用于促进皮肤细胞分化的物质的筛查方法.pdf

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1、(10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201180065355.3 (22)申请日 2011.11.18 10-2010-0115853 2010.11.19 KR C12Q 1/68(2006.01) G01N 33/15(2006.01) A61K 8/00(2006.01) A61Q 19/00(2006.01) (73)专利权人 株式会社爱茉莉太平洋 地址 韩国首尔市 (72)发明人 崔玹 金润京 梁承夏 李泰龙 卢旻秀 申东旭 (74)专利代理机构 广州华进联合专利商标代理 有限公司 44224 代理人 黎艳 胡杰 Umadevi V. Wesley et al.A。

2、irway Epithelial Cell Migration and Wound Repair by ATP-mediated Activation of Dual Oxidase 1.THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY .2007,第282卷(第5期),第3213 3220 页 . Umadevi V. Wesley et al.Airway Epithelial Cell Migration and Wound Repair by ATP-mediated Activation of Dual Oxidase 1.THE JOURNAL OF BIOL。

3、OGICAL CHEMISTRY .2007,第282卷(第5期),第3213 3220 页 . (54) 发明名称 用于促进皮肤细胞分化的物质的筛查方法 (57) 摘要 本发明涉及用于促进皮肤细胞分化的物质的 筛查方法， 该方法包括 ： 用测试物质处理皮肤细 胞 ； 和核实在前一步骤中用所述测试物质处理过 的皮肤细胞内的 DUOX1 基因的相对表达水平。本 发明也涉及用于促进皮肤细胞分化的物质的筛 查试剂盒， 该试剂盒包括用于核实皮肤细胞内的 DUOX1 基因的相对表达水平的装置。本发明又涉 及一种组合物， 该组合物包含作为活性成分的能 够增加 DUOX1 基因表达的用于促进皮肤细胞分 化、。

4、 保湿皮肤、 增强皮肤屏障功能以及降低或治疗 特应性症状的物质。 (30)优先权数据 (85)PCT国际申请进入国家阶段日 2013.07.18 (86)PCT国际申请的申请数据 PCT/KR2011/008838 2011.11.18 (87)PCT国际申请的公布数据 WO2012/067460 KO 2012.05.24 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 黄琦 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书1页 说明书6页 附图3页 CN 103443291 B 2016.03.16 CN 103443291 B 1/1 页 2 1.用于促进皮肤细胞分化。

5、的物质的筛查方法， 包括 ： 用测试物质处理皮肤细胞 ； 核实用所述测试物质处理过的皮肤细胞内双氧化酶 1 基因的相对表达水平 ； 和 在核实双氧化酶 1 基因的相对表达水平后， 将使双氧化酶 1 基因的表达水平上升的物 质判断为用于促进皮肤细胞分化的物质， 其中， 所述皮肤细胞为皮肤表皮角质形成细胞。 2.根据权利要求 1 所述的用于促进皮肤细胞分化的物质的筛查方法， 其特征在于， 该 方法除了核实双氧化酶 1 基因的相对表达水平外， 还包括核实用所述测试物质处理过的皮 肤细胞内的选自纤聚蛋白、 兜甲蛋白、 角蛋白 1 和角蛋白 10 的至少一种基因的相对表达水 平。 3.根据权利要求 2 。

6、所述的用于促进皮肤细胞分化的物质的筛查方法， 其特征在于， 还 包括 ： 在核实选自纤聚蛋白、 兜甲蛋白、 角蛋白 1 和角蛋白 10 的至少一种基因的相对表达 水平后， 将使至少一种选定基因的表达水平上升的物质判断为用于促进皮肤细胞分化的物 质。 4.根据权利要求 1 3 中的任何一项所述的用于促进皮肤细胞分化的物质的筛查方 法， 其特征在于， 该方法为用于通过促进皮肤细胞分化来保湿皮肤的物质的筛查方法。 5.根据权利要求 1 3 中任何一项所述的用于促进皮肤细胞分化的物质的筛查方法， 其特征在于， 该方法为用于通过促进皮肤细胞分化来增强皮肤屏障功能的物质的筛查方 法。 6.根据权利要求 1。

7、 3 中任何一项所述的用于促进皮肤细胞分化的物质的筛查方法， 其特征在于， 该方法为用于通过促进皮肤细胞分化来降低或治疗特应性症状的物质的筛查 方法。 权 利 要 求 书 CN 103443291 B 2 1/6 页 3 用于促进皮肤细胞分化的物质的筛查方法 技术领域 0001 本发明涉及用于促进皮肤细胞分化的物质的筛查方法及其试剂盒。 背景技术 0002 表皮为皮肤的最外层， 而角质层是表皮的最外层。当由角质形成细胞组成的角质 层处于正常状态时， 表皮才能充当身体的主要屏障， 从而能够防御各种刺激并防止身体水 分的发散。 表皮形成细胞在皮肤最下层， 即在基底层中进行增殖， 然后通过棘层和颗粒。

8、层逐 渐进行分化。通过这种角化过程， 表皮形成细胞会产生天然保湿因子 （NMFs） 和脂质 （神经 酰胺、 胆固醇或脂肪酸） ， 进而形成角质层。通过这种角质层的正常形成， 皮肤的屏障功能可 以正常工作。 发明内容 0003 技术问题 0004 本发明在于提供用于促进皮肤细胞分化的物质的筛查方法及其试剂盒。进一步， 本发明在于提供一种组合物， 该组合物可以促进皮肤细胞的分化， 滋润皮肤， 增强皮肤屏障 功能， 或者降低或治疗特应性症状。 0005 技术方案 0006 在一方面， 本发明提供用于促进皮肤细胞分化的物质的筛查方法， 其包括 ： 用测试 物质处理皮肤细胞 ； 以及核实在前一步骤中经测。

9、试物质处理过的皮肤细胞内的双氧化酶 1 （DUOX1） 基因的相对表达水平。 0007 在另一方面， 本发明提供用于促进皮肤细胞分化的物质的筛查试剂盒， 其包括可 核实皮肤细胞内 DUOX 1 基因的相对表达水平的装置。 0008 在又一方面， 本发明提供用于促进皮肤细胞的分化、 滋润皮肤、 增强皮肤屏障功能 或者降低或治疗特应新症状的组合物， 该组合物包含作为活性成分的可增加 DUOX1 基因表 达的物质。 0009 有益效果 0010 根据在此公开的用于促进皮肤细胞分化的物质的筛查方法， 待用所述测试物质处 理皮肤细胞后， 该方法可通过检测 DUOX1 基因的相对表达水平来便捷且有效地核实。

10、用于促 进皮肤细胞分化的物质。 附图说明 0011 图 1 展示了根据正常人表皮角质形成细胞内钙浓度的 DUOX1 基因表达水平。 0012 图 2 展示了当用 DUOX1 或 DUOX2 siRNA 处理皮肤表皮角质形成细胞时， 与未用它 们处理时相比， DUOX 1 或 DUOX 2 的表达水平。 0013 图 3 和图 4 展示了在用 DUOX1 或 DUOX2 siRNA 处理皮肤表皮角质形成细胞时， 与 未用它们处理时相比， 纤聚蛋白 （filaggrin） 和兜甲蛋白 （loricrin） （图 3） ， 以及角蛋白 说 明 书 CN 103443291 B 3 2/6 页 4 （。

11、keratin） 1 和角蛋白 10（图 4） 的表达水平。 0014 图 5 和图 6 展示了当用三百草或楝属 （melia） 的提取物处理皮肤表皮角质形成细 胞时， 与未用它们处理时相比， DUOX1 和纤聚蛋白 （图 5） ， 以及角蛋白 1 和角蛋白 10（图 6） 的表达水平。 具体实施方式 0015 双氧化酶也被称作 Duox1 或 ThOX1（甲状腺氧化酶， Thyroid oxidase） ， 是 DUOX1 基因编码而成的。它被首次发现于甲状腺中。人体内有两种同源物， 即 hDUOX 1 和 hDUOX 2， hDUOX1大量表达于气道上皮细胞内， 而hDUOX2则大量表达于。

12、唾液腺和胃肠道中。 DUOX1 属于 NADPH 氧化酶 （NOX） ， 并且具有共 7 种同源物 （Nox1、 Nox2、 Nox3、 Nox4、 Nox5、 Duox1 和 Duox2） 。其中， NOX 在吞噬细胞的吞噬作用中作为产生活性氧簇 （ROS） 的蛋白质被人们做了 大量研究， 然而， 最近在细胞组织内也发现了 NOX 并对其进行了研究， 而不是在免疫细胞。 已知， NOX/DUOX 族将通过产生活性氧的生物作用参与高血压 （NOX1） 、 免疫 （NOX2/DUOX） 、 耳 朵的形成 （NOX） 、 甲状腺激素的产生 （DUOX1 和 2） 等当中。 0016 构成皮肤屏障的。

13、最外层的角质层是由天然保湿因子、 脂质等组成的。纤聚蛋白通 过转录后修饰过程降解为多种亲水性氨基酸， 而且已知由此形成的氨基酸池将构成天然保 湿因子 （NMFs） ， NMFs 会帮助维持角质层的水分。进一步， 亦知， 纤聚蛋白基因的突变是重要 的遗传危险因素， 其通过减少皮肤保湿因子， 破坏皮肤屏障功能， 降低对过敏原或微生物的 皮肤防御能力以及激活 T 细胞群来引发特应性湿疹， 进而引发由自身免疫机制引起的慢性 炎症。但是对其的治疗或预防方法还尚未出现。 0017 下面， 将详细地描述本发明。 0018 本发明人已检测了 DUOX1 的表达在正常人皮肤的表皮角质形成细胞内相对会多， 而且其。

14、表达水平在分化过程中会增加。进一步， 通过删除 DUOX1 (siRNA) 来证实各种分化 基因的标记如兜甲蛋白、 角蛋白1和角蛋白10的表达水平能与纤聚蛋白基因的表达水平一 同增加， 从而确认了 DUOX1 的表达与参与皮肤细胞分化的纤聚蛋白、 兜甲蛋白、 角蛋白 1 和 角蛋白 10 基因的表达相关。基于此， 可以判断出， 能增加皮肤细胞内 DUOX1 基因的表达水 平的物质也就是用于促进皮肤细胞分化的物质。亦即， 通过用某一物质处理皮肤细胞后检 查 DUOX1 基因的相对表达水平， 可简单地证实所述某一物质是否为用于促进皮肤细胞分化 的物质。 0019 本发明的一个实施例提供用于促进皮肤。

15、细胞分化的物质的筛查方法， 该方法包 括 ： 用测试物质处理皮肤细胞的步骤 ； 和检测在用前一步骤中的测试物质处理过的皮肤细 胞内的双氧化酶 1（DUOX1） 基因 （基因库登记号 ： NM_017434） 的相对表达水平的步骤。 0020 在本说明书中， 术语 “皮肤” 指覆盖动物身体表面的组织， 而且是最广义的概念， 其 包括头皮和头发， 以及覆盖脸和身体的表面的组织。 0021 在本发明的一个实施例中， 所述皮肤细胞包括表皮角质形成细胞。在本发明的另 一个实施例中， 所述皮肤细胞包括人的皮肤表皮角质形成细胞。在本发明的又一个实施例 中， 所述皮肤细胞包括人的正常的皮肤表皮角质形成细胞。 。

16、0022 在本说明书中， 术语 “相对表达水平” 可以为与在未经测试物质处理的皮肤细胞内 的 DUOX1 基因表达的表达水平相比时的表达水平。所述表达水平包括表达量和表达质量。 说 明 书 CN 103443291 B 4 3/6 页 5 0023 待检测完本发明一个实施例的 DUOX 1 基因的相对表达水平后， 可以进一步包括 将增加 DUOX1 基因表达水平的物质判断为用于促进皮肤细胞分化的物质的步骤。具体地， 当 DUOX1 基因在经所述测试物质处理的皮肤细胞内的表达水平高于在未经所述测试物质 处理的皮肤细胞内的表达水平时， 可判断出用来处理的测试物质能够增加 DUOX1 基因的表 达水。

17、平。反之， 当 DUOX1 基因在经所述测试物质处理的皮肤细胞内的表达水平低于在未经 所述测试物质处理的皮肤细胞内的表达水平时， 可判断出用来处理的测试物质不能增加 DUOX1基因的表达水平。 综上所述， 可将所述能够增加DUOX1基因的表达水平的用来处理的 测试物质判断为用于促进皮肤细胞分化的物质。 0024 根据本发明一个实施例， 在经所述测试物质处理的细胞内检测 DUOX 1 基因的相 对表达水平的步骤中， 所述相对表达水平可以用 RT-PCR、 ELISA 或 western 印迹 （免疫印迹） 法来检测。 0025 除了检测 DUOX 1 基因的相对表达水平外， 本发明一个实施例的用。

18、于促进皮肤细 胞分化的物质的筛查方法可进一步包括， 在用所述测试物质处理的皮肤细胞内检测选自纤 聚蛋白、 兜甲蛋白、 角蛋白 1 和角蛋白 10 中至少一种基因的相对表达水平的步骤。通过对 参与皮肤细胞表达中的基因标记的相对表达水平， 可明确地判断出所述目标测试物质是否 为用于促进皮肤细胞分化的物质。 0026 根据本发明一个实施例， 待检测完选自纤聚蛋白、 兜甲蛋白、 角蛋白 1 和角蛋白 10 中至少一种基因的相对表达水平后， 可进一步包括将增加所选取的至少一种基因的表达水 平的物质判断为用于促进皮肤细胞的分化的物质的步骤。具体地， 当在经所述测试物质处 理的皮肤细胞中选取的至少一种基因的。

19、表达水平高于在未经所述测试物质处理的皮肤细 胞中选取的至少一种基因的表达水平时， 就可判断出所述用来处理的测试物质可增加所选 取的至少一种基因的表达水平。综上所述， 可将所述能够增加所选取的至少一种基因的表 达水平的用来处理的测试物质判断为用于促进皮肤细胞分化的物质。 0027 如果皮肤细胞分化不当， 皮肤的角质层就会无法正常工作。 因此， 皮肤的保湿能力 会下降， 且皮肤的屏障功能可能会退化。 进一步， 由于各种因素而无法维持正常皮肤角质层 的功能时， 将引起皮肤疾病如特应性， 其主要症状是皮肤炎症和皮肤干燥。因此， 用于促进 皮肤细胞分化的物质可表现出保湿皮肤、 增强皮肤屏障功能以及降低或。

20、治疗特应性症状的 效果。 亦即， 根据本发明一个实施例， 可通过使用用于促进皮肤细胞分化的物质的筛查方法 来检测用于保湿皮肤、 增强皮肤屏障功能以及降低或治疗特应性症状的物质。 0028 本发明的一个实施例提供用于促进皮肤细胞分化的物质的筛查试剂盒， 该试剂盒 包括能检测在皮肤细胞内 DUOX 1 基因的相对表达水平的装置。通过使用所述检测试剂盒 可检测皮肤细胞内 DUOX 1 基因的相对表达水平， 从而可便捷并有效地检测出用于促进皮 肤细胞分化的物质。 0029 如上述可知， 能够增加 DUOX 1 基因表达的物质表现出了促进皮肤细胞分化、 保湿 皮肤、 增强皮肤屏障功能以及降低或治疗特应性。

21、症状的效果。 因此， 本发明的一个实施例提 供用于促进皮肤细胞分化的组合物、 用于保湿皮肤的组合物、 用于增强皮肤屏障功能的组 合物以及用于降低或治疗特应性症状的组合物， 这些组合物包含作为活性成分的能够增加 DUOX 1 基因表达的物质。本发明的另一个实施例提供用于促进皮肤细胞分化的组合物、 用 于保湿皮肤的组合物、 用于增强皮肤屏障功能的组合物以及用于降低或治疗特应性的症状 说 明 书 CN 103443291 B 5 4/6 页 6 的组合物， 这些组合物包含作为活性成分的能够增加所检测到的 DUOX1 基因表达的物质。 0030 在一个实施例中， 所述组合物可以为化妆品组合物。 在另一。

22、个实施例中， 所述组合 物可以为药物组合物。在又一个实施例中， 所述组合物可以为保健食品组合物。 0031 现在起描述所述实施例。 以下实施例仅作说明为目的， 不用于限制本发明的范围。 0032 【实施例 1】 对根据钙浓度的 DUOX1 基因表达变化的评估 0033 通常， 已知当细胞内钙浓度高时能够促进皮肤细胞的分化。 本实验在于， 通过用不 同浓度的钙处理细胞来改变皮肤细胞的分化程度后评估 DUOX1 基因的表达水平。 0034 从龙沙公司 （Lonza, Inc.， 美国马里兰州沃克斯维尔） 购买正常人的表皮角质形 成细胞 （人表皮新生角质形成细胞） 并进行继代培养 （subcultu。

23、re） ， 然后在 37 C 和 5%CO2 的CO2培养箱内进行培养。 根据龙沙公司 （美国马里兰州沃克斯维尔） 的说明书， 准备细胞培 养。在 KBM-2（Clonetics CC-3103） 培养基 （500ml） 中加入 KGM-2 子弹套件 【牛垂体提取 物 （BPE， 2ml） 、 人表皮成长因子 （hEGF, 0.5ml） 、 胰岛素 （0.5ml） 、 氢化可的松 （0.5ml） 、 转铁 蛋白 （transferrin， 0.5ml） 、 肾上腺素 （0.5ml） ， 硫酸庆大霉素+ amphofericin B （GA-1000， 0.5ml） 】 。 0035 在所述人表。

24、皮角质形成细胞的培养基中分别加入 120M 和 1.2mM 的钙并培养 24 小时。 将它们用作低钙组 （对照组） 和高钙组 （测试组） 。 待用白细胞间介素处理完24小时后， 用 10ml 的磷酸盐缓冲液 （PBS） 清洗所述细胞 2 次， 然后用 Trizol 试剂 （Invitrogen， 美国 加利福尼亚洲卡尔斯巴德） 从所述细胞中分离出细胞内所有的 RNA。用 RNA 试剂盒 （Qiagen RNeasy 试剂盒 , Qiagen, 加利福尼亚洲瓦伦西亚） 再次提纯所述分离出的 RNA， 然后用安 捷伦 2100 生物分析仪 （Agilent 2100 BioAnalyzer， Ag。

25、ilent Technologies， 美国加利福 尼亚州圣克拉拉） 检测 RNA 质量。用反转录试剂盒 （Superscript Reverse Transcriptase (RT) II kit， Invitrogen, 加利福尼亚洲卡尔斯巴德） 从分离出的RNA中合成cDNA， 而后通 过实时定量逆转录聚合酶链式反应方法 （real time-reverse transcription polymerase chain reaction， Q-RT-PCR） 对各种 NOX 基因的表达进行定量分析。使用 TaqMan 基因表达 检测试剂盒 （Applied Biosystems 公司， 。

26、加利福尼亚洲福斯特市） 评估 NOX1（Hs00246589_ m1)、 NOX2（Hs00166163_m1） 、 NOX3（Hs00210462_m1） 、 NOX4（Hs00276431_m1） 、 NOX5 （Hs00225846_m1） 、 DUOX1（Hs00213694_m1） 和 DUOX2（Hs00204187_m1） 的表达模式的变 化。其结果在图 1 中展示。 0036 如图 1 所示， 在正常人表皮角质形成细胞中， DUOX1 基因的表达水平基本上会高， 而且当利用钙增加皮肤细胞分化时， 更能显著地增加 DUOX 1 基因的表达。亦即， 可以确认 的是， DUOX1 基。

27、因与皮肤细胞分化有关， 更为具体地， DUOX1 基因表达的增加与皮肤细胞分 化有关。 0037 【实施例 2】 对根据删除 DUOX1 时纤聚蛋白基因和各种分化标记的表达的变化的评 估 0038 从 Dharmacone 购买能够抑制 DUOX1 或 DUOX2 基因的表达的 siRNA（SMARTPOOL） 。 0039 如同实施例 1， 培养正常人表皮角质形成细胞， 而后在 6 孔板上以 2104cells/ cm2 标准进行培养。待 24 小时后， 用 RNAi MAX 试剂 （Invitrogen）将 50nM 的 DUOX1 或 DUOX2 的 siRNA 分别进行转染。6 小时后。

28、更换细胞培养基。转染完 24 小时后， 用 10ml 的磷 酸盐缓冲液 （PBS） 清洗所述细胞 2 次， 然后用 Trizol 试剂 （Invitrogen， 美国加利福尼亚 说 明 书 CN 103443291 B 6 5/6 页 7 洲卡尔斯巴德） 从所述细胞中分离出细胞内所有的 RNA。用 RNA 试剂盒 （Qiagen RNeasy 试 剂盒 , Qiagen, 加利福尼亚洲瓦伦西亚） 再次提纯所述分离出的 RNA， 然后用安捷伦 2100 生物分析仪 （Agilent 2100 BioAnalyzer， Agilent Technologies， 美国加利福尼亚州圣克 拉拉） 检测。

29、 RNA 质量。用反转录试剂盒 （Superscript Reverse Transcriptase (RT) II kit， Invitrogen 公司 , 加利福尼亚洲卡尔斯巴德） 从分离出的 RNA 中合成 cDNA， 而后用 实时定量逆转录聚合酶链式反应方法 （real time-reverse transcription polymerase chain reaction， Q-RT-PCR） 进行定量分析。使用 TaqMan 基因表达检测试剂盒 （Applied Biosystems 公司， 加利福尼亚洲福斯特市） 评估 DUOX1（Hs00213694_m1） 和作为人表皮角质 。

30、形成细胞分化的标记基因的纤聚蛋白 （基因库登记号 ： NM_002016） （Hs00856927_g1） 、 兜甲 蛋白 （基因库登记号 ： NM_000427） （Hs01894962_s1） 、 角蛋白 1（基因库登记号 ： NM_006121） （Hs00196158_m1） 、 角蛋白 10（基因库登记号 ： NM_000421） （Hs00166289_m1） 的表达模式的 变化。其结果在图 2-4 中展示。 0040 图 2 为展示了 DUOX1 或 DUOX2 的表达水平在用 DUOX1 或 DUOX2 siRNA 处理时相比 未经处理的对照组时的图表。 图3为展示了纤聚蛋白和。

31、兜甲蛋白基因的表达水平在用DUOX 1 或 DUOX 2 siRNA 处理时相比未经处理的对照组时的图表， 图 4 为以相同方法展示角蛋白 1 和角蛋白 10 基因的表达水平的图表。 0041 如上述结果所示， 当用 DUOX1 或 DUOX2 siRNA 处理时 DUOX1 或 DUOX2 基因的表达 水平会下降。进一步， 与未用 DUOX1 或 DUOX2 的 siRNA 处理时相比， 纤聚蛋白、 兜甲蛋白、 角 蛋白 1 和角蛋白 10 基因的表达水平都会下降。亦即， 可以确定的是， 当删除 DUOX1 时参与 皮肤细胞分化的基因的表达水平会下降。 0042 【实施例 3】 对测试物质的。

32、如 DUOX1 和纤聚蛋白的基因的表达水平的评估 0043 已知， 三百草或楝属 （melia） 的提取物能够促进皮肤细胞分化， 通过使用三百草和 楝属的提取物检测 DUOX1、 纤聚蛋白、 角蛋白 1 和角蛋白 10 的表达水平。 0044 从龙沙公司 （Lonza, Inc.， 美国马里兰州沃克斯维尔） 购买正常人表皮角质形成 细胞， 在 37 C 和 5%CO2 的 CO2 培养箱内的 KBM-2（Clonetics CC-3103） 培养基中进行培 养。 0045 将未经处理的人表皮角质形成细胞培养组 （对照组） 和用 10M 的三百草或楝属 的提取物处理的人表皮角质形成细胞培养组分别。

33、培养 24 小时。所述三百草和楝属的提取 物是从韩国 Plank 提取库购买的。待用三百草或楝属的提取物处理完 24 小时后， 用 10ml 的磷酸盐缓冲液 （PBS） 清洗所述细胞， 然后用 Trizol 试剂 （Invitrogen， 美国加利福尼亚 洲卡尔斯巴德） 从此细胞中分离出细胞内的所有 RNA。用 RNA 试剂盒 （Qiagen RNeasy 试剂 盒 , Qiagen, 加利福尼亚洲瓦伦西亚） 再次提纯所述分离出的 RNA， 然后用安捷伦 2100 生 物分析仪 （Agilent 2100 BioAnalyzer， Agilent Technologies， 美国加利福尼亚州圣。

34、克拉 拉） 检测 RNA 质量和浓度。用反转录试剂盒 （Superscript Reverse Transcriptase (RT) II kit， Invitrogen 公司 , 加利福尼亚洲卡尔斯巴德） 从分离出的 RNA 中合成 cDNA， 通过 实时定量逆转录聚合酶链式反应 （real time-reverse transcription polymerase chain reaction， Q-RT-PCR） 对基因表达的变化进行定量分析。使用 TaqMan 基因表达检测试剂盒 （Applied Biosystems公司， 加利福尼亚洲福斯特市） 评估DUOX1 （Hs0021369。

35、4_m1） 和作为人 表皮角质形成细胞分化的标记基因的纤聚蛋白 （Hs00856927_g1） 、 角蛋白 1（Hs00196158_ 说 明 书 CN 103443291 B 7 6/6 页 8 m1） 、 角蛋白 10（Hs00166289_m1） 的基因表达模式的变化。其结果在图 5 和图 6 中展示。 0046 图 5 为展示了 DUOX 1 和纤聚蛋白的表达水平在用三百草或楝属的提取物处理皮 肤表皮角质形成细胞时相比未经处理时的图表， 而图 6 为以相同方法展示角蛋白 1 和角蛋 白 10 基因的表达水平的图表。 0047 如上述结果所示， 三百草或楝属的提取物能显著地增加人表皮角质形成细胞内的 DUOX1基因、 纤聚蛋白、 角蛋白1和角蛋白10基因的表达水平。 亦即， 可以确定的是， 具有皮 肤细胞分化促进效果的物质， 进一步具有皮肤保湿、 增强皮肤屏障功能以及降低或治疗特 应性症状的效果的物质可以增加所述基因的表达水平。 说 明 书 CN 103443291 B 8 1/3 页 9 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 103443291 B 9 2/3 页 10 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 103443291 B 10 3/3 页 11 图 5 图 6 说 明 书 附 图 CN 103443291 B 11 。