技术领域
本发明涉及单链抗体通过在大肠杆菌体内定点糖基化后，利用糖链标签进 行以共价键定向固定单链抗体的方法，属于生物技术领域。
背景技术
单链抗体只保留了全抗体和抗原结合部位，包含全抗体轻链和重链的超变 区，以10-30个氨基酸柔链相连，保持和全抗体抗原结合区非常相近的结构，是 最小的重组抗体片段，只有全抗体的1/8。和全抗体相比，单链抗体的应用可以 提高单位面积固定抗体的数量，大幅提高免疫传感器的敏感性。目前，已有大 量应用单链抗体研制免疫传感器及免疫检测研究报道，单链抗体非常有前途代 替全抗体进行免疫检测及相关免疫传感器制备。
在免疫检测领域，限制单链抗体应用的主要技术障碍就是单链抗体固定的 问题。由于其分子小，难于稳定固定在固体表面，或固定后部分抗体失去活性。
目前，固定单链抗体的方法主要是通过基因工程法引入特定标签，通过标 签定向固定单链抗体。以非共价键的方式定向固定单链抗体的研究报道很多， 如在单链抗体C末端或柔链间引进组氨酸、精氨酸柔链标签或融合能和材料表面 特定分子结合的短肽标签，如能与生物素特异结合的链霉素结合蛋白片段、能 与链霉素结合蛋白结合的短肽、能与聚苯乙烯特异结合肽或与纤维素结合蛋白 等标签。单链抗体通过这些标签和固体材料表面进行离子间的相互吸附或分子 间的特异结合，以非共价键形式与固体材料表面特异结合，实现定向固定单链 抗体，提高单链抗体被固定后免疫传感器的敏感性。但是，分子间以非共价键 的方式结合的牢固程度与以共价键分子间的结合的牢固性相比相差甚远，单链 抗体容易脱离固体材料表面。目前，通过共价键定向固定单链抗体的方法主要 是通过基因工程法在单链抗体的C末端加上半胱氨酸而引入巯基，从而使单链抗 体能与材料表面的特殊基团结合形成共价键来定向固定单链抗体。由于在单链 抗体的C末端引入巯基，这很容易使单链抗体在表达过程中或在分离纯化过程 中，极易在单链抗体间或与单链抗体自身的巯基间形成二硫键产生二聚体或多 聚体，从而影响单链抗体结合抗原活性。
大肠杆菌表达系统是基因表达技术中发展最早，是目前应用最广泛的外源 蛋白质表达系统。该系统可以快速、高效和低成本地大量生产外源蛋白，表达 水平一般较真核表达系统高，某些外源基因在大肠杆菌中的表达量可达总蛋白 的5％～30％，且下游工艺简单、易于控制。但是，传统的大肠杆菌表达系统缺 乏真核细胞所特有的翻译后加工修饰系统，如无法糖基化修饰外源蛋白质。
图4为抗荧光素单链抗体4M5.3基因结构表达框图。该4M5.3基因是由抗荧光 素单链抗体基因，该基因在2006年Protein Sceince(ISSN:0961-8368) 15(2):324-334上有详细描述。图1是抗荧光素单链抗体4M5.3晶体结构。
现有技术，人们系统地研究了空肠弯曲菌(C.jejuni 81116)糖基化蛋白质途 径和在大肠杆菌中糖基化机制。通过空肠弯曲菌(C.jejuni 81116)来源的pgl基 因簇编码合成糖链和寡糖转移酶所需的一系列酶基因，在大肠杆菌中与目的单 链抗体共表达可实现定点糖基化单链抗体，原理如图2所示；其中，图1和图2 中，VL N-term：轻链N末端；VL C-term:轻链C末端；VH N-term：重链N末 端；VH C-term：重链C末端；Antigen：抗原分子；Glycan Chain：多糖链。
目前国内外尚无利用糖基化单链抗体的糖链作为共价定向固定单链抗体标 签的报道。
发明内容
本发明提供一种利用糖链进行以共价键定向固定单链抗体的方法，可广泛 应用于利用单链抗体进行免疫检测、免疫传感器制备。
为了达到上述目的，本发明一种利用糖链标签以共价键定向固定单链抗体 的方法，包括如下步骤：
S1、在单链抗体基因的5′端，或者3′端，或者是在柔链区引入编码寡糖转移 酶识别序列：D/E-X-N-X-S/T；将重组后的单链抗体基因连接到原核质周腔表 达载体；
其中，D代表天冬氨酸，E代表谷氨酸，N代表天冬酰胺，S代表丝氨酸，T 代表苏氨酸，X代表天然20中氨基酸中的任意一种氨基酸；
S2、将所述表达载体转化到含有来源于空肠杆菌由氯霉素抗性标记的pgl基 因族工程菌株CLM37，然后，将阳性转化子进行自诱导表达；
S3、收集菌体，提取质周腔可溶蛋白，分离纯化糖基化单链抗体；
S4、用高碘酸钠氧化糖基化单链抗体后，用醋酸钠缓冲液透析去掉高碘酸钠 后，将单链抗体通过氧化糖链产生的醛基固定在带有酰肼基团或氨基基团的固 体材料表面，实现以共价键定向固定单链抗体在固体材料表面。
步骤S1所述单链抗体为4M5.3。
优选方式下，步骤S2的自诱导表达过程包括：
将所述阳性转化子接种到LB培养基中，250rpm、37℃培养，直至OD600 达到0.4～0.6，5000rpm离心，弃掉培养基，添加相同体积的ZYP-5052丰富培 养基，250rpm、20～30℃培养，进行自动诱导表达18至24小时。
所述LB培养基中含有氨苄青霉素和氯霉素，终浓度分别为200和64微克每 毫升；
所述ZYP-5052培养基的配制包括如下步骤：
A、先配制ZY培养基925毫升，含10克蛋白胨,5克酵母提取物；
20×NPS储备液，其中，1升蒸馏水中含66克(NH4)2SO4，136克KH2PO4， 142克Na2HPO4；
50×5052储备液，其中，1升含有250克甘油，25克葡萄糖，100克α- 乳糖；
1摩尔MgSO4；高压灭菌15分钟；
B、500毫升自动诱导培养基中含有464毫升所述ZY培养基，0.5毫升1摩 尔MgSO4，10毫升50×5052，25毫升20×NPS。
优选方式下，步骤S4的具体过程为：在0.1摩尔pH5.5的醋酸钠缓冲液中经 10毫摩尔高碘酸钠氧化，用0.1摩尔pH5.5的醋酸钠缓冲液透析去掉高碘酸钠； 将氧化过的单链抗体直接与含有酰肼基团或氨基基团的固体在室温共孵育1小 时，然后用pH7.4的磷酸缓冲液冲洗，完成单链抗体通过糖链标签定向固定在 固体表面。
最优方式下，步骤S4为：用10毫摩尔高碘酸钠，在0.1摩尔pH5.5的醋酸 钠缓冲液中氧化30分钟。将氧化过的单链抗体直接与含有氨基基团的固体在室 温共孵育1小时，然后用pH7.4的磷酸缓冲液冲洗，完成单链抗体通过糖链标 签定向固定在固体表面。
优选方式下，步骤S3为：收集菌体，用低渗的方法制备质周腔可溶蛋白， 用Ni柱纯化His-Tag的单链抗体。
通过空肠弯曲菌(C.jejuni 81116)来源的pgl基因簇编码合成糖链和寡糖 转移酶所需的一系列酶基因，在大肠杆菌中与目的单链抗体共表达可实现定点 糖基化单链抗体。本发明应用该系统，成功实现利用定点糖基化单链抗体，开 创性地应用单链抗体上的糖链以共价键定向固定单链抗体在含有氨基的固体表 面。与随机固定单链抗体相比，活性大幅度提高，本发明方法可为单链抗体广 泛应用于免疫检测领域开辟新途径。
本发明利用糖链标签以共价键定向固定单链抗体的方法。该方法可将单链 抗体广泛应用于免疫检测及免疫传感器制备，属于生物技术领域。该方法包括 以下步骤：1、在大肠杆菌中定点糖基化单链抗体。通过单链抗体基因在大肠杆 菌中与来源于空肠杆菌的pgl基因族共表达，定点糖基化单链抗体；2、用高碘 酸钠氧化糖基化的单链抗体上的糖链产生醛基，单链抗体通过醛基将单链抗体 以共价键方式定向固定在含有氨基功能基团的固体材料表面，提高被固定单链 抗体的稳定性及活性。该方法提供以共价键定向固定单链抗体新途径。为单链 抗体广泛应用于免疫检测领域提供新技术。
本发明方法简单、快速、高效。本发明适于各种单链抗体固定在各种表面 具有酰肼基团或氨基基团的固体介质表面上，比随机固定的单链抗体活性提高2 至4倍，适于各种需要共价固定单链抗体的各种用途。
附图说明
图1是抗荧光素单链抗体4M5.3晶体结构。
图2是单链抗体糖基化位点模式图。
图3为通过共价键定向固定糖基化单链抗体在固体材料表面模式图。
图中，Oxidation:氧化处理；Glycan Chain：糖链；Amino-ethyl group：氨基 活性基团；scFv：单链抗体；Immobilization：固定。
图4抗荧光素单链抗体4M5.3基因结构表达框图。
图5分离纯化糖基化单链抗体4M5.3的SDS-PAGE分析图。
图6ELISA检测固定单链抗体4M5.3后活性图。
图7是pIG6载体图谱。
具体实施方式
一种利用糖链标签以共价键定向固定单链抗体的方法,包括以下步骤：
(1)在单链抗体基因的5′端，或者3′端，或者是在柔链区引入编码寡糖转移 酶识别序列(D/E-X-N-X-S/T。D代表天冬氨酸，E代表谷氨酸，N代表天冬酰 胺，S代表丝氨酸，T代表苏氨酸，X代表天然20中氨基酸中的任意一种氨基 酸)，将重组后的单链抗体基因连接到原核质周腔表达载体。
(2)将构建好的单链抗体基因质周腔表达载体转化到含有来源于空肠杆菌 (Campylobacter jejuni)的pgl基因族(氯霉素抗性标记)工程菌株CLM37(该 菌株是通过缺失大肠杆菌K12菌株W3110(F-lambda-IN(rrnD-rrnE)1rph-1，)中 的WecA基因(WecA是O抗原起始乙酰葡萄糖胺糖苷转移酶基因)获得的工程 菌)，然后,将鉴定过的阳性转化子进行自诱导表达，诱导表达18-24小时，培养 基中所加的氨苄青霉素和氯霉素终浓度分别为200和64微克每毫升。
(3)收集菌体，提取质周腔可溶蛋白，分离纯化糖基化单链抗体。其中，选 用低渗的方法制备质周腔可溶蛋白，用Ni柱纯化His-Tag的单链抗体。
(4)用10毫摩尔高碘酸钠氧化糖基化单链抗体后，用0.1摩尔pH5.5的醋酸钠缓 冲液透析去掉高碘酸钠后，将单链抗体通过氧化糖链产生的醛基固定在带有酰 肼基团或氨基基团的固体材料表面，实现以共价键定向固定单链抗体在固体材 料表面。图3为通过共价键定向固定糖基化单链抗体在固体材料表面模式图。具 体说，用10毫摩尔高碘酸钠，在0.1摩尔pH5.5的醋酸钠缓冲液中氧化30分钟。将 氧化过的单链抗体直接与含有氨基基团的固体在室温共孵育1小时，然后用 pH7.4的磷酸缓冲液冲洗，完成单链抗体通过糖链标签定向固定在固体表面。该 方法适用于各种表面带有氨基功能基团的固体材料。
上述的大肠杆菌优选的表达菌株为大肠杆菌CLM37,该菌株是大肠杆菌 W3110衍生菌株，在wecA位点有一个突变，使该菌株不能组装O抗原糖链链。
上述的自动诱导表达条件为：将转化子接种到LB培养基的三角瓶中，250 rpm、37℃培养，直至OD600达到0.4-0.6，5000rpm离心，弃掉培养基，添加 相同体积的ZYP-5052丰富培养基，250rpm、20至30℃培养，进行自动诱导表 达18至24小时。
步骤(4)中，分离纯化后的定点糖基化单链抗体，在0.1摩尔pH5.5的醋酸钠 缓冲液中经10毫摩尔高碘酸钠氧化，用0.1摩尔pH5.5的醋酸钠缓冲液透析去 掉高碘酸钠。将单链抗体通过氧化糖链产生的醛基固定在带有酰肼基团或氨基 基团的固体材料表面，实现以共价键定向固定单链抗体在固体材料表面。将氧 化过的单链抗体直接与含有酰肼基团或氨基基团的固体在室温共孵育1小时， 然后用pH7.4的磷酸缓冲液冲洗，完成单链抗体通过糖链标签定向固定在固体 表面。
图4为抗荧光素单链抗体4M5.3基因结构表达框图。该4M5.3基因是由抗 荧光素单链抗体基因，该基因在2006年Protein Sceince(ISSN:0961-8368) 15(2):324-334上有详细描述。图1是抗荧光素单链抗体4M5.3晶体结构。
下面以具体实施方式对本发明作进一步的说明，但并不影响本发明的保护 范围。
实施例一
本实施例采用抗荧光素单链抗体4M5.3基因为模式基因，在C末端引入糖 基化识别位点序列，将基因通过基因重组构建到pIG6，该载体在Journal of Biotecnology(ISSN:0168-1656)，2005年120(1):p.38-45上有详细描述，载体图 谱见图7。载体序列见序列表[0002]，是大肠杆菌质周腔表达载体。该载体在目 的基因上游具有编码ompA信号肽序列，能引导重组蛋白进入大肠杆菌质周腔 中，是重组蛋白定位于质周腔中，便于重组蛋白折叠及进行糖基化修饰。
本发明所述的表达菌株为大肠杆菌CLM37,该菌株是大肠杆菌W3110衍生 菌株，在wecA位点有一个突变，该菌株不能组装O抗原糖链。
本发明所用的pACYC184(pgl)载体为瑞士苏黎世联邦理工学院Markus Aebi 教授提供。该载体携带编码糖链合成、糖链翻转及糖链转移所需酶。于2005年 在Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America (ISSN：0027-8424)，102(8):3016-3021上有详细介绍，该载体是由pACYC184 载体上携带编码空肠杆菌(C.jejuni)pgl基因簇。
步骤1：构建的表达载体为pIG6-4M5.3-N-Gly。糖基化识别位点在单链抗 体的C端，编码赖氨酸-天冬氨酸-苯丙氨酸-天冬酰胺-精氨酸-丝氨酸-赖氨酸氨 基酸序列(缩写为KDFNRSK)。
将序列表[0001]所示的抗荧光素单链抗体4M5.3基因表达框序列合成后(南 京金斯瑞生物科技有限公司)，用EcoR I和HindIII构建到大肠杆菌表达载体 pIG6上，得到重组载体pIG6-4M5.3-N-Gly。
步骤2：将构建好的表达载体点击转化含有pACYC184(pgl)的CLM37大肠 杆菌菌株，然后经过鉴定过的转化子接种到10毫升含有氨苄青霉素(200微克 每毫升)和氯霉素(68微克每毫升)的LB培养基中，过夜培养。次日,以1:100 接种到500毫升含有氨苄青霉素(200微克每毫升)和氯霉素(68微克每毫升) LB培养基的2升三角瓶中,200rpm、37℃培养，直至OD600达到0.6，然后，5000× g离心，弃去LB培养基，添加500毫升自动诱导培养基，含有氨苄青霉素(200 微克每毫升)和氯霉素(68微克每毫升)。在25℃、200rpm条件下进行自动诱 导表达16小时,在此过程,在大肠杆菌质周腔中实现定点糖基化单链抗体。重组 载体pIG6-4M5.3-N-Gly转化含有pACYC184的CLM37大肠杆菌菌株，用上述 步骤进行未进行糖基化单链抗体对照。
上述自动诱导培养基可以通过以下过程配制：先配制ZY培养基925毫升， 含10克蛋白胨(Tryptone),5克酵母提取物(yeast extract)；20×NPS储备液(1 升蒸馏水中含66克(NH4)2SO4，136克KH2PO4，142克Na2HPO4)；50×5052 (1升含有250克甘油，25克葡萄糖，100克α-乳糖；1摩尔MgSO4)。以上试 剂高压灭菌15分钟。500毫升自动诱导培养基中含有464毫升ZY，0.5毫升1 摩尔MgSO4，10毫升50×5052，25毫升20×NPS。
步骤3:通过常规方法制备可溶蛋白,用Ni柱纯化His-Tag的单链抗体，纯化 的糖基化单链抗体4M5.3和未糖基化单链抗体4M5.3如图5所示，图中，1.糖 基化单链抗体4M5.3.2.未糖基化的4M5.3，M.蛋白质标准分子量。
分离纯化后的定点糖基化单链抗体4M5.3，经TEV蛋白酶去掉His-Tag后， 在0.1摩尔pH5.5的醋酸钠缓冲液中经10毫摩尔高碘酸钠氧化(NaIO4)30分 钟后，用0.1摩尔pH5.5的醋酸钠缓冲液透析去掉高碘酸钠，使用PIERCE公司 的Dialysis cassette Slide-A-Lyzer，3.5K进行透析。同时，将等量的定点糖基化 的单链抗体4M5.3未经高碘酸钠处理为对照，进行固定比对。
步骤4:将步骤3处理获得的单链抗体4M5.3,不同浓度稀释后，各取100 微升加到Costar公司的Carbohydrate Binding Plate，室温孵育1小时。然后用 pH7.4的磷酸缓冲液冲洗三次，完成单链抗体通过糖链标签定向固定在固体表 面。进行活性检测前用3％BSA封闭的1个小时。
步骤5：4M5.3单链抗体固定后活性检测。将100微升100微摩尔的 5(6)-(Biotinamidohexanoylamido)pentylthioureidyl-fluorescein(Sigma)加到步骤4 已经固定单链抗体4M5.3的96孔板，室温孵育1小时。然后用含有0.1％吐温 的pH7.4磷酸缓冲液冲洗5次。再加稀释后的Streptavidin-Peroxidase(Sigma)(用 含有3％的BSA的PBS(pH7.4)稀释0.1毫克/毫升的Streptavidin-Peroxidase 1000-5000倍)，共孵育1小时，再用含有0.1％吐温的pH7.4磷酸缓冲液冲洗5 次后，加TMB(Sigma)显色10分钟，用50微升1M的H2SO4终止反应，用酶 标仪在450nm检测吸光值。结果如图6所示。结果显示,4M5.3单链抗体经10mM 的NaIO4氧化固定后，活性提高。
本发明实施方式不限此，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术 知识和通用方法，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，本发明还可以有 其它的实施方式。如可以用其它的大肠杆菌质周腔表达载体等表达单链抗体， 糖基化识别序列还可以是其它任何能被识别并转移糖链的序列，如天冬氨酸-谷 氨酰胺-天冬酰胺-丙氨酸-苏氨酸(缩写为-DQNAT)糖基化识别位点序列等。因 此，本发明还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更，均落在本发明权利 保护范围之内。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局 限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本 发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护 范围之内。