真核生物翻译起始因子4H（eIF4H）基因沉默抑制肿瘤细胞生长的方法及其应用.pdf

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1、(10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201310251785.5 (22)申请日 2013.06.21 C12N 15/113(2010.01) C12N 15/85(2006.01) C12N 15/867(2006.01) C12N 1/21(2006.01) C12N 5/10(2006.01) A61K 48/00(2006.01) A61P 35/00(2006.01) A61P 35/02(2006.01) (73)专利权人 浙江理工大学 地址 310000 浙江省杭州市下沙高教园区西 区 (72)发明人 张世馥 薛建有 桑婷婷 戚武林 朱晓芳 张辛皎 赵辅昆 。

2、(74)专利代理机构 北京三高永信知识产权代理 有限责任公司 11138 代理人 何文彬 CN 101928333 A,2010.12.29, 全文 . WO 2007119692 A1,2007.10.25, 全文 . WO 2005083444 A1,2005.09.09, 全文 . 涂露霞等 . 慢病毒介导的 siRNA 靶向干扰 EIF4G1 鼻咽癌稳定细胞株的建立 .南方医科大 学学报 .2009, 第 29 卷 ( 第 5 期 ),844-849. (54) 发明名称 真核生物翻译起始因子 4H（eIF4H） 基因沉默 抑制肿瘤细胞生长的方法及其应用 (57) 摘要 本 发 明 涉。

3、 及 真 核 生 物 翻 译 起 始 因 子 4H （eIF4H） 基因沉默抑制肿瘤细胞生长的方法及其 应用。具体地， 本发明以真核生物翻译起始因子 4H（eIF4H） 为靶基因， 利用慢病毒介导的 RNA 干 扰技术使该基因沉默， 创建了一个能够在体外有 效的抑制小鼠血癌细胞生长的方法。该方法为白 血病的发生和细胞分化机理的研究提供了新的视 角， 为抗肿瘤药物的研究提供了潜在的靶点。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 汪未申 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书1页 说明书6页 附图2页 (10)授权公告号 CN 103421792 B (45)。

4、授权公告日 2015.03.25 CN 103421792 B 1/1 页 2 1. 含有 eIF4H 干扰靶位点 CTATCTTTAAGGATCTCAGCA 的寡核苷酸， 其是 5 -CCGGCTATCTT TAAGGATCTCAGCACTCGAGTGCTGAGATCCTTAAAGATAGTTTTTG-3 ， 或是 5 -AATTCAAAAACTATCTTTAAGGATCTCAGCACTCGAGTGCTGAGATCCTTAAAGATAG-3 。 2. 质粒， 其含有权利要求 1 中所述的寡核苷酸。 3. 微生物， 其含有权利要求 1 中所述的寡核苷酸。 4. 权利要求 3 的微生物， 其为慢。

5、病毒。 5. 含有权利要求 2 的质粒的重组大肠杆菌。 6. 含有权利要求 2 所述质粒的重组 MEL 细胞株。 7. 权利要求 1 的寡核苷酸在制备用于通过基因沉默抑制肿瘤细胞生长的药物中的用 途。 8. 根据权利要求 7 的用途， 其中所述的肿瘤细胞是白血病细胞。 权 利 要 求 书 CN 103421792 B 2 1/6 页 3 真核生物翻译起始因子 4H（eIF4H） 基因沉默抑制肿瘤细胞 生长的方法及其应用 技术领域 0001 本发明涉及一种新型的抑制肿瘤细胞生长的方法， 该方法能够在体外抑制小鼠血 癌细胞的生长。该方法为白血病的发生和细胞分化机理的研究提供了新的视角， 为抗肿瘤 。

6、药物的研究提供了潜在的靶点。 背景技术 0002 白血病是一类严重的血液恶性肿瘤， 在各类癌症中发病率较高。研究表明白血病 的发生是造血祖细胞分化和凋亡紊乱所致。 正常造血祖细胞程序性分化过程是受到一系列 因子的严格调控， 如果造血祖细胞失去了对调控因子的正常应答， 就可能会引起细胞去分 化和增殖失控。 0003 利用基因沉默的方法可在 mRNA 和蛋白质水平降低目的基因表达， 从而下调肿 瘤发生相关的一些基因的异常表达来达到治疗肿瘤的目的。真核生物翻译起始因子 4H(eukaryotic translation initiation factor4H， eIF4H) 是一个核糖体的翻译起始蛋。

7、 白， 可促进的蛋白质的合成。 而对蛋白质合成的调控往往与细胞增殖、 分化乃至肿瘤的发生 密切相关， 因此 eIF4H 是一个潜在抗肿瘤的治疗靶点。 0004 eIF4H 在进化过程中具有高度的保守性， 对基因和蛋白质同源性的研究发现人和 鼠的亚型 II 的同源性分别为 91.4% 和 99.1%。eIF4H 通过选择性的剪接 5 位外显子产生两 个蛋白亚型， 亚型含 248 个氨基酸， 约 27kDa， 亚型含 228 个氨基酸， 约 25kDa， 在小鼠中 两个亚型的表达量相近。eIF4H 通过调控 cyclin D1 的表达来促进细胞增殖。在常见人肿 瘤细胞中， eIF4H 均有较高表达。

8、。 0005 慢病毒介导的 RNA 干扰技术可将外源基因有效地整合到宿主染色体上， 高效持久 的实现特定基因的下调表达。 含有干扰序列的慢病毒质粒载体可在宿主细胞内稳定表达小 发夹结构的 shRNA， shRNA 在细胞内进一步加工成 siRNAs， 从而干扰目的基因， 造成 RNA 水 平上的基因沉默。 0006 本发明构建了针对 eIF4H 的 RNA 干扰质粒， 通过与两个慢病毒包装质粒共转染人 肾胚细胞 293T 细胞获得可使 eIF4H 低表达的慢病毒， 慢病毒侵染鼠红白血病细胞 MEL 细胞 系， 有效抑制了血癌细胞的生长， 并可促进红系分化进程。 发明内容 0007 本发明以真核。

9、生物翻译起始因子 4H（eIF4H） 为靶基因， 利用慢病毒介导的 RNA 干 扰技术使该基因沉默， 创建了一个有效的抑制体外肿瘤细胞生长的方法。 0008 本发明发现 eIF4H 在丁酸钠或六甲基烯二乙酰胺 （HMBA） 诱导 MEL 细胞红系分化 过程中表达下调。在 eIF4H 基因的编码区选取翻译起始位点后的第 179 199bp 作为干扰 靶位点， 合成了可形成小发夹 shRNA 的寡聚核苷酸序列， 通过分子生物学方法获得了含有 该 shRNA 的真核干扰质粒。将干扰质粒与两个病毒包装质粒共同转染入人肾胚细胞 293T 说 明 书 CN 103421792 B 3 2/6 页 4 细胞。

10、系以获得可使 eIF4H 低表达的慢病毒。然后将慢病毒侵染鼠红白血病 MEL 细胞， 经嘌 呤霉素筛选得到稳定株。蛋白质印迹分析技术显示， 干扰细胞株中 eIF4H 蛋白表达量明显 下降， 表明 eIF4H 基因被有效的沉默了。通过 MTT 分析， 发现低表达 eIF4H 的 MEL 细胞的生 长速度明显低于对照组 ； 利用流式细胞术分析了细胞周期， 结果显示MEL细胞在eIF4H基因 沉默后 S 期细胞减少， G1期细胞增多 ； 利用联苯胺染色对红系分化进行分析， eIF4H 低表达 促进 MEL 细胞红系分化进程。以上三个实验结果表明 eIF4H 基因沉默后， MEL 细胞的增殖 受到抑制。

11、。 0009 本发明提出的技术路线可以进一步应用于不同组织来源的肿瘤细胞和不同的肿 瘤相关基因， 可以用来研究肿瘤的发生机制， 寻找用于抗肿瘤的基因治疗的理想靶点。 附图说明 ： 0010 下面结合附图对本发明作进一步详细描述。 0011 图 1 ： eIF4H 在丁酸钠或 HMBA 诱导 MEL 细胞红系分化过程中表达下调 ； 0012 图 2 ： 本发明中选择的干扰靶位点 ； 0013 图 3 ： eIF4H 基因沉默 MEL 细胞稳定株的建立 ； 0014 图 4 ： eIF4H 基因沉默后 MEL 细胞的生长速度明显低于对照组 ； 0015 图 5 ： eIF4H 基因沉默后 MEL 。

12、细胞中 S 期细胞减少， G1期细胞增多 ； 0016 图 6 ： eIF4H 基因沉默后促进了 MEL 细胞的红系分化进程。 0017 下面将通过借助以下实施例来更详细地说明本发明。以下实施例仅是说明性的， 应该明白， 本发明并不受下述实施例的限制。 具体实施方式 0018 在下面的实施例中进一步说明了本发明， 但并不限制本发明的范围。 0019 实施例 1 0020 免疫印迹法检测 eIF4H 在丁酸钠或 HMBA 处理的 MEL 细胞中的表达变化 0021 收集HMBA或丁酸钠处理不同时间 （0， 6， 12， 24， 36， 48， 72， 96和120h） 的MEL细胞， 提取总蛋白。

13、， 采用 Brandford 法进行蛋白浓度测定。取 30g 总蛋白， 用 12% 的分离胶进行 蛋白分离。通过湿转的方式将分离的蛋白样品转移到 PVDF 膜上， 用 5% 的脱脂奶粉室温封 闭 2h。分别加入兔抗小鼠 eIF4H 单克隆抗体 （1:2,000 稀释） 、 小鼠抗人 -actin 单克隆抗 体 （1:20,000 稀释） 和兔抗小鼠 GAPDH 抗体 （1 ： 10,000 稀释） 4孵育过夜， 经 PBST 洗涤后 加入 （带有辣根过氧化物酶标记的） 山羊抗兔二抗 （1:5000 稀释） 和羊抗小鼠二抗 （1:5,000 稀释） 37孵育 1h， 洗涤后用化学发光法进行显色反。

14、应。 0022 实施例 2 0023 本发明中使用的寡核苷酸序列及用途 说 明 书 CN 103421792 B 4 3/6 页 5 0024 0025 实施例 3 0026 真核干扰质粒的构建 0027 加去离子水溶解寡核苷酸至终浓度为 20M， 取 RNAi-F 和 RNAi-R 各 5l 与 5l10NEB Buffer2 混合后加 35l 去离子水至反应体系 50l。沸水浴中缓慢冷却至 室温使之形寡核苷酸双链。 0028 将寡核苷酸双链与经 Age 和 EcoR 酶切的 PLKO.1-TRC 载体连接形成重组质粒 PLKO.1-eIF4H， 转化感受态DH5细菌， 然后涂布于含氨卞青霉。

15、素的LB固体培养基上， 37度 培养 12 小时。挑选单克隆进行酶切鉴定 （由于寡核苷酸的插入后导致载体上的 Age 和 EcoR 酶切位点遭到破坏， 固选用 EcoR 和 Nco 作双酶切鉴定） 。获得阳性克隆后于 LB 液体培养基中进一步扩大培养， 提取质粒， 通过测序确定插入片段是否正确， 测序引物为 5 -CAAGGCTGTTAGAGAGATAATTGGA-3 。将测序正确的 PLKO.1-eIF4H 菌液冻存备用。实验 以 “PLKO.1- 载体对照” 作为载体对照，“载体对照” 为一段打乱寡核苷酸， 在细胞内没有靶 向基因。 0029 实施例 4 0030 质粒 DNA 的大量制备。

16、 （碱裂解法大量制备质粒） 0031 1) 分别收集过夜培养的含 PLKO.1-eIF4H、 PLKO.1- 载体对照、 pCMV-VSVG 和 pCMV-dR8.2( 为两个慢病毒包装质粒 ) 的菌液 100ml， 4 7500rpm 离心 15min， 弃去上清。 0032 2) 加 6ml 预冷的碱裂解溶液充分重悬菌体， 使其完全分散后移入 50ml 离心管 中。 0033 3) 加 12ml 碱裂解溶液室温轻轻颠倒数次混匀， 室温放置 5min， 使菌体完全裂 解， 溶液变透明。 0034 4) 加 9mL 预冷碱裂解溶液， 立即轻轻颠倒混匀， 至白色絮状物产生， 冰上放置 10 15。

17、min。 0035 5)12000rpm， 4离心 10min， 小心吸取上清， 加 0.6 倍体积异丙醇， 轻轻颠倒混匀， 室温放置 10min。 0036 6)12000rpm， 4离心 10min， 弃去上清， 加 70% 乙醇洗涤沉淀和管壁一次， 室温干 燥使乙醇挥发干净。 0037 7)沉淀加400l TE （PH8.0） 充分溶解， 转移至1.5ml离心管中， 加400l5M LiCl 轻轻颠倒混匀。 说 明 书 CN 103421792 B 5 4/6 页 6 0038 8)12000rpm， 4离心 10min， 上清转移至另一离心管中， 加等量异丙醇充分混 匀， 20沉淀 1。

18、5min。 0039 9)12000rpm， 4离心 10min， 弃上清， 加 70% 乙醇洗涤沉淀， 干燥使乙醇挥发干净。 0040 10) 依次加入 500l TE 和 250l RNAse（1mg/ml） 37孵育 30min 除去 RNA。 0041 11) 加等体积含 13%（m/v） PEG8000 的 1.6M NaCl 充分混匀， 冰上沉淀 1h。 0042 12)12000rpm， 4离心 10min， 弃上清， 加 400l TE， 37水浴 1h 溶解质粒。 0043 13) 加等量苯酚 （24） : 氯仿 （25） : 异戊醇 （1） 12000rpm， 4离心 10。

19、min 抽提 ； 再 用氯仿抽提一次。 0044 14) 上清水相转移至另一离心管中， 加 1/10 体积 3M 醋酸钠 （PH5.2） 充分混匀， 再 加入 2 倍体积无水乙醇。 0045 15)12000rpm， 4离心 5min， 弃上清， 加 200l70% 乙醇洗涤一次。 0046 16) 加 100 200l TE 溶解沉淀， 获得 PLKO.1-eIF4H、 PLKO.1- 载体对照、 以及 另外两个慢病毒包装质粒 pCMV-VSVG 和 pCMV-dR8.2。 0047 实施例 5 0048 脂质体介导的慢病毒包装 0049 1) 细胞转染前将 293T 细胞以 1.5106的。

20、密度培养于 10cm 细胞培养皿中培养 24h， 转染时细胞汇合度达到 50% 60%。 0050 2) 转染前 3h 将待转染细胞培养基换为无血清 MEM 培养基。 0051 3) 取 16g 质粒 （7.5g pLKO.1-eIF4H 或 PLOK.1- 载体对照、 2.9g pCMV-VSVG、 5.6g pCMV-dR8.2）至 0.5ml 无血清 MEM 培养基中混合均匀。再取 15l LipofectamineTM2000 至 0.5ml 无血清 MEM 培养基中混合均匀， 室温孵育 5min。混合两份培 养基， 室温孵育 25min。 0052 4) 在待转染细胞中加入 4ml 。

21、无血清 MEM 培养基， 逐滴加入步骤 3 的混合液。混匀 后放至 37， CO2培养箱中培养 6h 后换成 10% 血清的 DMEM 培养基培养。 0053 5)培养48h后取上清培养基至15ml离心管中， 2000rpm， 4离心7min收集上清病 毒液， 获得 PLOK.1-eIF4H 和 PLKO.1- 载体对照两种慢病毒。 0054 实施例 6 0055 eIF4H 低表达的 MEL 细胞稳定株的建立 0056 复苏 MEL 细胞并传代 2 3 次后， 按每孔 4500 个细胞接种于 24 孔板内， 每孔加 入 1ml 含 10% 胎牛血清的 DMEM 培养基， 将 pLKO.1-e。

22、IF4H 和 PLKO.1- 载体对照两种病毒分 别加到细胞悬液中。侵染 96h 后， 弃去上清培养基， 用 0.5g/ml 的嘌呤霉素筛选含抗性 基因的细胞， 直到没有大量的细胞死亡为止， 此过程大约需一个月。获得 PLKO.1-eIF4H 和 PLKO.1- 载体对照两个 MEL 细胞株， 通过免疫印迹法验证干扰效果。 0057 实施例 7 0058 MTT 法检测 eIF4H 低表达对 MEL 增殖的影响 0059 取对数生长期的 PLKO.1-eIF4H 和 PLKO.1- 载体对照两个 MEL 细胞株接种于 96 孔 板， 每孔 3000 个细胞， 每组设 3 个复孔， 置于 37、。

23、 5%CO2饱和湿度下培养， 分别于接种的 1 5d 加入 10l5mg/ml 的 MTT 溶液， 继续培养 4h， 3000rpm 离心 15min， 弃去上清培养液， 加入 150l DMSO， 振荡 10min， 使紫色结晶充分溶解， OD595nm处测定吸光度值。以 OD595nm为 说 明 书 CN 103421792 B 6 5/6 页 7 纵坐标， 时间为横坐标绘制细胞生长曲线。 0060 实施例 8 0061 流式细胞术分析 eIF4H 低表达对 MEL 细胞周期的影响 （南京凯基 PI 凋亡染色试剂 盒） 0062 收取对数生长期的 PLKO.1-eIF4H 和 PLKO.1。

24、- 载体对照两个 MEL 细胞株， PBS 洗 2 次， 1000rpm离心10min， 弃上清， 加入1ml预冷的70%乙醇于20固定24h以上。 1500rpm 离心 10min， 弃上清， 细胞沉淀用 PBS 洗两次， 留 0.2ml PBS， 加入终浓度为 50g/ml Rnase A， 37保温 30 45min， 冰浴 1min。加入为 5l 碘化丙锭， 4避光染色 30min， 流式细胞 仪分析细胞周期。 0063 实施例 9 0064 eIF4H 低表达对丁酸钠诱导 MEL 细胞红系分化的影响 0065 收取对数生长期的 PLKO.1-eIF4H 和 PLKO.1- 载体对照两。

25、个 MEL 细胞株， 按 1.5104/ml接种于24孔板中， 加入1.25mM丁酸钠诱导红系分化， 对照组不加丁酸钠。 分别 于加药后 3 5d 取各组细胞进行联苯胺染色。收集细胞， 1000rpm， 3min ； 弃上清， 加入 1ml 生理盐水 （0.85%） 洗 1 次， 去除残留培养基 ； 加入预混的联苯胺染液 ： 30%H2O2（50:1,v:v） 100l ； 滴片后镜检， 统计联苯胺阳性细胞所占比例。 0066 结果 0067 1eIF4H 在丁酸钠和 HMBA 诱导 MEL 细胞红系分化过程中表达均下调 0068 免疫印迹分析发现在丁酸钠或 HMBA 诱导 MEL 细胞红系分。

26、化过程中， eIF4H 蛋白的 两个亚型表达均下调 （图 2） 。 0069 2eIF4H 低表达稳定株的建立 0070 免疫印迹显示， pLKO.1-eIF4H 组细胞中 eIF4H 两个亚型表达均下调。结果表明成 功构建了 eIF4H 基因沉默的 MEL 细胞稳定株 （图 3） 。 0071 3eIF4H 低表达抑制了 MEL 细胞的增殖 0072 与对照组细胞相比， pLKO.1-eIF4H组细胞增殖明显受到抑制。 对照组细胞在3d时 细胞生长达到平台期， 而 pLKO.1-eIF4H 到 4d 时才达到平台期。结果表明 eIF4H 低表达显 著抑制了 MEL 细胞的增殖 （图 4） 。。

27、 0073 4eIF4H 低表达阻碍了 MEL 细胞的周期进程 0074 pLKO.1-eIF4H 组细胞周期各时期的分布 ： G1 期为 37.82%， G2 期为 5.36%， S 期为 56.82% ； 而 PLKO.1- 载体对照组细胞周期各时期的分布 ： G1 期为 32.30%， G2 期为 5.87%， S 期为 61.83%。结果表明 eIF4H 低表达阻碍 MEL 细胞周期在 G1 期 （图 5） 。 0075 5eIF4H 低表达促进了 MEL 细胞红系分化进程 0076 丁酸钠处理后， pLKO.1-eIF4H 组联苯胺阳性细胞明显高于 PLKO.1- 载体对照 （图 6。

28、） ， 结果表明 eIF4H 低表达促进了 MEL 细胞的红系分化进程。 0077 综上所述， 可见 eIF4H 在丁酸钠和 HMBA 诱导 MEL 细胞红系分化过程中表达下调。 在 eIF4H 基因编码区选取翻译起始位点后的第 179 199bp 作为干扰靶位点， 合成了可形 成小发夹 shRNA 的寡聚核苷酸序列， 通过慢病毒介导的 RNA 干扰技术成功构建了 eIF4H 低 表达 MEL 细胞稳定株。进一步研究发现 eIF4H 低表达抑制了 MEL 细胞的增殖 ； 并且发现 eIF4H 低表达促进了 MEL 细胞的红系分化进程。本发明提示选取 eIF4H 基因编码区翻译起 说 明 书 CN 103421792 B 7 6/6 页 8 始位点后的第 179 199bp 作为干扰靶位点可有效的沉默该基因的表达， 并且 eIF4H 的下 调表达可促使癌细胞恶性逆转。 0078 虽然用上述实施方式描述了本发明， 应当理解的是， 在不背离本发明的精神的前 提下， 本发明可进行进一步的修饰和变动， 且这些修饰和变动均属于本发明的保护范围之 内。 说 明 书 CN 103421792 B 8 1/2 页 9 图 1 图 2 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 103421792 B 9 2/2 页 10 图 5 图 6 说 明 书 附 图 CN 103421792 B 10 。