技术领域
本发明涉及一种丛枝菌根真菌孢子的采集方法。
背景技术
丛枝菌根真菌是一种严格的营共生真菌，不能脱离宿主植物独立生存，它能够与80％以上的陆地植物形成共生体。丛枝菌根真菌在维持农业生物肥力、促进植物的生长、提高宿主植物的抗逆性和改善退化土壤质量方面起着至关重要的作用。丛枝菌根真菌由菌根孢子（果）、丛枝体、泡囊、菌丝组成，都可以作为繁殖体。选用丛枝菌根真菌孢子作为接种源，不但可以得到单一的菌源，而且也可以通过菌根真菌孢子的萌发来了解菌根真菌对外界条件的适应程度。因此，适生的菌根真菌孢子的筛选和分离对于研究菌根真菌孢子在土壤中的分布、存在数量和种类以及研究菌根在煤矿区生态恢复的适应性具有重要的意义。目前野外丛枝菌根孢子采集主要是从宿主植物根际取土分离，通常丛枝菌根分离每样需采集土壤样品1.5～2kg，在从这些土壤中分离孢子，这样往往加大了孢子的分离范围和增加了土壤中孢子分离的工作量，加之孢子量少的土壤中由于土粒和有机颗粒的干扰，不容易分离的孢子。因此，通过一定的技术手段，将野外丛枝菌根孢子富集在局部空间内，从而将其分离或直接作为菌剂生产的菌源就变的至关重要。
发明内容
本发明的目的是提供一种丛枝菌根真菌孢子的采集方法。
本发明所提供的丛枝菌根真菌孢子的采集（富集）方法，可包括如下步骤：
（1）制备供试基质：取目标采集区的土壤，灭菌，晾干，向每千克晾干后的土壤中加入100mg氮元素、10mg磷元素、150mg钾元素和100mg钙元素，得到供试基质；
（2）制作菌袋：用孔径为30μm的防腐布制作菌袋，在所述菌袋的一端设置开口；
（3）将步骤（1）制备的供试基质装入步骤（2）制作的菌袋中，将所述菌袋的开口封闭（采用缝合的方式封闭开口）；
（4）将步骤（3）得到的装有所述供试基质的菌袋放在宿主植物的根部，覆土；
（5）在所述宿主植物的一个生长季（“一个生长季”指的是植物春季开始生长到冬季停止生长，西部地区指的是4月末到10月中下旬）后，取出步骤（4）中放入所述宿主植物的根部的所述菌袋，从中分离得到丛枝菌根真菌孢子。
在本发明中，步骤（1）中，所述向每千克灭菌后土壤中加入100mg氮元素、10mg磷元素、150mg钾元素和100mg钙元素，得到供试基质，具体为如下：向每千克所述 灭菌后土壤中加入1L营养液，干燥（如25℃晾干）后得到所述供试基质；所述营养液中含有浓度为100mg/L的氮元素、浓度为10mg/L的磷元素、浓度为150mg/L的钾元素和浓度为100mg/L的钙元素。
更加具体的，所述营养液的溶剂为水，溶质及浓度如下：NH4NO3285.7mg/L，KH2PO443.9mg/L，K2SO4306.5mg/L，CaCl2277.5mg/L，pH为7。
在上述方法中，步骤（1）中，将所述目标采集区的土壤灭菌前还包括如下步骤：将所述目标采集区的土壤过孔径为1mm的筛子，将过筛后的土壤进行所述灭菌（高温高压蒸汽灭菌锅中灭菌2h，灭菌锅温度设定为121℃）。
在上述方法中，步骤（2）中，所述防腐布需满足如下条件：在所述宿主植物的一个生长季中，所述防腐布在土壤中不会腐烂。具体的，所述防腐布可为尼龙布（孔径为30μm）；所述菌袋的长度可为5～15cm（如10cm）、宽度可为4～12cm（如8cm）、厚度可为3～5cm（如3cm）。
在上述方法中，步骤（3）中，将所述供试基质装入所述菌袋中的填装量可为100g。
在上述方法中，步骤（4）中，将装有所述供试基质的所述菌袋放在所述宿主植物的根部，具体为将装有所述供试基质的所述菌袋放在所述宿主植物的根系分布密集区（由于植物根系分布无特定规律性，野外放置菌袋时主要通过人为观测，尽量放在根系分布密集区），放置方式为垂直根系生长放置较好。
在上述方法中，所述菌袋的一端设有牵引线；为了操作方便，所述牵引线具体可设置在所述菌袋的开口端，最好设置在所述开口端的中间位置。
在步骤（4）的实际操作中，可将所述牵引线系在所述宿主植物的茎干部，以便回收菌袋。
在上述方法的步骤（5）中，在取出步骤（4）中放入所述宿主植物的根部的所述菌袋后，还包括测定所述菌袋内所述丛枝菌根真菌孢子密度的步骤。测定方法可为本领域技术人员所熟知的任何现有技术。在本发明中，所述测定方法具体为湿筛倾析法。
在上述方法中，步骤（1）中，所述目标采集区即为所述宿主植物的栽植区。
具体的，在本发明中，所述目标采集区为如下a1）-a3）中任一种：
a1）陕西省榆林市神木县活鸡兔矿塌陷区；
a2）鄂尔多斯市乌兰木伦矿区；
a3）宁夏大武口洗煤厂煤矸石山复垦区。
在本发明中，对应于以上a1）-a3）所述的目标采集区，所述宿主植物为如下b1）-b3）中的任一种：
b1）紫穗槐；
b2）沙柳；
b3）白蜡。
在本发明中，对应于以上b1）-b3）所述的宿主植物，上述方法中，将所述菌袋在所述宿主植物根部的具体放置深度均可为15cm。
以上所述的营养液在富集丛枝菌根真菌孢子中的应用也属于本发明的保护范围。
本发明是一种快速富集丛枝菌根孢子的野外收集方法，通过改良的基质对野外菌根进行原位富集。煤矿塌陷区的土壤较为贫瘠，当宿主植物根际埋入丛枝菌根孢子采集袋时，由于采集袋中基质经过改良，养分含量较高，这就加剧了宿主植物根系向采集袋向性生长。此种情况下，宿主植物局部根系为获得养分，就加剧了其共生体丛枝菌根菌丝体（直径为3～7μm）进入采集袋，有效的吸收宿主植物根系不能吸收的营养元素，从而加大了采集袋中孢子富集密度。通常丛枝菌根分离每样需采集土壤样品1.5～2kg，本发明采集袋内的供试基质只有100g，这样就很大程度上缩小了筛选范围和工作量。本发明适合不同地区不同宿主植物根际菌根孢子的采集，更适合大规模的野外丛枝菌根孢子快速采集。对菌根在矿区生态重建、土壤修复以及农业生物肥力等野外大规模应用后的菌根孢子的快速采集提供了一种快速的科学采集方法，也为不同区域内菌剂生产过程中所需菌源的快速筛选提供了技术支撑。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中所涉及的营养液的溶剂为水，溶质及浓度如下：NH4NO3285.7mg/L，KH2PO443.9mg/L，K2SO4306.5mg/L，CaCl2277.5mg/L，pH为7。折合氮元素浓度为100mg/L、磷元素浓度为10mg/L、钾元素浓度为150mg/L、钙元素浓度为100mg/L。
实施例1、陕西省榆林市活鸡兔矿塌陷区丛枝菌根孢子采集
一、丛枝菌根孢子的富集
目标采集区：陕西省榆林市神木县活鸡兔矿塌陷区。
宿主植物：紫穗槐，紫穗槐选自陕西省榆林市活鸡兔沉陷区微生物复垦示范基地。供试紫穗槐的平均株高为43.3cm，冠幅为26cm。
试验地点：位于陕西省神木县大柳塔镇高家畔，属于神东矿区活鸡兔井采空塌陷区，位于陕北黄土高原沟壑区向毛乌素沙漠的过渡地带。基地位于沟壑区的三道梁上，年均气温7.3℃，年均降水量368mm，年均蒸发量1319mm，降水主要集中在7—9月份，属半湿润易干旱地区。
1、供试基质的制备
以陕西省榆林市神木县活鸡兔矿塌陷区的退化土壤为供试土壤，经孔径为1mm的 筛子过筛，将过筛后的土壤晾干，称取5kg晾干后土壤，放入灭菌锅中进行高温高压蒸汽灭菌（121℃，2h），自然风干。称取2.5kg风干灭菌土，加入2.5L营养液，混匀后晾干，得到供试基质。剩余2.5kg风干灭菌土用于对照菌袋基质。
2、菌袋的制备
选取孔径为30μm的尼龙布作为菌袋制作材料，此材料具有防腐功能，在宿主植物的一个生长季中，该菌袋在土壤中不会腐烂。制作菌袋大小为：长（10cm）×宽（8cm）×厚（3cm），其中菌袋的一端为开口端，牵引线位于菌袋的开口端中间位置（放在中间位置为了受力平衡，便于牵拉）。
3、菌袋的填装
将100g步骤1制备的供试基质装入步骤2制作的菌袋中，将所述菌袋的开口端缝合。
4、试验方案
试验于2011年4月17日进行，此时该试验区的土壤已融冻，宿主植物处于返青季节。试验设计20个重复，即选择20株紫穗槐作为宿主植物，按照“S型曲线”法选择紫穗槐，所选择的20株紫穗槐大小相近。本试验研究区紫穗槐植株较小，且根系分布较浅，因此贴近紫穗槐的根部开挖深度为20cm的坑，将以上步骤3填装好的菌袋垂直放置在紫穗槐的根系分布密集区，放置深度为15cm，每个宿主植物放置一个菌袋，，放置完成后覆土，并将菌袋牵引线系在紫穗槐的茎干部，以便回收菌袋。10月初取回菌袋，同时收集宿主植物的根际土，此时正值研究区冰冻季节，该区的植物已停止生长，本试验恰好是宿主植物的一个生长季。
试验过程中，同时设置未向供试土壤中加入营养液的对照组，除此以外的其他所有操作均同上。
二、丛枝菌根孢子密度的测定
由于本发明用于制作菌袋的尼龙布孔径为30μm，孢子很难自由出入，而菌袋外丛枝菌根菌丝体容易进入袋内，菌袋通过自身的截留特质实现对孢子富集，再通过湿筛倾析法即可得到丛枝菌根孢子。
采用湿筛倾析法测定步骤一中在宿主植物一个生长季后收集的实验组菌袋（供试基质中含有营养液）、对照组菌袋（供试基质中不含有营养液），以及宿主植物根际土壤中丛枝菌根真菌孢子的密度。对于菌袋来说，每个菌袋为一个待测样本；对于根际土壤来说，采集表层15cm处植物根系附近土壤，晾干，过孔径为1mm的筛子，称量100g作为一个待测样本。测定丛枝菌根真菌孢子密度的湿筛倾析法具体如下：
①称取一定重量的土壤样品（取自15cm表层植物根系附近的土壤），放在容器内用水浸泡20-30min，使土壤松散。如果土壤粘性很大，也可加入各种土壤分散剂。
②选用一套洁净的具有孔径为0.5-0.034mm的土壤筛，依次重叠起来。最底层用一物体垫着（如培养皿、木块等物），使筛面稍微倾斜。
③用玻璃棒搅动浸泡的水溶液，停置几秒钟后，使大的石砾和杂物沉淀下去，即将悬浮的土壤溶液慢慢地倒在最上一层孔径最大的土壤筛上。倾倒时，最好集中倒在筛面的一个点上，不要使整个筛面都沾有土壤溶液。
④用清水依次轻轻冲洗停留在筛面上的筛出物，以免在上层粗筛面的剩留物中夹藏有菌根真菌孢子；
⑤用洗瓶将停留在筛面上的筛出物轻轻冲洗到一个干净的试管内，滴加0.05％曲利苯蓝染色液（0.5g曲利苯蓝溶于1L体积比为1∶1∶1的乳酸∶甘油∶蒸馏水混合液中，必须使用玻璃棒搅拌至全部溶解，放入棕色广口瓶存放），放在90℃水浴锅或烘箱中加热半小时，进行染色；
⑥将染色后的滤液通过细筛，并冲洗筛上的滤物，洗去染色剂；将筛出物放在干净的培养皿里，在冲洗下来的筛出物中，除有许多细的沙砾和杂质外，其余为不同直径的菌根真菌孢子。
⑦将含有筛出物的培养皿放在双目实体解剖显微镜下观察，即可观测到紫色的丛枝菌根真菌孢子。
计算公式：
每种处理的最终结果取处理内20个重复的平均值。
结果显示，实验组菌袋（供试基质中含有营养液）中丛枝菌根真菌的平均孢子密度可达到39个/g土壤，而对照组菌袋（对照组供试基质不添加营养液）中丛枝菌根真菌的平均孢子密度为31个/g土壤，紫穗槐根际土中丛枝菌根真菌的孢子密度仅为14个/g土壤。且经过统计学分析，三个处理之间彼此差异显著（P<0.05）。对以上结果进行统计分析发现，与紫穗槐根际土相比，实验组经过改良后的供试基质（供试基质中含有营养液）将丛枝菌根真菌的孢子密度平均提高了179％。可见采用本发明改良后的供试基质（供试基质中含有营养液）按照如上方法操作可将丛枝菌根真菌孢子大量富集到菌袋中，从而很好的实现对丛枝菌根真菌孢子的野外采集。
实施例2、鄂尔多斯市乌兰木伦矿区丛枝菌根真菌孢子采集
一、
目标采集区：鄂尔多斯市乌兰木伦矿区。
宿主植物：沙柳，为鄂尔多斯市乌兰木伦矿区的先锋植物，沙柳的平均株高为178.8cm，冠幅为144.2cm。
试验地点：位于鄂尔多斯市乌兰木伦矿区，该矿区位于毛乌素沙地边缘，地表为流动沙及半固定沙所覆盖，最厚可达20～50m。矿区属典型的半干旱、半沙漠的高原大陆性气候，区内不少地区气候干燥，年降雨量平均为194.7～531.6mm，植被稀少，矿区生态环境脆弱的表现。
1、供试基质的制备
以鄂尔多斯市乌兰木伦矿区的退化土壤为供试土壤，采集供试土壤，经孔径为1mm的筛子过筛，将过筛后的土壤晾干，称取5kg晾干后土壤，放入灭菌锅中进行高温高压蒸汽灭菌（121℃，2h），自然风干。称取2.5kg风干土，加入2.5L营养液，混匀后晾干，得到供试基质。剩余2.5kg风干灭菌土用于对照菌袋基质。
2、菌袋的制备
选取孔径为30μm的尼龙布作为菌袋制作材料，此材料具有防腐功能，在宿主植物的一个生长季中，该菌袋在土壤中不会腐烂。制作菌袋大小为：长（10cm）×宽（8cm）×厚（3cm），其中菌袋的一端为开口端，牵引线位于菌袋的开口端中间位置。
3、菌袋的填装
将100g步骤1制备的供试基质装入步骤2制作的菌袋中，将所述菌袋的开口端缝合。
4、试验方案
试验于2011年4月18日进行，此时神东矿区的土壤已融冻，宿主植物处于返青季节。试验设计20个重复，即选择20株沙柳作为宿主植物，按照“S型曲线”法选取沙柳，所选择的20株沙柳大小相近。将贴近沙柳根部的土壤挖去，将以上步骤3填装好的菌袋垂直放置在沙柳的根系分布密集区，放置深度为15cm，每个宿主植物放置一个菌袋，放置完成后覆盖土壤，并将菌袋的牵引线系在沙柳的茎干部，以便回收菌袋。10月初取回菌袋，同时收集宿主植物的根际土，此时正值研究区冰冻季节，该区的植物已停止生长，本试验恰好是宿主植物的一个生长季。
试验过程中，同时设置未向供试土壤中加入营养液的对照组，除此以外的其他所有操作均同上。
二、丛枝菌根孢子密度的测定
室内测定步骤一中在宿主植物一个生长季后收集的实验组菌袋（供试基质中含有营养液）、对照组菌袋（供试基质中不含有营养液），以及宿主植物根际土壤中丛枝菌根真菌孢子的密度。对于菌袋来说，每个菌袋为一个待测样本；对于根际土壤来说，采集表层15cm处植物根系附近土壤，晾干，过孔径为1mm的筛子，称量100g作为 一个待测样本。丛枝菌根真菌孢子的密度的测定方法同实施例1。每种处理的最终结果取处理内20个重复的平均值。
结果显示，实验组菌袋（供试基质中含有营养液）中丛枝菌根真菌的平均孢子密度可达到30个/g土壤，而对照组菌袋（供试基质中不含有营养液）中丛枝菌根真菌的平均孢子密度为21个/g土壤，沙柳根际土中丛枝菌根真菌的孢子密度仅为12个/g土壤。且经过统计学分析，三个处理之间彼此差异显著（P<0.05）。对以上结果进行统计分析发现，与沙柳根际土相比，实验组经过改良后的供试基质（供试基质中含有营养液）将丛枝菌根真菌的孢子密度平均提高了150％。可见采用本发明改良后的供试基质（供试基质中含有营养液）按照如上方法操作可将丛枝菌根真菌孢子大量富集到菌袋中，从而很好的实现对丛枝菌根真菌孢子的野外采集。
实施例3、宁夏大武口洗煤厂煤矸石山复垦区丛枝菌根真菌孢子采集
一、
目标采集区：宁夏大武口洗煤厂煤矸石山复垦区。
宿主植物：白蜡，为宁夏大武口洗煤厂煤矸石山复垦区的先锋植物，白蜡的平均株高为217cm，冠幅为151cm。
试验地点：位于宁夏大武口洗煤厂煤矸石山复垦区，该地位于宁夏回族自治区石嘴山市，属于中温带干旱气候区，降水稀少而集中，光照充足，蒸发强烈，空气干燥，极不利于植物的生长。本试验地点选择煤矸石山上，煤矸石山上铺了0.8-1m厚的河沙作为生长基质。该区为中国矿业大学（北京）矿区微生物复垦示范基地。
1、供试基质的制备
以宁夏大武口洗煤厂煤矸石山上废弃砂质为供试土壤，采集供试土壤，经孔径为1mm的筛子过筛，将过筛后的土壤晾干，称取5kg晾干后土壤，放入灭菌锅中进行高温高压蒸汽灭菌（121℃，2h），自然风干。称取2.5kg风干土，加入2.5L营养液，混匀后晾干，得到供试基质。剩余2.5kg风干灭菌土用于对照菌袋基质。
2、菌袋的制备
选取孔径为30μm的尼龙布作为菌袋制作材料，此材料具有防腐功能，在宿主植物的一个生长季中，该菌袋在土壤中不会腐烂。制作菌袋大小为：长（10cm）×宽（8cm）×厚（3cm），其中菌袋的一端为开口端，牵引线位于菌袋的开口端中间位置。
3、菌袋的填装
将100g步骤1制备的供试基质装入步骤2制作的菌袋中，将所述菌袋的开口端缝合。
4、试验方案
试验于2011年4月17日进行，此时该试验区的土壤已融冻，宿主植物处于返青季节。试验设计20个重复，即选择20株白蜡作为宿主植物，按照“S型曲线”法选择白蜡，所选择的20株白蜡大小相近。本试验研究区白蜡植株较小，且根系分布较浅，因此贴近白蜡的根部开挖深度为20cm的坑，将以上步骤3填装好的菌袋垂直放置在白蜡的根系分布密集区，放置深度为15cm，每个宿主植物放置一个菌袋，，放置完成后覆土，并将菌袋牵引线系在白蜡的茎干部，以便回收菌袋。10月初取回菌袋，同时收集宿主植物的根际土，此时正值研究区冰冻季节，该区的植物已停止生长，本试验恰好是宿主植物的一个生长季。
试验过程中，同时设置未向供试土壤中加入营养液的对照组，除此以外的其他所有操作均同上。
二、丛枝菌根孢子密度的测定
室内测定步骤一中在宿主植物一个生长季后收集的实验组菌袋（供试基质中含有营养液）、对照组菌袋（供试基质中不含有营养液），以及宿主植物根际土壤中丛枝菌根真菌孢子的密度。对于菌袋来说，每个菌袋为一个待测样本；对于根际土壤来说，采集表层15cm处植物根系附近土壤，晾干，过孔径为1mm的筛子，称量100g作为一个待测样本。丛枝菌根真菌孢子的密度的测定方法同实施例1。每种处理的最终结果取处理内20个重复的平均值。
结果显示，实验组菌袋（供试基质中含有营养液）中丛枝菌根真菌的平均孢子密度可达到35个/g土壤，而对照组菌袋（供试基质中不含有营养液）中丛枝菌根真菌的平均孢子密度为24个/g土壤，白蜡根际土中丛枝菌根真菌的孢子密度仅为15个/g土壤。且经过统计学分析，三个处理之间彼此差异显著（P<0.05）。对以上结果进行统计分析发现，与白蜡根际土相比，实验组经过改良后的供试基质（供试基质中含有营养液）将丛枝菌根真菌的孢子密度平均提高了133％。可见采用本发明改良后的供试基质（供试基质中含有营养液）按照如上方法操作可将丛枝菌根真菌孢子大量富集到菌袋中，从而很好的实现对丛枝菌根真菌孢子的野外采集。