或粘胶纤维和/或尼龙纤维。这样的混合塑料制品的实例包括纺织品、织物、垫子和地毯。
在具体实施方式中，所述混合PET塑料制品包含至少一种金属化合物。有利地，金属化合物选自铝例如箔、氧化铝、钛、氧化钛、镍或铬，优选铝。
例如，所述混合PET塑料制品含有从1至70重量％的金属化合物，优选从2％至50％，更优选从2至40重量％的金属化合物。
在具体实施方式中，所述混合塑料制品包含至少一种无机化合物，优选选自硅石或二氧化硅、玻璃或云母。
在优选实施方式中，所述其他化合物选自铝、纤维素、淀粉或其混合物。
本发明的方法是为了使任何混合PET塑料制品再循环而设计的。本发明的方法对准的所述混合PET塑料制品可以包含不同种类的塑料材料，包括源自于石化产品或生物基塑料材料(即完全或相当部分由生物产品构成)的合成塑料材料。
根据本发明，PET和所述其他组分可以在所述混合PET塑料制品中不同地组合。例如，它们可以全部混合在一起形成同一物块，包括通过挤塑产生的掺合物。替代或附加地，所述混合PET塑料制品可以由含有不同组分的几个层和/或部分构成。或者，所述混合PET塑料制品可以是由浸渍有PET树脂的天然或合成纤维构成的PET复合制品，例如建筑业中用于外立面、门廊、花盆、栏杆等的玻璃强化聚酯。
例如，所述混合PET塑料制品可以包含塑料板、管子、棒、异型材、型材、大块体、纤维等。所述混合PET塑料制品的不同的层/部分可以共存、相邻、连接在一起或迭盖。
因此，本发明的方法可以用于使包含不同塑料材料的逐个层的混合PET塑料制品再循环。所述层可以具有不同的长度、厚度等。所述层可以完全、或仅仅部分重叠。所述层可以在制造期间通过专门的处理等，用特殊的胶粘剂粘合。在具体实施方式中，所述层中的一个形成所述塑料制品的PET层和另一个层之间的胶粘剂。这样的混合塑料制品的实例包括塑料瓶、食品包装材料、塑料泡罩、塑料吸塑等。例如，可以有利地实施本发明的方法以对在其中尼龙基纳米复合材料或EVOH层夹在两个PET层之间的含气液体塑料瓶进行再循环。同样地，可以实施本发明的方法以对作为托盘的食品包装材料进行再循环，在所述托盘中PE层用作均由PET构成的托盘和盖之间的焊接剂。
本发明的方法还可以用于使包含由不同塑料材料制造的不同部分或部件的混合PET塑料制品再循环。所述部分可以具有不同或相同的尺寸并且至少部分物理粘合在一起。例如，本发明的方法可以用于对用PET和PTT纤维的掺合物制成或含有迭盖的PET和PTT纤维的地毯碎片进行再循环。
在另一种实施方式中，本发明的方法可以用于对用含有PET和另一种材料如木材料、金属材料、纤维等的塑料材料制成的混合PET塑料制品进行再循环。
这种混合PET塑料制品可以用这些不同材料的层或部分至少部分粘合在一起而形成。所述层或部分可以具有不同的尺寸并可以完全或仅仅部分重叠。所述层或部分可以在制造期间通过专门的处理等，用特殊的胶粘剂粘合。例如，本发明的方法可以用于使包含一侧被铝层再覆盖(recovered)的PET层的混合PET塑料制品再循环。作为具体实例，本发明的方法可以用于对用于食品包装材料的包含与铝层或箔叠层的PET的小袋进行再循环。在另一种实施方式中，本发明的方法可以用于对由涂有纳米晶纤维素的PET膜构成的软质食品包装材料进行再循环。本发明的方法也可以用于对软质包装材料进行再循环，例如用于包含包括PET、纸和铝在内的几种组分的药品包装材料的软质包装材料。
或者，这种混合塑料制品可以由PET和纤维的掺合物或迭盖的PET和纤维例如棉、聚酰胺或粘胶纤维形成。这样的塑料制品的实例包括纺织品和织物。
在另一种实施方式中，本发明的再循环方法应用于以含有PET和至少另一种聚合物的混合物的组合物制造的混合PET塑料制品。在另一种实施方式中，所述目标混合PET塑料制品至少部分用其中包括金属粒子和/或陶瓷粒子和/或玻璃粒子的PET树脂制成。在另一种实施方式中，本发明的再循环方法应用于含有与乙酸纤维素掺合的PET的塑料制品。在另一种实施方式中，本发明的再循环方法应用于含有与纺织或无纺纤维迭盖的PET树脂的塑料制品。所述树脂也可以含有其他聚合物，包括另一种聚酯和/或聚酰胺和/或聚烯烃和/或乙烯基聚合物。
在具体实施方式中，所述混合PET塑料制品包含两种其他组分。有利地，所述其他组分之一是聚合物，优选选自聚酯、聚酰胺和聚烯烃，和第二种其他组分是金属化合物，优选铝。例如，本发明的方法可以用于使含有PET、聚乙烯例如LDPE和铝的掺合物和/或连续层的混合PET塑料制品再循环。作为另一个实例，本发明的方法可以用于使含有PET、聚丙烯和铝的掺合物和/或连续层的混合PET塑料制品再循环。
解聚酶
本发明人已经开发了允许降解混合PET塑料制品中含有的PET以便回收其单体和/或低聚物的再循环方法。
根据本发明，特殊的解聚酶可以用于实施所述再循环方法。更具体地，可以使用角质酶、脂肪酶和/或酯酶。在优选实施方式中，所述解聚酶是角质酶，优选选自解纤维素喜热裂孢菌(Thermobifida cellulosityca)、Thermobifida halotolerans、褐色喜热裂孢菌(Thermobifida fusca)、白色喜热裂孢菌(Thermobifida alba)、枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)、茄病镰刀菌(Fusarium solani pisi)、特异腐质霉(Humicola insolens)、和土生梭孢霉(Thielavia terrestris)。在另一种实施方式中，所述角质酶选自宏基因组文库。
有利地，所述混合PET塑料制品与所述酶接触，所述酶可以是天然或合成的。例如，所述酶可以通过重组技术产生，或者当天然存在时，它可以从天然源分离或提纯，或者它可以人工产生。
所述酶可以是可溶形式，或者在固相上，例如粉末形式。具体而言，它可以与细胞膜或脂质囊泡结合，或者与合成担体例如玻璃、塑料、聚合物、滤纸、膜结合，所述合成担体例如以珠子、柱、板等的形式。
所述酶优选以分离或提纯的形式。优选地，本发明的酶从微生物表达、来源、分泌、分离、或提纯。所述酶可以通过本身在本领域中已知的技术提纯，并用常规技术储存。所述酶可以被进一步修饰以改善例如，它们的稳定性或活性。例如，所述酶与稳定和/或增溶组分例如水、甘油、山梨糖醇、糊精包括麦芽糖糊精和/或环糊精、淀粉、丙二醇、盐等一起配制。
在另一种实施方式中，所述待再循环的混合塑料制品与合成并分泌所述解聚酶的微生物接触。在本发明的环境中，所述酶可以分泌在培养基中或向着所述酶可以锚定的所述微生物的细胞膜。
所述微生物可以天然合成所述解聚酶，或者它可以是重组微生物，其中编码所述解聚酶的重组核苷酸序列已经利用例如载体插入。
例如，编码目标解聚酶的核苷酸分子被插入载体例如质粒、重组病毒、噬菌体、附加体、人工染色体等中。
有利地，所述核苷酸分子在特定启动子的控制之下。所述载体然后转染到宿主微生物中，形成重组微生物。所述宿主进一步在适合于所述宿主的培养条件下培养，从而得到含有本发明的酶的重组细胞。适合于所述宿主的培养条件是本领域技术人员公知的。
本发明的核苷酸分子可以是分离或提纯的形式，并通过本身在本领域中已知的技术，例如，cDNA文库克隆和表达、扩增、酶促合成或重组技术，来制造、分离和/或操作。所述核苷酸分子也可以通过公知的化学合成技术体外合成。本发明的核苷酸分子可以包含其他核苷酸序列，例如可用于引起或调节所述酶在选定的宿主细胞或系统中表达的调节区，即启动子、增强子、沉默子、终止子等。
所述重组微生物可以直接使用。替代或附加地，可以从培养基提纯重组酶。任何常用的分离/提纯手段，例如盐析、凝胶过滤、疏水相互作用层析或离子交换色谱，可以用于这种意图。
在具体实施方式中，可以使用已知合成并分泌目标解聚酶的微生物。例如可以使用合成并分泌角质酶的米曲霉(Asperigillus oryzae)、特异腐质霉、桔青霉菌(Penicillium citrinum)、茄病镰刀菌和解纤维素喜热裂孢菌。同样地，南极念珠菌(Candida antarctica)、棉毛嗜热菌(Thermomyces lanuginosus)、伯克氏菌属(Burkholderia spp)和小麦(Triticum aestivum)合成适合于解聚PET的脂肪酶。
根据本发明，几种微生物和/或提纯的酶和/或合成酶可以一起或相继用于解聚相同的混合PET塑料制品或不同的混合PET塑料制品中含有的不同种类的聚合物。
有利地，本发明的微生物表现出改性的代谢，以便防止消耗从所述降解的聚合物得到的单体和/或低聚物。例如，所述微生物是重组微生物，其中已经删除或敲除降解所述单体和/或低聚物的酶。或者，本发明的方法可以在含有至少一种可被所述微生物利用的碳源的培养基中进行，使得所述微生物优选消耗这种碳源而不是所述单体和/或低聚物。
有利地，所述混合PET塑料制品与含有所述微生物、作为碳源的葡萄糖等、以及可利用的氮源包括有机氮源(例如胨、肉提取物、酵母抽提物、玉米浆)或无机氮源(例如硫酸铵、氯化铵)的培养基接触。如有必要，所述培养基还可以含有无机盐(例如，钠离子、钾离子、钙离子、镁离子、硫酸根离子、氯离子、磷酸根离子)。此外，所述培养基也可以补充痕量组分例如维生素和氨基酸。
在具体实施方式中，所述解聚酶在有利于它吸附在所述混合PET塑料制品上的条件下使用，使得所述混合塑料制品的PET更有效地解聚成单体和/或低聚物。更具体地，所述解聚酶可以是与野生型酶相比对混合塑料制品中含有的PET具有改善的亲合力的突变酶。或者，所述解聚酶可以与塑料结合蛋白或提高所述解聚酶和所述混合PET塑料制品之间结合的结合模块一起使用。
在本发明的环境中，“塑料结合蛋白”是指促进所述解聚酶吸附在塑料制品上的没有酶活性的蛋白质。例如，生物表面活性剂例如疏水蛋白，其能天然吸附于疏水物质以及疏水(塑料)和亲水(水介质)相之间的界面，或破坏性蛋白质例如扩展蛋白(expansins)和扩张蛋白(swollenins)，其通过削弱相邻聚合链之间的连键例如氢键起作用，可以用作塑料结合蛋白。
扩张蛋白是首先在腐生真菌里氏木霉(Trichoderma reesei)中鉴定的蛋白质(“扩张蛋白，与植物扩展蛋白有序列相似性的里氏木霉蛋白，对纤维素材料表现出破坏活性(Swollenin，a Trichoderma reesei protein with sequence similarity to the plant expansins，exhibits disruption activity on cellulosic materials).”Eur J Biochem269：4202–4211)。所述蛋白质具有N端真菌型碳水化合物结合模块家族1结构域(CBD)，所述CBD有纤维素结合功能，通过接头区与跟1类青草花粉过敏原(pfam 01357)同源的扩展菌素样结构域连接。
扩展蛋白与在各种植物的细胞中发现的非酶性蛋白质密切相关。扩展蛋白被认为促进细胞扩展并因此通过允许植物纤维内的纤维素、果胶和/或半纤维素链滑动或移动而促进细胞生长。扩展蛋白已经显示出削弱再循环纸的纸纤维之间的氢键，所述再循环纸包括可能难以再循环的商业用纸，例如期刊和目录的涂料纸。扩展蛋白和扩张蛋白通过削弱相邻的聚合链之间的连键例如氢键、然后促进解聚酶对于塑料的可及性来起作用。
所述塑料结合蛋白可以由与产生所述解聚酶的相同微生物产生。
用在本文中时，“疏水蛋白”是指小的分泌真菌蛋白，其含有8个位置保守的半胱氨酸残基和由4个分子内二硫键固定的(foxed)明显的疏水补丁。疏水蛋白能天然吸附于疏水物质以及疏水(塑料)和亲水(水介质)相之间的界面。更具体地，疏水蛋白装配成两亲性结构并降低塑料和解聚酶之间的界面能(Takahashi等，2005Mol.Microbiol.57，1780-1796；Espino-Rammer等，2013AEM 79，4230-4238)。优选地，所述疏水蛋白足够刚性，以在与蛋白质融合时保持露出所述疏水补丁(Paananen等，2013Soft Matter 9，1612-1619)。
优选地，所述塑料结合蛋白是疏水蛋白。
根据本发明，所述塑料结合蛋白本身不促进解聚，但能够通过促进解聚酶在所述混合PET塑料制品上吸附或增加它的可及性来提高解聚效率。与没有塑料结合蛋白的相同的解聚相比，使用塑料结合蛋白可以将目标聚合物的解聚提高至少1.01倍，例如至少1.025倍、至少1.05倍、至少1.075倍、至少1.10倍、至少1.25倍、至少1.5倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少10倍、或至少20倍。
有利地，所述塑料结合蛋白与所述解聚酶融合。或者，所述塑料结合蛋白可以是仅仅与所述解聚酶和所述混合PET塑料制品放在一起的单独的分子，从而将自身附着于所述混合PET塑料制品的疏水性表面并与所述解聚酶合作以促进所述混合PET塑料制品的降解。所述塑料结合蛋白可以与所述解聚酶同时使用。“同时”，用在本文中时，意味着同时或基本上同时施用，即，30秒、一分钟、两分钟、三分钟、四分钟或五分钟内。或者，所述塑料结合蛋白和解聚酶可以相继施加。例如，所述塑料结合蛋白可以首先施加，随后是所述解聚酶。在一些实施方式中，所述解聚酶在施用所述塑料结合蛋白后至少五分钟或更长时施用。
在具体实施方式中，所述解聚酶包含“结合模块”，与没有所述结合模块的解聚酶相比，所述结合模块提高了所述解聚酶与所述混合PET塑料制品的结合。
“结合模块”(BM)或“结合结构域”是指蛋白质的连续氨基酸序列，其提高所述蛋白质与底物的结合。在本发明的环境中，结合模块更具体地是指对目标聚合物具有高亲合力或与其结合的多肽，并且其可以经由柔性接头或间隔物与酶连接。有利地，所述结合模块负责与聚合物链相连并允许所述酶的活性位点对于所述塑料制品进行协调。所述结合模块也可以部分破坏所述聚合物的结构，所述目标键然后对所述解聚酶的活性位点而言更易接近。结合模块最经常能够与一定范围的聚合物结合。所述结合模块一般涉及经由色氨酸残基或特定疏水性氨基酸的疏水性相互作用。根据本发明，所述解聚酶可以天然包含结合模块。例如，野生型(半)纤维素酶和壳多糖酶含有碳水化合物结合模块，而聚(羟基链烷酸)解聚酶含有聚酯结合模块。另外，所述结合模块可以是与目标解聚酶融合以改善它的吸附和进而的水解的外源结合模块。
在具体实施方式中，所述结合模块是经由接头与所述解聚酶融合的外源肽，以促进所述酶与底物的吸附。与野生型解聚酶相比，所述重组解聚酶具有提高的解聚活性。例如，与没有结合模块的相同的解聚相比，所述外源结合模块将目标聚合物的解聚提高至少1.01倍，例如至少1.025倍、至少1.05倍、至少1.075倍、至少1.10倍、至少1.25倍、至少1.5倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少10倍、或至少20倍。酶修饰的遗传工程有文件记载，并且本领域技术人员可易于实施。
在具体实施方式中，所述结合模块的序列还可以被修饰以增加它的结合性质。例如，在与来自粪碱纤维单胞菌(Cellulomonas fimi)的纤维素CenA的碳水化合物结合模块融合的来自褐色喜热裂孢菌的角质酶的结合模块中W68L和W68Y处的突变，与所述野生型相比，将PET解聚提高了1.5倍(Zhang等，2013Carbohydrate Polymers 97，124-129)。
在另一种实施方式中，所述方法包括表现出突变的活性位点和/或结合部位的重组解聚酶。具体而言，所述活性位点可以与野生型酶相比扩大，以提高所述酶的催化活性。有利地，所述解聚酶的活性位点可以通过位点定向诱变而变宽，以便更好地适合更大的聚合物链。例如，来自茄病镰刀菌并在L81A或L189A处突变的角质酶与野生型酶相比，将PET解聚分别增加了4和5倍；并且在L182A处的突变允许PA6,6解聚增加2倍(Araujo等，2007Journal of Biotechnology 128，849-857)。
另外或附加地，位于所述解聚酶表面的氨基酸并且尤其是在所述酶的活性位点附近的那些氨基酸也可以突变，以改善所述酶与塑料制品的吸附。这样的突变有利地增加了疏水性相互作用并减少了表面正电荷。与所述塑料结合的区的表面上的中性静电势可能有利于所述解聚。
在具体实施方式中，所述重组解聚酶可以组合两种或更多种位点定向诱变。例如，来自褐色喜热裂孢菌的角质酶Tfu_0883的双重突变体Q132A/T101A有更宽的活性位点和更高的疏水性(Silva等，2011Biotech.J.6，1230-1239)，其可以在本发明的PET解聚过程中有利地实施。
再循环工艺参数
根据本发明，通过混合PET塑料制品与特殊的解聚酶和/或与合成并分泌这样的酶的微生物在允许PET降解的条件下接触，可以使所述塑料制品再循环。
在具体实施方式中，所述混合PET塑料制品可以在与所述解聚酶接触之前预处理，以便物理改变它的结构，从而增加所述聚合物和所述酶之间的接触面和/或减少来自废物的微生物电荷。例如，所述混合PET塑料制品可以转变为乳液或粉末，将其添加到含有所述微生物和/或酶的液体培养基中。或者，所述混合PET塑料制品可以通过切割、冲击、压碎、磨碎、分割、冷冻粉碎等而机械粉碎、成粒、成球等，以在添加到含有所述微生物和/或酶的液体培养基中之前减小所述材料的形状和尺寸。所述机械预处理也可以是声波处理、离心、剪切、collisop、高压均化器、用转鼓浸解或液化、螺旋压力机、圆盘筛切碎机或活塞压力机。替代或附加地，可以施行热预处理。它可以用微波实现。这样的热预处理可以提供消毒、巴氏灭菌或杀菌。在另一种实施方式中，所述混合PET塑料制品被化学预处理以更改它的结构并增加所述聚合物和所述酶之间的接触面。可以使用碱、酸、溶剂或离子性液体。臭氧化也可以实施。在具体实施方式中，所述塑料制品也可以在降解之前被分类、洗涤、消毒、杀菌和/或生物清洁。根据本发明，几种预处理可以组合。
降解混合PET塑料制品需要的时间可以取决于所述混合PET塑料制品本身(即，所述塑料制品的性质和来源、它的组成、形状等等)、使用的微生物/酶的类型和量、以及各种工艺参数(即，温度、pH、其他作用剂等)而异。本领域技术人员可以容易地针对所述塑料制品和/或解聚酶采用工艺参数。
有利地，所述方法在包含20℃和80℃之间、更优选25℃和60℃之间的温度下实施。优选地，所述温度至少在所述解聚步骤期间保持在25℃和50℃之间。更一般而言，所述温度保持在低于失活温度，失活温度相当于所述酶失活和/或所述微生物不再合成所述降解酶时的温度。意外地，本发明人发现，本发明的方法可以在低于超过70℃的所述PET的Tg(即玻璃化转变温度)的温度下实施。
有利地，根据本发明，用于所述解聚步骤的酶的添加量是塑料制品的最多5重量％，优选最多1％，更优选最多0.1％，并更加优选最多0.05％。有利地，所述降解酶的添加量在塑料制品的0.001至5重量％范围内，优选在0.001％至1％的范围内，更优选在0.001％至0.1％的范围内，更加优选在0.001％至0.05％的范围内。
所述培养基的pH在4至10的范围内。有利地，所述pH根据目标聚合物/酶偶联和所述目标单体的溶解度进行调节，以改善工艺效率。更具体地，调节pH以保持在所述酶的最适pH下。实际上，聚酯和聚酰胺的解聚产生酸性单体和低聚物，引起pH降低。添加稀碱可用于补偿这种酸化并将pH保持在最适pH。
在具体实施方式中，所述方法在剧烈搅拌下进行，优选包括100rpm和5000rpm之间，以便有利于解聚酶和塑料产品之间的接触并因此将所述酶吸附在所述塑料上。
在具体实施方式中，至少亲脂剂和/或亲水剂添加到所述培养基中以改善所述解聚步骤。诱导剂例如聚酯的低聚物或其衍生物可以添加到所述培养基中以改善酶生产。表面活性剂例如Tween可以添加到所述培养基中以更改所述聚合物和所述酶或微生物之间的界面能和改善降解效率。有机物质或离子性液体可用于溶胀所述聚合物和增加它对于所述微生物或酶的可及性。
有利地，本发明的方法在没有任何降解加速剂下进行。在具体实施方式中，本发明的方法在只含有所述解聚酶和水的降解液中进行。在具体实施方式中，本发明的方法在没有有机溶剂下进行。
解聚所述塑料制品的至少一种聚合物的反应时间有利地包括5和72小时之间。这样的反应时间可以允许所述解聚充分推进，并且不会在经济上不利。
回收的单体和/或低聚物的分离、提纯和再利用
由所述解聚产生的单体和/或低聚物可以相继或连续回收。取决于所述聚合物和/或所述起始混合PET塑料制品，可以回收单一类型的单体和/或低聚物或几种不同类型的单体和/或低聚物。
根据本发明，优选的单体选自单乙二醇和对苯二甲酸，并且优选的低聚物选自对苯二甲酸甲基-2-羟乙酯(MHET)、对苯二甲酸双(2-羟乙基)酯(BHET)、苯甲酸2-羟乙酯和对苯二甲酸二甲酯(DMT)。
所述回收的单体和/或低聚物可以利用所有适当的提纯方法进一步提纯并调理成可再聚合的形式。提纯方法的实例包括汽提法、通过水溶液分离、蒸汽选择性冷凝、培养基在生物处理后的过滤和浓缩、分离、蒸馏、真空蒸发、提取、电渗析、吸附、离子交换、沉淀、结晶化、浓缩和酸加成脱水和沉淀、纳米过滤、酸催化剂处理、半连续方式蒸馏或连续方式蒸馏、溶剂提取、蒸发浓缩、蒸发结晶化、液/液提取、氢化、共沸蒸馏法、吸附、柱层析、简单减压蒸馏和微滤，以上方法组合或不组合。
所述可再聚合的单体和/或低聚物然后可以再用于合成聚合物。有利地，再聚合的是性质相同的聚合物。然而，有可能将所述回收的单体和/或低聚物与其他单体和/或低聚物混合，以便合成新的共聚物。
在具体实施方式中，在允许聚合反应的适当条件下利用水解酶进行再聚合。引发剂可以添加到所述单体/低聚物溶液以帮助所述聚合反应。本领域技术人员可以容易地针对所述单体/低聚物和要合成的聚合物来采用工艺参数。
本发明的其他方面和优点将在下面的实施例中公开，所述实施例应该被认为是说明性的而不限制本申请的范围。以下是本发明的描述，包括概括给出的其优选实施方式。本发明在下文中题头“实施例”下给出的公开内容中进一步例示，所述实施例提供支持本发明的试验数据和执行本发明的手段。
实施例
实施例1
本试验显示了通过用来自解纤维素喜热裂孢菌DSM 44535的角质酶Thc_Cut1处理混合PET塑料制品，回收对苯二甲酸和对苯二甲酸单(2-羟乙基)酯。
材料&方法
通用重组DNA技术
解纤维素喜热裂孢菌DSM44535得自德国生物材料资源中心(German Resource Centre for Biological Material)(DSMZ，德国)。所述菌株维持在LB琼脂板上并在500mL振荡烧瓶(200mL LB培养基)中于37℃和160rpm下培养24h。通过在3,200g和4℃离心20min收获细胞。
载体pET26b(+)(Novagen，德国)用于在大肠杆菌(Escherichiacoli)BL21-Gold(DE3)(Stratagene，德国)中表达来自解纤维素喜热裂孢菌的角质酶THC_Cut1。
编码角质酶的基因Thc_cut1通过标准聚合酶链反应(PCR)从解纤维素喜热裂孢菌(T.cellulosilytica)DSM44535的基因组DNA扩增。基于编码来自褐色喜热裂孢菌(T.fusca)YX的角质酶的基因(Genbank登录号YP_288944和YP_288943,33)的已知序列，设计了两种引物，5’-CCCCCGCTCATATGGCCAACCCCTACGAGCG-3’(正向引物–SEQ ID N°1)和5’-GTGTTCTAAGCTTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTGCCAGGCACTGAGAGTAGT-3’(反向引物–SEQ ID N°2)，允许在没有信号肽下扩增相应的基因和在所述角质酶的C端引入6xHis-Tag。所设计的引物包括限制性位点NdeI和HindIII，用于所述基因克隆到载体pET26b中。所述PCR在50μL体积中实行，所述体积中有作为模板的基因组DNA、0.4μM的各引物、0.2mM dNTP、5单位Phusion DNA聚合酶(Finnzymes)和由供应商提供的1X反应缓冲液。所述PCR在Gene Amp PCR 2200热循环仪(Applied Biosystems，USA)中进行。完成35个循环，每个循环都将所述反应混合物顺序暴露于98℃(30s，变性)、63℃(30s，退火)，和72℃(30s，延伸)。质粒和DNA片段通过Qiagen DNA提纯试剂盒(Qiagen，德国)提纯。如此得到的纯化的扩增PCR产物用限制性核酸内切酶NdeI和HindIII(New England Biolabs，USA)消化，用碱性磷酸酶(Roche，德国)脱磷酸并用T4DNA-连接酶(Fermentas，德国)与pET26b连接并按照制造商的说明书转化到大肠杆菌(E.coli)BL21-Gold(DE3)中。
所述基因的序列通过使用引物5’-GAGCGGATAACAATTCCCCTCTAGAA-3’(SEQ ID N°3)和5’-CAGCTTCCTTTCGGGCTTTGT-3’(SEQ ID N°4)进行DNA测序来确定。DNA作为客户服务测序(Agowa，德国)。DNA序列的分析和操作用载体NTi Suite 10(Invitrogen，USA)进行。蛋白质序列利用Clustal W程序(Swiss EMBnet节点服务器)比对。所述分离基因的核苷酸序列已经在GenBank数据库中以登录号HQ147786(Thc_cut2)保藏。
角质酶的表达和提纯
新转化的大肠杆菌BL21-Gold(DE3)细胞用于接种20mL补充有40μg/mL卡那霉素的LB培养基并在37℃和160rpm下培养过夜。所述过夜培养物用于接种200mL有40μg/mL卡那霉素的LB培养基到OD600＝0.1并温育直到达到OD600＝0.6-0.8。然后，所述培养物冷却到20℃并用终浓度0.05mM的IPTG诱导。诱导在20℃和160rpm下进行20h。通过离心(20min，4℃，3,200g)收获所述细胞。
来自200mL细胞培养物的细胞团重悬浮在30mL结合缓冲液(20mM NaH2PO4*2H2O，500mM NaCl，10mM咪唑，pH 7.4)中。所述重悬浮的细胞在冰冷却下用三次30s脉冲声处理(Vibra Cell，Sonics Materials，Meryin/Satigny，瑞士)。裂解液被离心(30min，4℃，4,000g)并通过0.2μm膜过滤。所述细胞裂解液利用具有HisTrap FF柱的提纯系统提纯(洗脱缓冲液20mM NaH2PO4*2H2O，500mM NaCl，500mM咪唑，pH 7.4)。为了鉴定角质酶，所述HisTag洗脱缓冲液更换为由PD-10脱盐柱(GE Healthcare)使用的100mM Tris HCl pH 7.0。
蛋白质浓度由Bio-Rad蛋白质分析试剂盒(Bio-Rad Laboratories GmbH)和作为蛋白质标准的牛血清白蛋白测定。按照Laemmli(Laemmli，U.K.Nature 1970，227(5259)，680–685)进行SDS-PAGE并用考马斯亮蓝R-250染色蛋白质。
所有化学品是来自Sigma(德国)的分析级。
混合PET塑料制品的水解
所述混合PET塑料制品被预处理以增加PET和所述酶之间的接触面。它们被利用切割磨机SM-2000(Retsch)在5min期间内机械磨碎成粉末。收集的粉末然后用AS 200筛分器(Retsch)在10min期间以1.5mm的振幅过筛，得到500μm和250μm粒度之间的粉末。利用差示扫描量热(DSC)试验，使用Q100TA-RCS 90仪器，在氮气氛(50mL/min)下在铝盘中对8mg左右的样品以10℃/min的扫描速率从-50℃到300℃，以便确定混合PET塑料制品中PET的玻璃化温度(Tg)和结晶度。
在每个样品中，10mg塑料产品与在1mL的KH2PO4/K2HPO4 100mM，pH 7.0缓冲液中的5μM角质酶一起在50℃伴300rpm振荡温育24h。所有试验一式三份进行。对照利用1mL没有酶的缓冲液进行。
对苯二甲酸(TA)和对苯二甲酸单(2-羟乙基)酯(MHET)分析
酶处理后，蛋白质在冰上利用1:1(v/v)无水甲醇(Merck)沉淀。样品在0℃以16,000g离心(Hettich MIKRO 200R，Tuttlingen，德国)15min。500μL上清液装入HPLC小瓶中并通过添加3.5μL的6N HCl酸化。所用的HPLC是DIONEX P-580PUMP(Dionex Cooperation，Sunnyvale，USA)，具有ASI-100自动进样器和PDA-100光电二极管阵列检测器。为了分析TA和MHET，使用反相柱RP-C18(Discovery HS-C18，5μm，150x 4.6mm，有前置柱，Supelco，Bellefonte，USA)。如下进行分析：用60％水、10％0.01N H2SO4和30％甲醇作为洗脱液，逐渐(15min)到50％甲醇和10％酸，逐渐(至20min)90％甲醇和酸，停留2min，然后逐渐到起始位置，5min的后运行。流速设置为1mL/min并且所述柱保持在25℃温度下。进样体积是10μL。TA和MHET的检测用光电二极管阵列检测器在241nm波长下进行。
结果
实施例1A：由PET和聚烯烃制成的混合PET塑料制品的再循环
由PET和聚乙烯PE制成的火腿包装材料(Herta“tendre noix”)进行水解以回收TA。PE的比例估算为8％(w/w).PET具有80℃的Tg并且是结晶度为10％的半晶。
所述PET-PE粉末由角质酶Thc_Cut1进行水解并且在仅仅24h内回收对苯二甲酸(347±19μM)，而在对照中没有检测到对苯二甲酸。同样地，回收了MHET：24h内71±3μM。
实施例1B：由PET和聚酰胺制成的混合PET塑料制品的再循环
由PET和PA(尼龙聚(己二酰间苯二甲胺)称为MXD6)制成的苏打水瓶进行水解以回收TA。PA的比例估算为8％(w/w)。PET具有76℃的Tg并且是结晶度为23％的半晶。
所述PET-PA粉末由角质酶Thc_Cut1进行水解并且在仅仅24h内回收对苯二甲酸(332±7μM)，而在对照中没有检测到对苯二甲酸。同样地，回收了MHET：24h内65±2μM。
实施例1C：由PET和棉制成的混合PET塑料制品的再循环
由PET和棉制成的服装的一部分进行水解以回收TA。说明的比例是65％(w/w)棉和35％(w/w)的PET。
所述PET-棉纤维由角质酶Thc_Cut1进行水解并在24h内回收约4μM的对苯二甲酸，而在对照中没有检测到对苯二甲酸。同样地，在24h内回收约2μM的MHET。
实施例1D：由PET和铝箔制成的混合PET塑料制品的再循环
由PET和铝箔制成的食品包装袋(“Elle et Vire Crème légèreépaisse”)进行水解以回收TA。铝的比例估算为10％(w/w)。PET为半晶。
所述PET-铝粉末由角质酶Thc_Cut1进行水解并且在24h内回收约88μM的对苯二甲酸，而在对照中没有检测到对苯二甲酸。同样地，在24h内回收了约51μM的MHET。
实施例1E：几种混合PET塑料制品的再循环
实施例1A(由PET和PE制成的包装材料)、1B(由PET和PA制成的包装材料)、1C(由PET和铝制成的包装材料)和1D(由PET和棉制成的织物)中使用的混合PET塑料制品的混合物由角质酶Thc_Cut1一起水解以回收TA。在24h内回收约780μM的对苯二甲酸，而在对照中没有检测到对苯二甲酸。同样地，在24h内回收了约200μM的MHET。
实施例2
本试验显示了通过用来自解纤维素喜热裂孢菌DSM 44535的角质酶Thc_Cut1处理含有PET和添加剂的PET瓶子来回收对苯二甲酸和对苯二甲酸单(2-羟乙基)酯。
所述角质酶的通用重组DNA技术、表达和提纯同实施例1。
处理以前装有商标的矿泉水的PET瓶。整个瓶子被预处理以增加PET和所述酶之间的接触面。利用切割磨机SM-2000(Retsch)将它们在5min期间内机械磨碎成粉末。收集的粉末然后用筛分器AS 200(Retsch)在10min期间以1.5mm的振幅过筛，得到250μm粒度的粉末。利用差示扫描量热(DSC)试验，使用Q100TA-RCS 90仪器，在氮气氛(50mL/min)下在铝盘中对8mg左右的样品以10℃/min的扫描速率从-50℃到300℃，以便确定塑料产品中PET的玻璃化温度(Tg)和结晶度。PET瓶粉末具有77.2℃的Tg并且是结晶度为30％的半晶。
水解在每个样品中如下进行。10mg塑料产品与在1mL的KH2PO4/K2HPO4 100mM，pH 7.0缓冲液中的5μM角质酶一起在60℃伴300rpm振荡温育24h。所有试验一式三份进行。对照利用1mL没有酶的缓冲液进行。
结果
对苯二甲酸(TA)和对苯二甲酸单(2-羟乙基)酯如实施例1进行分析。
所述PET瓶由角质酶Thc_Cut1水解并且在仅仅24h内回收对苯二甲酸(252±13μM)，而在对照中没有检测到对苯二甲酸。同样地，回收了MHET：24h内35±1μM。
实施例3
用添加剂配制的混合PET塑料制品可以受益于本发明的方法而被再循环。本试验显示了通过用来自解纤维素喜热裂孢菌DSM 44535的角质酶突变体Thc_Cut2处理由半晶PET构成的混合PET塑料产品来回收对苯二甲酸。这些多重突变体，双重突变体(DM)Arg29Asn_Ala30Val和三重突变体(TM)Arg19Ser_Arg29Asn_Ala30Val，具有提高所述角质酶吸附在PET上的表面性质并因此增加解聚效率。
通用重组DNA技术
解纤维素喜热裂孢菌DSM44535得自德国生物材料资源中心(DSMZ，德国)。所述菌株维持在LB琼脂板上并在500mL振荡烧瓶(200mL LB培养基)中于37℃和160rpm下培养24h。通过在3,200g和4℃离心20min收获细胞。
载体pET26b(+)(Novagen，德国)用于在大肠杆菌BL21-Gold(DE3)(Stratagene，德国)中表达来自解纤维素喜热裂孢菌的角质酶THC_Cut2。
编码角质酶的基因Thc_cut2通过标准聚合酶链反应(PCR)从解纤维素喜热裂孢菌DSM44535的基因组DNA扩增。基于编码来自褐色喜热裂孢菌YX的角质酶的基因(Genbank登录号YP_288944和YP_288943,33)的已知序列，设计了两种引物，5’-CCCCCGCTCATATGGCCAACCCCTACGAGCG-3’(正向引物–SEQ ID N°1)和5’-GTGTTCTAAGCTTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTGCCAGGCACTGAGAGTAGT-3’(反向引物–SEQ ID N°2)，允许在没有信号肽下扩增相应的基因和在所述角质酶的C端引入6xHis-Tag。所设计的引物包括限制性位点NdeI和HindIII，用于所述基因克隆到载体pET26b中。所述PCR在50μL体积中实行，所述体积中有作为模板的基因组DNA、0.4μM的各引物、0.2mM dNTP、5单位Phusion DNA聚合酶(Finnzymes)和由供应商提供的1X反应缓冲液。所述PCR在Gene Amp PCR 2200热循环仪(Applied Biosystems，USA)中进行。完成35个循环，每个循环都将所述反应混合物顺序暴露于98℃(30s，变性)、63℃(30s，退火)，和72℃(30s，延伸)。质粒和DNA片段通过Qiagen DNA提纯试剂盒(Qiagen，德国)提纯。如此得到的纯化的扩增PCR产物用限制性核酸内切酶NdeI和HindIII(New England Biolabs，USA)消化，用碱性磷酸酶(Roche，德国)脱磷酸并用T4DNA-连接酶(Fermentas，德国)与pET26b连接并按照制造商的说明书转化到大肠杆菌BL21-Gold(DE3)中。
所述基因的序列通过使用引物5’-GAGCGGATAACAATTCCCCTCTAGAA-3’(SEQ ID N°3)和5’-CAGCTTCCTTTCGGGCTTTGT-3’(SEQ ID N°4)进行DNA测序来确定。DNA作为客户服务测序(Agowa，德国)。DNA序列的分析和操作用载体NTi Suite 10(Invitrogen，USA)进行。蛋白质序列利用Clustal W程序(Swiss EMBnet节点服务器)比对。所述分离基因的核苷酸序列已经在GenBank数据库中以登录号HQ147786(Thc_cut2)保藏。
Thc_Cut2的位点定向诱变
Thc_Cut2的位点定向诱变通过QuikChange多位点定向诱变试剂盒(Stratagene)、使用pET26b(+)_Thc_cut2作为模板(Herrero Acero等，2011Macromol 44，4640)和携带适当突变的大引物(Thc_Cut2_Asn29_Val30.FW-SEQ ID N°5；Thc_Cut2_Asn29_Val30.Rev-SEQ ID N°6；Thc_Cut2_Asn29_Val30_Ser19.FW-SEQ ID N°7和Thc_Cut2_Asn29_Val30_Ser19.Rev-SEQ ID N°8)进行。所述PCR产物转移到大肠杆菌BL21-Gold(DE3)中。
表达和提纯
新转化的大肠杆菌BL21-Gold(DE3)细胞用于接种20mL补充有40μg/mL卡那霉素的LB培养基并在37℃和160rpm下培养过夜。所述过夜培养物用于接种200mL有40μg/mL卡那霉素的LB培养基到OD600＝0.1并温育直到达到OD600＝0.6-0.8。然后，所述培养物冷却到20℃并用终浓度0.05mM的IPTG诱导。诱导在20℃和160rpm下进行20h。通过离心(20min，4℃，3,200g)收获所述细胞。
来自200mL细胞培养物的细胞团重悬浮在30mL结合缓冲液(20mM NaH2PO4*2H2O，500mM NaCl，10mM咪唑，pH 7.4)中。所述重悬浮的细胞在冰冷却下用三次30s脉冲声处理(Vibra Cell，Sonics Materials，Meryin/Satigny，瑞士)。裂解液被离心(30min，4℃，4,000g)并通过0.2μm膜过滤。所述细胞裂解液利用具有HisTrap FF柱的提纯系统提纯(洗脱缓冲液20mM NaH2PO4*2H2O，500mM NaCl，500mM咪唑，pH 7.4)。为了鉴定角质酶，所述HisTag洗脱缓冲液更换为由PD-10脱盐柱(GE Healthcare)使用的100mM Tris HCl pH 7.0。
蛋白质浓度由Bio-Rad蛋白质分析试剂盒(Bio-Rad Laboratories GmbH)和作为蛋白质标准的牛血清白蛋白测定。按照Laemmli(Laemmli，U.K.Nature 1970，227(5259)，680–685)进行SDS-PAGE并用考马斯亮蓝R-250染色蛋白质。
所有化学品是来自Sigma(德国)的分析级。
塑料产品的水解
处理以前装有商标的矿泉水的PET瓶。整个瓶子被预处理以增加PET和所述酶之间的接触面。利用切割磨机SM-2000(Retsch)将它们在5min期间内机械磨碎成粉末。收集的粉末然后用筛分器AS 200(Retsch)在10min期间以1.5mm的振幅过筛，得到250μm粒度的粉末。利用差示扫描量热(DSC)试验，使用Q100TA-RCS 90仪器，在氮气氛(50mL/min)下在铝盘中对8mg左右的样品以10℃/min的扫描速率从-50℃到300℃，以便确定塑料产品中PET的玻璃化温度(Tg)和结晶度。
PET瓶粉末具有77.2℃的Tg并且是结晶度为30％的半晶。
在每个样品中，10mg塑料产品与在1mL的Tris/HCl 100mM，pH 7.0缓冲液中的5μM重组角质酶一起在50℃伴300rpm振荡温育24h。所有试验一式三份进行。对照利用1mL没有酶的缓冲液进行。
对苯二甲酸(TA)分析
酶处理后，蛋白质在冰上利用1:1(v/v)无水甲醇(Merck)沉淀。样品在0℃以16,000g离心(Hettich MIKRO 200R，Tuttlingen，德国)15min。用于测量的上清液装入HPLC小瓶中并通过添加3.5μL的6N HCl酸化。所用的HPLC是DIONEX P-580PUMP(Dionex Cooperation，Sunnyvale，USA)，具有ASI-100自动进样器和PDA-100光电二极管阵列检测器。为了分析TA，使用反相柱RP-C18(Discovery HS-C18，5μm，150x 4.6mm，有前置柱，Supelco，Bellefonte，USA)。如下进行分析：用60％水、10％0.01N H2SO4和30％甲醇作为洗脱液，逐渐(15min)到50％甲醇和10％酸，逐渐(至20min)90％甲醇和酸，停留2min，然后逐渐到起始位置，5min的后运行。流速设置为1mL/min并且所述柱保持在25℃温度下。进样体积是10μL。TA的检测用光电二极管阵列检测器在241nm波长下进行。
结果
所述PET粉末由重组角质酶Thc_Cut2水解，并且在仅仅24h内回收对苯二甲酸，而在对照中没有检测到对苯二甲酸。所述突变体让TA释放比所述野生型角质酶(13±1μM)更大量。此外，所述三重突变体比所述双重突变体更有效：用所述三重突变体得到30±1μM TA，而不是所述双重突变体的25±1μM。
序列表
<110> 卡比欧斯公司
<120> 混合PET塑料制品的再循环方法
<130> B1809
<160> 8
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 31
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> primer
<400> 1
cccccgctca tatggccaac ccctacgagc g 31
<210> 2
<211> 59
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> primer
<400> 2
gtgttctaag cttcagtggt ggtggtggtg gtgctcgagt gccaggcact gagagtagt 59
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> primer
<400> 3
gagcggataa caattcccct ctagaa 26
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> primer
<400> 4
cagcttcctt tcgggctttg t 21
<210> 5
<211> 63
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> megaprimer
<400> 5
cccttctccg tgagtgaaga aaacgtctcc cgcttcggtg ctgacggttt cggcggcggc 60
acc 63
<210> 6
<211> 63
<212> DNA
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<220>
<223> megaprimer
<400> 6
ggtgccgccg ccgaaaccgt cagcaccgaa gcgggagacg ttttcttcac tcacggagaa 60
ggg 63
<210> 7
<211> 63
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> megaprimer
<400> 7
acccgaccga cgccctgctc gaagccagca gcggcccctt ctccgtgagt gaagaaaacg 60
tct 63
<210> 8
<211> 63
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> megaprimer
<400> 8
agacgttttc ttcactcacg gagaaggggc cgctgctggc ttcgagcagg gcgtcggtcg 60
ggt 63