一种高产核糖核酸的热带假丝酵母及应用.pdf

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1、(10)授权公告号 CN 101805704 B (45)授权公告日 2012.05.23 CN 101805704 B *CN101805704B* (21)申请号 201010105787.X (22)申请日 2010.02.03 CGMCC No.3558 2009.12.30 C12N 1/16(2006.01) C12N 15/01(2006.01) C12N 13/00(2006.01) C12P 19/34(2006.01) C12R 1/74(2006.01) (73)专利权人 中国药科大学 地址 210009 江苏省南京市童家巷 24 号 专利权人 南通秋之友生物科技有限公司。

2、 (72)发明人 周长林 方圆 林忠 邱蔚然 曹静 金由辛 (74)专利代理机构 南京苏科专利代理有限责任 公司 32102 代理人 孙立冰 CN 101270336 A,2008.09.24, 全文 . 周震， 等 . 产核酸和乳糖酶的热带假丝酵母 QZN0209 培养条件研究 .工艺微生物 .2002, 第 32 卷 ( 第 3 期 ),28 32. (54) 发明名称 一种高产核糖核酸的热带假丝酵母及应用 (57) 摘要 本 发 明 涉 及 生 物 医 药 领 域，具 体 涉 及 一 种 高 产 核 糖 核 酸 的 热 带 假 丝 酵 母 菌 (Candidatropicalis) 菌 。

3、株 及 其 应 用， 本 发 明 的热带假丝酵母 (Candida lipolytica) 菌株 于 2009 年 12 月 30 号在中国微生物菌种保藏管 理委员会普通微生物中心提交保藏， 保藏号为 ： CGMCCNo.3558。本发明的菌株不但核酸含量很高 并且具有解脂假丝酵母可利用石蜡油为碳源的特 征， 可应用于核酸的工业化生产。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 吴汀晨 权利要求书 1 页 说明书 7 页 附图 5 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 7 页 附图 5 页 1/1 页 2 1. 一。

4、种高产核糖核酸的热带假丝酵母菌菌株， 其在中国普通微生物菌种保藏管理中心 的保藏号是 ： CGMCC No.3558。 2. 一种高产核糖核酸的方法， 该方法包括 ： 在种子培养基中发酵培养权利要求 1 的 菌株， 在培养后将菌液转接发酵培养基中发酵培养即得， 其中种子培养基含 ： 葡萄糖 4、 (NH4)2SO41.5、 KH2PO40.9、 K2HPO40.3、 MgSO47H2O 0.3、 FeSO47H2O 0.003、 酵母 膏 0.3、 玉米浆 0.3和 CaCO30.5， 其中发酵培养基含 ： 葡萄糖 5、 酵母膏 1.2、 玉米 浆 0.9、 (NH4)2SO41.0、 KH2。

5、PO40.3， 为重量体积百分比。 3. 权利要求 2 的方法， 其中在种子培养基中的发酵培养条件为 ： 摇瓶培养的温度为 30， 搅拌转数为 200rpm， 接种量为 5， 种龄为 16 小时。 4. 权利要求 2 的方法， 其中发酵培养条件为 ： 200rpm， 30， 培养 16 小时。 5. 权利要求 2 的方法， 其中发酵培养基中还含有 1.25mmol/L 的 Zn2+和 1.25mmol/L 的 Fe2+。 6. 权利要求 2 的方法， 其中发酵培养基中还含有谷氨酸、 丝氨酸、 蛋氨酸、 甘氨酸中的 一种或几种。 权 利 要 求 书 CN 101805704 B 2 1/7 页 。

6、3 一种高产核糖核酸的热带假丝酵母及应用 技术领域 0001 本发明涉及生物医药领域， 具体涉及一种高产核糖核酸 (RNA) 的热带假丝酵母菌 株 (Candida tropicalis) 以及利用该菌株高产 RNA 的应用。 背景技术 0002 核糖核酸(ribonucleic acid， RNA)是生物体内的高分子化合物， 广泛存在于所有 动物、 植物细胞、 微生物体内， 常与蛋白质结合形成核蛋白， 对维持机体的正常功能有重要 作用， 是特定生理条件下不可缺少的营养成分。核酸可分为核糖核酸 (RNA) 和脱氧核糖核 酸， 简称 DNA， DNA 是储存、 复制和传递遗传信息的主要物质基础，。

7、 而 RNA 在蛋白质合成过程 中起着重要作用。外源性核酸在机体营养、 免疫调节和疾病防治等方面都有一定的功能。 0003 RNA 最大的应用是作为用分解法生产 5 - 核苷酸的工业原料。核糖核酸及其酶分 解产物腺苷酸、 胞苷酸， 鸟苷酸， 尿苷酸等在医药、 食品、 化妆品以及农业等行业中具有重要 的用途。 近年一些研究表明核糖核酸及其酶解物核苷酸具有维持机体免疫功能、 抗氧化、 提 高机体蛋白质和铁的生物利用率、 降低胆固醇和抗衰老等多种生理功能。核酸的国内外需 求量巨大， 预计仅国内用量就在 1000 吨以上， 国外用量在数千吨以上。目前国内 RNA 最大 生产量仅维持在 200 吨左右，。

8、 仅能生产 100 吨核苷酸， 远不能满足市场需求。因此， 核糖核 酸的开发研究越来越受到重视。 0004 RNA 的来源， 与动植物相比， 微生物体内的蛋白质生物合成非常活跃， 含有丰富的 RNA。 关于微生物菌体内RNA的含量， 自1940年以来， 有许多报道， 而其中酵母菌的RNA含量 是相对较高的， 因此 RNA 的制备大多数以酵母菌为原料， 常用的菌种为酿酒酵母， RNA 含量 可达37。 日本的山口等研究人员(参考文献 ： 山口和夫， 三上忠义， 茨大农学术报告， 13， 69， 1965) 用含有 2葡萄糖的合成培养基研究比较了数十种酵母属， 结果发现， 假丝酵 母属的酵母菌体内。

9、RNA积累能力为最佳， 而菌体中RNA含量在对数生长期末为最高， 且因糖 的种类不同所引起的差异较小， 无机氮源以硫酸铵而有机氮源以蛋白胨、 酵母浸出液为佳。 0005 目前用微生物生产的核苷酸及其衍生物有60多种， 而微生物发酵法制备RNA的工 业也日渐发展。在日本， 自 1962 年以后有三个工厂利用亚硫酸纸浆废液、 一个工厂利用糖 蜜生产酵母， 年产干燥酵母 1 2 万吨， 酵母 RNA 含量分别为 10， 15左右。在我国， 通过 对石油酵母石油发酵脱蜡的进一步研究， 汪猷， 王大琛， 李祥鹏等取得了 “生产核酸和饲料 蛋白的高产核酸酵母” 研究成果， 于 1985 年获中科院科技进步。

10、一等奖。他们通过对解脂假 丝酵母 Y-17 菌株的诱变和处理， 得到氯化钾敏感株 K-79， 使其核糖核酸含量从 5.5达到 11.6， 又通过优化培养基和培养条件使其核糖核酸含量达到13.5。 为了适应K-79菌株 连续培养和高供氧的要求， 还专门设计了实验室用的容量 60L 的内循环气升式发酵设备， 结构简便、 易于放大。每生产 1 吨高核酸酵母， 可得工业级 RNA 80kg 和脱核酸酵母 700kg。 取得建厂投产所需的技术数据。1984 年此项技术推广应用到福建莆田糖厂， 促进建立年产 1500 吨核酸酵母 ( 即可年产 150 吨核糖核酸 ) 的厂房， 生产至今长盛不衰。 说 明 。

11、书 CN 101805704 B 3 2/7 页 4 发明内容 0006 本发明通过将热带假丝酵母 ATCC14246 进行诱变筛选， 得到一株高产 RNA 的热带 假丝酵母菌株， 简称 CPU-1， 它不但核酸含量很高并且具有解脂假丝酵母可利用石蜡油为碳 源的特征。本发明通过优化其发酵培养基和发酵培养条件， 使该菌株的 RNA 产量有效提高， 可应用于核酸的工业化生产。 0007 本发明的可高产 RNA 的热带假丝酵母菌株 CPU-1(Candida tropicalis， CPU-1)， 已于 2009 年 12 月 30 号在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心提交保藏， 保藏 号。

12、为 ： CGMCCNo.3558。 0008 本发明以实验室保藏的热带假丝酵母 ATCC14246 为原始菌株， 先利用以石蜡油为 碳源的发酵培养基培养出能够利用石蜡油的酵母菌， 用稀释平板法纯化出单菌落作为诱变 的出发菌株。根据一定范围内不同浓度和时间梯度的 NTG 致死率曲线， 得到合适的诱变条 件后， 用一定浓度的 NTG 对出发菌株进行诱变。由于本菌株有对高浓度氯化钾敏感的特性， 所以用影印平板法进行筛选出氯化钾敏感菌株， 接着再将它们进行 3 次紫外诱变， 最后得 到一株 RNA 含量可达到 16的菌株 CPU-1， 较原始菌株热带假丝酵母 ATCC14246 的核糖核 酸含量提高了。

13、 3 倍以上。 0009 在此诱变筛选的过程中， 所用的培养基为以下几种。氯化钾敏感性筛选培养基 A ： 葡萄糖 3， 牛肉膏 0.3， 酵母膏 0.3， 尿素 0.5， FeSO47H2O 0.01， 琼脂 2.5 ； 氯 化钾敏感性筛选培养基 B 为 ： 培养基 A 中加入 1.5mol/L KCl ； 分离单菌落的平板培养基及 斜面培养基 C ： 葡萄糖 3， 牛肉膏 0.3， 酵母膏 0.3， 尿素 0.5， FeSO47H2O 0.01， 琼脂 2.5； 利用石蜡油菌株的筛选培养基 D ： 石蜡油 1， (NH4)2SO41.5， KH2PO4 0.9， K2HPO40.3， MgS。

14、O47H2O 0.3， FeSO47H2O 0.003， 酵母膏 0.3， 玉米浆 0.3 ； 种 子培养基 S ： 葡萄糖 4， (NH4)2SO4 1.5， KH2PO4 0.9， K2HPO4 0.3， MgSO47H2O 0.3， FeSO47H2O 0.003， 酵母膏 0.3， 玉米浆 0.3， CaCO30.5； 筛选发酵培养基 M ： 石蜡油 1， 尿素 0.8， 80磷酸 0.3， KCl 0.15， MgSO47H2O 0.1， FeSO47H2O 0.003， CaCl22H2O 0.01， NaCl 0.1， 酵母膏 0.3， 玉米浆 0.3。 0010 具体地， 此诱。

15、变筛选的方法为， 首先将热带假丝酵母ATCC14246于培养基D中28 培养 16 18 小时后挑取单菌落， 该菌落即为可利用石蜡油的菌株， 它作为诱变的出发菌 株。 接着， 用0.5mg/ml亚硝基胍(NTG)在30诱变45min， 也可以用1.5mg/ml或2.0mg/mNTG 诱变 30min， 用影印平板法筛选出一株核酸含量达 10的氯化钾敏感菌株 D12， 此处的影印 平板法为 ： 在培养基A和B两块平皿的相同位置接种该菌， 如果该菌株是对氯化钾的敏感菌 株， 则会只在 A 平板上生长， 不在 B 平板上生长， 如果该菌株对氯化钾不敏感， 则会在 A 和 B 平板上都生长。然后， D。

16、12 再通过三次紫外诱变， 照射时间为 60s， 筛选出一株核酸含量可高 达16的KCl敏感菌株菌株CPU-1， 它同时还具有解脂假丝酵母的特征， 可利用石蜡油为碳 源， 其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为 ： CGMCC No.3558。 0011 该菌株具有以下特征 ： 0012 1. 菌落形态特征 ： 见附图 1。如图 1 所示， 在酵母浸出粉胨葡萄糖培养基 (YPD 培 养基 ： 酵母粉 1， 葡萄糖 2， 蛋白胨 2 ) 的琼脂培养基上菌落为白色到奶油色， 无光泽 或稍有光泽， 黏湿， 软而平滑或部分有皱纹， 易被挑起。 0013 2. 菌体形态特征 ： 在 Y。

17、PD 液体培养基中培养， 28， 3 天， 细胞呈球形或卵球， 大小 说 明 书 CN 101805704 B 4 3/7 页 5 为 4 86 11m。 0014 3. 菌株的生长及核酸含量曲线 ： 见附图 2。如图 2 所示， 0 12h 为菌生长的对数 期， 培养基中的葡萄糖含量急剧下降， 菌浓也快速增长， pH 下降， 而核酸增长则较平稳 ； 12h 以后， 菌进入稳定期， 葡萄糖基本消耗完毕， 菌体总量的增长幅度不再显著， 核酸的含量与 对数生长期相比有主见降低的趋势。这是因为在 RNA 聚合酶的活性在酵母对数生长期较 高， 经过了对数生长期以后， 随着时间的增加， RNA 聚合酶活。

18、性降低， 所以菌体内 RNA 的含量 变少。而酵母菌在生长过程中代谢产生有机酸使培养液 pH 下降。因此在保持较高菌浓的 前提下， 确定种子培养和发酵培养的时间为10-12h。 且在间歇发酵过程中， 酵母菌的比生长 速率 最大可达到 0.5h-1。 0015 本发明利用上述高产核酸的热带解脂假丝酵母 CPU-1 高产核酸的培养方法包括 ： 在种子培养基中培养 CPU-1 菌株， 在培养后将菌液转接发酵培养基中发酵培养即得。 0016 进一步地， 在种子培养基中培养 CPU-1， 在一定培养条件下培养一定时间后将菌液 转接发酵培养基。在优化的发酵培养基中以一定的发酵培养条件培养该菌株， 培养基的。

19、优 化包括碳源的组成和葡萄糖的浓度， 氮源中有机氮和无机氮的成分和浓度， 无机磷的浓度， 以及碳、 氮、 磷源的比例和所添加的金属离子的浓度。并通过添加不同氨基酸来提高该菌 株体内 RNA 含量。 0017 优选的种子培养基含 ： 葡萄糖 4、 (NH4)2SO4 1.5、 KH2PO4 0.9、 K2HPO4 0.3、 MgSO47H2O 0.3、 FeSO47H2O 0.003、 酵母膏 0.3、 玉米浆 0.3和 CaCO30.5， 为重 量百分比。培养基基质为水。 0018 优选的种子培养基中的发酵培养条件为 ： 摇瓶培养的温度为 30， 搅拌转数为 200r/min， 接种量为 5，。

20、 种龄为 16 小时。 0019 优选的发酵培养基的组成为 ： 葡萄糖 5、 酵母膏 1.2、 玉米浆 0.9、 (NH4)2SO4 1.0、 KH2PO4 0.3。培养基基质为水。 0020 优选的发酵培养条件为 ： 200rpm， 30， 培养 16 小时。 0021 其中发酵培养基还应有适当的碳源和氮源的比例， 碳源为 5葡萄糖， 氮源为 1.2的酵母膏、 0.9的玉米浆和 1.0的 (NH4)2SO4。而在氮源中， 有机氮和无机氮的比例 为21， 有机氮为1.2的酵母膏和0.9的玉米浆的组合， 无机氮为1.0的(NH4)2SO4。 0022 其中发酵培养基中还优选含有 1.25mmol。

21、/L 的 Zn2+和 Fe2+。金属离子的加入有助 于本发明菌株体内 RNA 含量的积累且菌体浓度保持稳定水平。 0023 培养基中还含有谷氨酸 (Glu)、 丝氨酸 (Ser)、 蛋氨酸 (Met)、 甘氨酸 (Gly) 中的一 种或几种。 0024 研究发现， 添加不同氨基酸可以提高CPU-1菌株体内RNA含量， 单独添加Glu、 Ser、 Met、 Gly 分别使 RNA 含量提高 42、 56、 45、 18， 而添加氨基酸混合物可使 RNA 含量提 高 85， 添加蛋白胨则可使 RNA 含量提高 90。 0025 RNA 含量的测定方法如下 ： 取 10ml 发酵菌液进行离心 800。

22、0rpm， 10min， 弃去上清， 称菌体湿重。用 10ml 生理盐水悬浮细胞， 离心 8000rpm， 10min， 再用生理盐水悬浮后取 2ml 菌悬液于干净试管， 再加入2ml高氯酸， 70水浴20min， 水浴过程中每5min震荡一次， 水浴 后取 1ml 加入 EP 管中混匀， 用紫外分光光度计于 260nm 处测 OD。RNA 含量测定的公式为 ： 说 明 书 CN 101805704 B 5 4/7 页 6 0026 其中， A 为 OD260吸光值， 32 为文献单位光吸收值， W 为菌体湿重 gL-1， R 为酵母菌 的干湿重比。 0027 本发明通过将热带假丝酵母 ATC。

23、C14246 进行诱变筛选， 得到一株高产 RNA 的热带 假丝酵母菌株 CPU-1， 它是一株 RNA 含量很高并具有解脂假丝酵母可利用石蜡油为碳源的 特征。本发明又通过优化其发酵培养基和发酵培养条件等， 使此菌株的产 RNA 能力有效提 高， 可应用于核酸的工业化生产。 附图说明 0028 图 1 热带假丝酵母菌株 CPU-1 的菌落形态 0029 图 2 热带假丝酵母菌株 CPU-1 的菌株生长与核酸含量曲线 0030 图 3 不同碳源对 CPU-1 体内积累 RNA 的影响 0031 图 4 不同葡萄糖浓度对 CPU-1 体内积累 RNA 的影响 0032 图 5 不同无机氮对 CPU。

24、-1 体内积累 RNA 的影响 0033 图 6 不同硫酸铵浓度对 CPU-1 体内积累 RNA 的影响 0034 图 7 不同有机氮对 CPU-1 体内积累 RNA 的影响 0035 图 8 不同无机磷 ( 磷酸二氢钾 ) 浓度对 CPU-1 体内积累 RNA 的影响 0036 图 9 不同金属离子及其不同浓度对 CPU-1 体内积累 RNA 的影响 0037 图 10 添加不同氨基酸对 CPU-1 菌体 RNA 积累的影响 具体实施方式 0038 实施例 1 0039 高产核糖核酸 (RNA) 的热带假丝酵母菌株的筛选 0040 1.1. 菌种 0041 热带假丝酵母 (Candidatr。

25、opicalis)， ATCC14246， ( 购自美国标准菌种收藏所 )， 本实验室保藏 0042 1.2. 培养基 0043 (1)氯化钾敏感性筛选培养基A() ： 葡萄糖3， 牛肉膏0.3， 酵母膏0.3， 尿素0.5， FeSO47H2O0.01， 琼脂 2.5 ； 氯化钾敏感性筛选培养基 B ： 培养基 A 中加入 1.5mol/L KCl 0044 (2) 种子培养基 S( ) ： 葡萄糖 4， (NH4)2SO41.5， KH2PO40.9， K2HPO40.3， MgSO47H2O 0.3， FeSO47H2O 0.003， 酵母膏 0.3， 玉米浆 0.3， CaCO30.5。

26、 0045 (3) 筛选发酵培养基 M( ) ： 石蜡油 1， 尿素 0.8， 80磷酸 0.3， KCl 0.15， MgSO47H2O 0.1， FeSO47H2O 0.003， CaCl22H2O 0.01， NaCl 0.1， 酵母膏 0.3， 玉米浆 0.3 0046 (4) 分离单菌落的平板培养基及斜面培养基 C( ) ： 葡萄糖 3， 牛肉膏 0.3， 酵母膏 0.3， 尿素 0.5， FeSO47H2O 0.01， 琼脂 2.5 0047 (5) 利用石蜡油菌株的筛选培养基 D( ) ： 石蜡油 1， (NH4)2SO41.5， KH2PO40.9， K2HPO40.3， Mg。

27、SO47H2O 0.3， FeSO47H2O 0.003， 酵母膏 0.3， 玉米浆 0.3 0048 1.3. 菌体诱变筛选方法 说 明 书 CN 101805704 B 6 5/7 页 7 0049 将热带假丝酵母 ATCC14246 于培养基 D 中 28培养 16 18 小时后挑取单菌落， 该菌落 即为可利用石蜡油的菌株， 它作为诱变的出发菌株。接着， 用 0.5mg/ml 亚硝基胍 (NTG) 在 30诱变 45min， 也可以用 1.5mg/ml 或 2.0mg/mNTG 诱变 30min， 用影印平板法筛 选出一株核酸含量达10的氯化钾敏感菌株D12， 此处的影印平板法为 ： 在。

28、培养基A和B两 块平皿的相同位置接种该菌， 如果该菌株是对氯化钾的敏感菌株， 则会只在 A 平板上生长， 不在 B 平板上生长， 如果该菌株对氯化钾不敏感， 则会在 A 和 B 平板上都生长。然后， D12 再通过三次紫外诱变， 照射时间为 60s， 筛选出一株核酸含量可高达 16的氯化钾敏感菌 株菌株 CPU-1， 于 2009 年 12 月 30 号在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心提 交保藏， 保藏号为 ： CGMCC No.3558。 它同时还具有解脂假丝酵母的特征， 可利用石蜡油为碳 源。 0050 1.4. 所筛选出来的解脂假丝酵母 CPU-1 具有以下特征 ： 0051。

29、 (1) 菌落形态特征 ： 见附图 1。如附图 1 所示， 在 YPD 琼脂培养基上菌落为白色到 奶油色， 无光泽或稍有光泽， 黏湿， 软而平滑或部分有皱纹， 易被挑起。 0052 (2)菌体形态特征 ： 在YPD液体培养基中培养， 28， 3天， 细胞呈球形或卵球， 其中 大小为 4 86 11m。 0053 (3) 菌株的生长及核酸含量曲线 ： 见附图 2。如图所示， 0 12h 为菌生长的对数 期， 培养基中的葡萄糖含量急剧下降， 菌浓也快速增长， pH 下降， 而核酸增长则较平稳 ； 12h 以后， 菌进入稳定期， 葡萄糖基本消耗完毕， 菌体总量的增长幅度不再显著， 核酸的含量与 对数。

30、生长期相比有主见降低的趋势。这是因为在 RNA 聚合酶的活性在酵母对数生长期较 高， 经过了对数生长期以后， 随着时间的增加， RNA 聚合酶活性降低， 所以菌体内 RNA 的含量 变少。而酵母菌在生长过程中代谢产生有机酸使培养液 pH 下降。因此在保持较高菌浓的 前提下， 确定种子培养和发酵培养的时间为10-12h。 且在连续发酵过程中， 酵母菌的比生长 速率 最大可达到 0.5h-1。 0054 实施例 2 0055 热带假丝酵母菌株 CPU-1 高产 RNA 的培养基 0056 1. 种子培养基 ( ) ： 葡萄糖 4， (NH4)2SO41.5， KH2PO40.9， K2HPO40.。

31、3， MgSO47H2O 0.3， FeSO47H2O 0.003， 酵母膏 0.3， 玉米浆 0.3， CaCO30.5。200rpm， 30培养 16 小时。发 酵培养条件为 ： 摇瓶培养的温度为 30， 搅拌转数为 200r/min， 接种量为 5， 种龄为 16 小 时。 0057 2. 优化的发酵培养基 ( ) ： 葡萄糖 5， 酵母膏 1.2， 玉米浆 0.9， (NH4)2SO41.0， KH2PO40.3。发酵培养条件为 ： 200rpm， 30， 培养 16 小时。 0058 实施例 3 0059 高产核糖核酸热带解脂假丝酵母发酵培养基的优化 0060 3.1. 培养基 00。

32、61 3.1.1. 种子培养基 ( ) ： 见实施例 2 0062 3.1.2. 摇瓶发酵培养基 ( ) ： 葡萄糖 4， 80磷酸 0.3， (NH4)2SO40.5， KCl 0.15， MgSO47H2O0.1， FeSO47H2O 0.003， CaCl22H2O 0.01， NaCl 0.1， 酵母膏 0.3， 玉米浆 0.3 0063 3.2. 培养基的优化 0064 碳源的优化 ： 将 CPU-1 从种子斜面培养基上转接入 50ml 种子液体培养基中， 说 明 书 CN 101805704 B 7 6/7 页 8 200rpm、 30摇瓶培养 16h。按 5接种量接种于 100m。

33、l 摇瓶发酵培养基中， 分别以山梨醇、 果糖、 蔗糖、 糊精、 葡萄糖、 乳糖和半乳糖为唯一碳源， 200rpm、 30摇瓶培养 16h， 测定 RNA 含量(附图3) ； 结果是选择葡萄糖为碳源。 又配制了从1到10不同葡萄糖浓度的10种 培养基， 将 CPU-1 进行摇床发酵培养， 测定 RNA 含量 ( 附图 4)， 结果选择 4的葡萄糖浓度 作为碳源。 0065 氮源的优化 ： 实验中， 用氯化铵、 硝酸铵、 磷酸氢二铵、 尿素、 硫酸铵 5 种无机氮源， 经 24 小时摇床培养后， 测定菌体湿重和 RNA 含量 ( 附图 5)。结果选择用硫酸铵作为无机 氮源。又测定了不同硫酸铵浓度对。

34、菌体湿重和 RNA 含量的影响 ( 附图 6)， 结果选择 2.0 的浓度。而有机氮源对发酵的影响， 则用酵母膏 + 玉米浆、 酵母膏、 玉米浆、 牛肉膏、 蛋白胨、 大豆蛋白胨对酵母菌积累 RNA 的影响作了 6 组实验， ( 附图 7) 结果选择酵母膏作为有机氮 源。 0066 无机磷浓度的优化 ： 在磷酸二氢钾浓度0.54.0之间设8个不同浓度来测定 磷酸二氢钾浓度对菌体湿重和 RNA 含量的影响 ( 附图 8)， 结果选择 0.5的磷酸二氢钾作 为磷源。 0067 金属离子浓度的优化 ： 通过在发酵培养基中添加不同金属离子， 浓度分别为 0mmol/L， 1.25mmol/L， 2.5。

35、mmol/L， 3.75mmol/L， 5.0mmol/L. 分别添加 Mn2+， Mg2+， Co2+， Fe2+， Fe3+， Zn2+， 结果 ( 附图 9) 证明添加 1.25mmol/L 的 Zn2+和 Fe2+有助于酵母菌 RNA 含量的积 累且菌体浓度保持稳定水平。 0068 正交优化实验 ： 选择葡萄糖 (A)、 酵母膏 (B)、 磷酸二氢钾 (C)、 硫酸铵 (D)、 玉米浆 (E) 五个因素， 分别以不同浓度选择四个水平确定正交实验设计方案 ( 见表 1)。 0069 将 CPU-1 从种子斜面培养基上转接入 50ml 种子液体培养基中， 200rpm、 30摇瓶 培养 1。

36、6h。按表 1 中的设计， 以 5接种量接种于 100ml 摇瓶发酵培养基， 结果见表 2。 0070 因此， 通过单因素实验研究了碳源、 氮源、 磷源种类和浓度对发酵产 RNA 的影响， 并且用正交试验确定了最优培养基为 ： 葡萄糖 5， 酵母膏 1.2， 磷酸二氢钾 0.3， 硫 酸铵 1.0， 玉米浆 0.9， 200rpm、 30摇瓶培养 16h， RNA 含量达到 12左右， 湿重达到 50g/L。 0071 表 1 正交实验设计方案 0072 0073 注 ： A葡萄糖 B酵母膏 C酸铵 D磷酸氢二钾 E玉米浆 0074 表 2 正交实验结果 0075 说 明 书 CN 10180。

37、5704 B 8 7/7 页 9 0076 实施例 4 0077 添加不同氨基酸对酵母菌体 RNA 积累的影响 0078 通过在培养基中添加不同的氨基酸组分， 进一步分析不同单一氨基酸组分 (His、 Glu、 Ser、 Met、 Gly、 mix of amino acids、 peptone) 对酵母湿重及 RNA 水平的影响。单一 组分的添加量根据 20g 蛋白胨中含有的单一氨基酸含量进行添加。结果如附图 10 所示 . 0079 由附图 10 可见， 除 His 外， 单一组分的氨基酸对菌体内 RNA 积累有一定的促进 作用， 蛋白胨促进作用更明显， 能使 RNA 含量增加 90左右，。

38、 Glu(42 )， Ser(56 )， Met(45 )， Gly(18 ) 或者氨基酸混合物 (85 )。 说 明 书 CN 101805704 B 9 1/5 页 10 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 101805704 B 10 2/5 页 11 图 3 图 4 图 5 说 明 书 附 图 CN 101805704 B 11 3/5 页 12 图 6 图 7 说 明 书 附 图 CN 101805704 B 12 4/5 页 13 图 8 图 9 说 明 书 附 图 CN 101805704 B 13 5/5 页 14 图 10 说 明 书 附 图 CN 101805704 B 14 。