技术领域
本发明属于多肽和/或蛋白质的化学修饰技术领域，具体而言，本发明涉及一种基于缺电子苯甲醛类化合物的无催化剂添加的腙连接多肽或蛋白质化学修饰方法。
背景技术
多肽及蛋白质化学修饰从无到有发展至今一直都是化学生物学领域中极为重要的一个部分(Angew.Chem.Int.Ed.2009，48，6974.)。腙连接反应因其良好的生物正交性在多肽及蛋白质化学修饰领域有广泛应用。目前应用腙连接方法进行多肽及蛋白质修饰的方法主要有以下几种：
(1)基于苯胺或苯胺类催化剂催化的腙连接反应。多肽及蛋白质修饰反应需要在中性条件下进行，然而腙连接反应在不外加催化剂时在中性pH下的反应效率极低，而外加入苯胺或者苯胺类催化剂可以极大的提高腙连接反应在中性pH下的反应效率(Angew.Chem.，Int.Ed.2006，45，7581.)。然而，催化剂的用量较多，会增加反应体系的复杂性，并且苯胺类物质还具有较高的生物毒性。因此，在实践中，这种外加入催化剂的腙连接方法的应用受到很大的限制。
(2)基于快速反应试剂的无催化剂添加的腙连接反应。通过优化腙连接反应的底物分子结构获得快速反应试剂，这种结构优化的试剂可在不添加催化剂的中性pH下进行高效的腙连接反应。常见的应用快速反应试剂的腙连接反应有下述三种：第一种是基于喹啉-8-甲醛或者吡啶-2-甲醛的腙连接反应，这两种化合物可以在中性条件下与苯肼高效反应(J.Am.Chem.Soc.2013，135，17663.)；第二种是基于磷酸吡哆醛的腙连接反应，这种化合物可以进一步携带荧光分子，并对蛋白质实现腙连接反应修饰(Bioconjugate Chem.2012，23，2329.)；第三种是基于邻氯苯甲醛的腙连接反应，这种化合物也可进一步携带荧光分子，并对多肽及蛋白质实现腙连接反应修饰(Chem.Commun.2015，51，13189.)。
迄今为止，传统的腙连接反应因需要添加毒性催化剂，而被限制了应用范围。新型的无催化剂添加的腙连接反应的方法虽然有不少，但是能便捷普适的用于肽和/或蛋白质修饰的方法却不多，有些方法仅仅实现模型分子层面的反应，有些则只能对多肽及蛋白质进行简单的荧光分子的修饰。因此，本领域仍然需要研发快速、高效的无催化剂添加的腙连接多肽和/或蛋白质修饰方法。
发明内容
为了克服现有的腙连接多肽和/或蛋白质修饰方法的缺点，本发明的目的是研发一种快速、高效的无催化剂添加的腙连接多肽和/或蛋白质修饰方法。
具体而言，本发明人通过在2-氯苯甲醛的对位引入了拉电子取代基(烯烃双键)使醛基具备缺电子性，进而提高醛基反应活性。该类缺电子苯甲醛类化合物可作为一种快速反应试剂用于无催化剂添加的腙连接反应，通过借助这种快速反应试剂或其衍生物对多肽或蛋白质进行复杂分子的修饰。利用这种方法，本发明不仅能够实现多肽或蛋白质的简单分子修饰(如荧光分子)，还可以实现对于蛋白质进行复杂药物分子的修饰反应。因此，本发明提供了一种高效便捷且普适性好的无催化剂添加的腙连接多肽或蛋白质修饰方法。在此基础上，本发明人完成了本发明。
在第一方面，本发明提供一种无催化剂添加的腙连接多肽或蛋白质修饰方法，所述方法包括下述步骤：
在水相缓冲液的条件下，以式III所示的缺电子的苯甲醛类化合物作为亲电试剂，以式II所示的多肽或蛋白质的酰肼作为亲核试剂进行腙连接反应，得到具有通式I所示的结构的腙连接产物。反应式示意如下：
所述水相缓冲液为盐类缓冲液，优选PBS缓冲液、PME水相缓冲液等常见生物缓冲液，更优选使用PME水相缓冲液(100mM PIPES，1mM MgSO4，2mM EGTA，pH 6.0-8.0)。本领域技术人员能够选择合适的水相缓冲液。
所述亲核试剂是多肽或蛋白质的酰肼，其可以选自具有通式II结构的化合物。本领域技术人员应该理解，多肽或蛋白质的酰肼可以通过本领域常规的固相多肽或蛋白质合成技术或基因重组表达技术制备得到。
其中通过基因重组表达技术制备多肽或蛋白质的酰肼的方法是本领域常规的方法，例如，以泛素蛋白酰肼(Ub(1-75)酰肼)为例，其重组表达方法如下：使用构建的pTXB1-Ub(1-75)重组表达载体(其中表达载体pTXB1购自New England Biolab，Beverly，MA；全合成引物购自生工生物工程(上海)股份有限公司，其中5’引物为5’-GGTGGTCATATGCCGTCCGAGAAGACCT-3’，3’引物为5’-GGTGGTTGCTCTTCCGCACGTCTCCTGGGAGGC-3’；酶切位点为NdeI和BspQI；编码的蛋白序列为MQIFVKTLTGKTITLEVEPSDTIENVKAKIQDKEGIPPDQQRLIFAGKQLEDGRTLSDYNIQKESTLHLVLRLRG；利用常规分子克隆技术构建)转化进大肠杆菌ER2566(NEB)细胞。使用添加了0.2mM IPTG的1升LB培养基培养细胞至OD600达到0.6。细胞液使用超声破碎并且离心沉淀不溶物，收集上清。使用几丁质树脂回收蛋白，并用切割缓冲液(20mM Tris-HCl，300mM NaCl，4％NH2NH2·H2O，pH 7.5)处理吸附有蛋白的树脂约4小时。收集切割缓冲液并使用超滤管浓缩至小体积，再使用分析型色谱以及质谱进行分析鉴定，之后再使用半制备色谱进行分离，最终得到泛素蛋白质酰肼。对于其他多肽或蛋白质的酰肼，本领域技术人员也能够根据需要选择合适的固相多肽或蛋白质合成技术或基因重组表达技术进行制备。
所述亲电试剂是缺电子的苯甲醛类化合物，其可以选自具有通式III结构的化合物，其中，R可以为结构多变的取代基，如小分子化合物取代基，例如，但不限于，甲基、荧光分子取代基、药物分子取代基等。
从式III的结构式来看，苯环上的烯烃双键的拉电子性使得处于苯环对位的醛基处于缺电子的状态，从而增强了醛基的反应活性。
优选地，所述亲电试剂如式1所示(即，此时R为CH3)或式2所示(即，此时R为)：
式1的化合物的名称为(E)-3-(3-氯-4-甲酰基苯基)丙烯酸甲酯[methyl(E)-3-(3-chloro-4-formylphenyl)acrylate]；
式2的化合物的名称为(E)-3-(3-氯-4-甲酰基苯基)丙烯酸2-((7-硝基苯并[c][1，2，5]噁二唑-4-基)氨基)乙酯[2-((7-nitrobenzo[c][1，2，5]oxadiazol-4-yl)amino)ethyl(E)-3-(3-chloro-4-formylphenyl)acrylate]。
在一个实施方案中，本发明人合成了式3所示的亲电试剂，其对应通式III中R为达沙替尼药物分子取代基。
式3的化合物的名称为(E)-3-(3-氯-4-甲酰基苯基)丙烯酸2-(4-(6-((5-((2-氯-6-甲基苯基)氨甲酰基)噻唑-2-基)氨基)-2-甲基嘧啶-4-基)哌嗪-1-基)乙酯[2-(4-(6-((5-((2-chloro-6-methylphenyl)carbamoyl)thiazol-2-yl)amino)-2-methylpyrimidin-4-yl)piperazin-1-yl)ethyl(E)-3-(3-chloro-4-formylphenyl)acrylate]。
在所述腙连接反应中，本发明所述的亲核试剂的浓度为10-1000微摩尔/升，亲电试剂浓度为10-20000微摩尔/升。
本发明所述亲电试剂的摩尔用量为亲核试剂的摩尔用量的1-20倍，优选为5-10倍。
上述腙连接反应的酸碱度为pH 4-pH 10，优选为pH 5-pH 8；温度为10℃-45℃，优选为20℃-30℃，更优选为25℃；反应时间为5min-48h，优选为10min-24h，更优选为30min-2h，最优选为1h。
在第二方面，本发明提供式III所示的缺电子苯甲醛类化合物。
在式III中，R可以为结构多变的取代基，如小分子化合物，例如，但不限于，甲基、荧光分子取代基、药物分子取代基等。
优选地，所述式III所示的亲电试剂如式1所示(即，此时R为CH3)或式2所示(即，此时R为)：
式1的化合物的名称为(E)-3-(3-氯-4-甲酰基苯基)丙烯酸甲酯[methyl(E)-3-(3-chloro-4-formylphenyl)acrylate]；
式2的化合物的名称为(E)-3-(3-氯-4-甲酰基苯基)丙烯酸2-((7-硝基苯并[c][1，2，5]噁二唑-4-基)氨基)乙酯[2-((7-nitrobenzo[c][1，2，5]oxadiazol-4-yl)amino)ethyl(E)-3-(3-chloro-4-formylphenyl)acrylate]。
优选地，所述式III所示的亲电试剂如式3所示，其对应通式III中R为达沙替尼药物分子的取代基。
式3的化合物的名称为(E)-3-(3-氯-4-甲酰基苯基)丙烯酸2-(4-(6-((5-((2-氯-6-甲基苯基)氨甲酰基)噻唑-2-基)氨基)-2-甲基嘧啶-4-基)哌嗪-1-基)乙酯[2-(4-(6-((5-((2-chloro-6-methylphenyl)carbamoyl)thiazol-2-yl)amino)-2-methylpyrimidin-4-yl)piperazin-1-yl)ethyl(E)-3-(3-chloro-4-formylphenyl)acrylate]。
式1、2和3所示的缺电子的苯甲醛类化合物都是本发明人首次合成的。
其中，式1的合成方法如下：
称取商业购得的4-氨基-2-氯苯腈(1.5g，10mmol)加入到25mL的圆底烧瓶中。向其中加入5mL去离子水以及12mmol的浓盐酸，需要注意的是浓盐酸需缓慢滴加。滴加完成后，继续搅拌30分钟。之后向烧瓶中加入亚硝酸钠(0.76g，11mmol)，搅拌反应直到沉淀物大部分消失(10分钟左右)。观察到此现象后，向烧瓶中加入碘化钾(1.82g，11mmol)，继续搅拌反应1小时。待反应结束后，加入50mL的乙酸乙酯稀释反应，并以此用去离子水和饱和食盐水洗两遍。收集有机相并使用无水硫酸钠干燥，用旋转蒸发仪浓缩后使用色谱法进行分离纯化，即可得到化合物1a(2.24g，8.5mmol)。
取化合物1a(2.24g，8.5mmol)和醋酸钯(190mg，0.85mmol)加入到反应管中，使用双排管进行氩气保护，之后再加入丙烯酸甲酯(0.8mL，8.93mmol)以及无水N，N-二甲基甲酰胺17mL。反应加热至70℃，反应10小时。之后加入50mL乙酸乙酯稀释反应液，再使用去离子水和饱和食盐水各洗两次，收集有机相并使用无水硫酸钠干燥。浓缩后用色谱法分离即可得到化合物1b(0.95g，4.3mmol)。
之后将得到的化合物1b溶解于25mL甲酸，加入兰尼镍后置于105℃加热搅拌。不断补加兰尼镍直至反应结束。之后加入乙酸乙酯稀释反应液，并用去离子水和饱和食盐水各洗两遍，收集有机相并使用无水硫酸钠干燥。浓缩后用色谱法分离即可得到化合物1(0.44g，2mmol)。化合物1的表征见图3(核磁氢谱)和图4(核磁碳谱)。化合物1即为式1所示的亲电试剂。
式2的合成方法如下：
具体的，称取式1所示化合物(0.45g，2mmol)以及一水合氢氧化锂(126mg，3mmol)加入到25mL烧瓶中。加入四氢呋喃∶水＝1∶1(体积比)的混合溶剂10mL。室温下搅拌2小时。待反应结束后，向反应液中加入稀盐酸酸化至pH 2。之后使用二氯甲烷萃取三次，合并有机相并用无水硫酸钠干燥。使用旋转蒸发仪浓缩有机相即可得到含有自由羧基的化合物1c，该化合物不需要进一步纯化，待用。
取商业购得的4-氯-7-硝基苯并呋咱(0.6g，3mmol)加入到10mL圆底烧瓶中，再加入5mL乙醇胺，室温下搅拌10小时。之后加入20mL去离子水稀释反应液并使用二氯甲烷萃取三次。合并有机相并用无水硫酸钠干燥。浓缩后纯化得到式13所示化合物(0.2g，5.4mmol)。
之后再取式13(62mg，0.28mmol)、第一步操作中得到的含有自由羧基的化合物1c(58mg，0.28mmol)、二环己基碳二亚胺(72mg，0.35mmol)以及4-二甲氨基吡啶(3.8mg，0.028mmol)加入反应管中，加入四氢呋喃1mL。搅拌反应10小时。之后反应体系加入去离子水稀释，并使用二氯甲烷萃取水相。合并有机相，浓缩后使用色谱法纯化，即可得到式2所示的化合物(82mg，0.2mmol)。式2的化合物在所尝试的氘带试剂(CDCl3/DMSO-D6/DMF-D7/D2O)中均无法达到有效浓度，故选择使用高分辨质谱进行表征。式2的化合物的表征见图7(高分辨质谱)。
式3所示的亲电试剂(带有达沙替尼取代基)的合成路线如下所示：
具体地，称取式1所示的化合物(0.45g，2mmol)以及一水合氢氧化锂(126mg，3mmol)加入到25mL烧瓶中。向烧瓶中加入四氢呋喃∶水＝1∶1(体积比)的混合溶剂10mL。室温下搅拌2小时。待反应结束后，向反应液中加入稀盐酸酸化至pH 2。之后使用二氯甲烷萃取三次，合并有机相并用无水硫酸钠干燥。使用旋转蒸发仪浓缩有机相即可得到相应的含有自由羧基的化合物1c，该化合物不需要进一步纯化即可进行下一步反应。
取上述含有自由羧基的化合物1c(53mg，0.23mmol)添加到5mL离心管中，并添加0.5mL四氢呋喃溶解。再称取商业购买的达沙替尼(136mg，0.28mmol)、二环己基碳二亚胺(72mg，0.35mmol)以及4-二甲氨基吡啶(3.8mg，0.028mmol)加入反应管中，之后再加入四氢呋喃1mL。搅拌反应10小时。之后向反应体系加入去离子水稀释，并使用二氯甲烷萃取水相。合并有机相，浓缩后纯化，即可得到式3所示的化合物(135mg，0.2mmol)。式3的化合物的表征见图5(核磁氢谱)和图6(核磁碳谱)。
在第三方面，本发明提供式III所示的缺电子苯甲醛类化合物在无催化剂添加的腙连接多肽或蛋白质修饰方法中作为亲电试剂的用途。其中，在式III中，R可以为结构多变的取代基，如小分子化合物，例如，但不限于，甲基、荧光分子取代基、药物分子取代基等。
在具体的实施方案中，本发明涉及式1、式2或式3所示的缺电子苯甲醛衍生物在无催化剂添加的腙连接多肽或蛋白质修饰方法中作为亲电试剂的用途。
在第四方面，本发明提供通过第一方面所述的无催化剂添加的腙连接多肽或蛋白质修饰方法得到的由缺电子的苯甲醛类化合物修饰的多肽或蛋白质。
本领域技术人员应该理解，只要能够通过本发明第一方面所述的无催化剂添加的腙连接多肽或蛋白质修饰方法得到的修饰的多肽或蛋白质都在本发明的范围之内。
为举例说明，本发明人利用第一方面所述的无催化剂添加的腙连接多肽或蛋白质修饰方法修饰了一些具体的多肽或蛋白质，得到了式4-12所示的修饰的多肽或蛋白质。然而，本领域技术人员应该理解，式4-12所示的修饰的多肽或蛋白质仅是用于举例说明的目的，本发明并不限于此。
表1列举了本发明合成的具体化合物式1-12的结构以及质谱数据，但本发明并不仅限于这些化合物。
表1.式1-12的化合物的结构以及质谱数据。
注：在“发明内容”和“具体实施方式”部分详细描述了式1-3的亲电试剂的合成方法以及式9和12的修饰的多肽或蛋白质的获得方法。根据这些内容，本领域技术人员能够合成R为其他取代基团的式III所示的亲电试剂，并且能够用这些亲电试剂进行无催化剂添加的腙连接多肽或蛋白质修饰方法，从而得到相应的修饰的多肽或蛋白质产物。
综上所述，本发明提供下述实施方案：
1.一种无催化剂添加的腙连接多肽或蛋白质修饰方法，所述方法包括下述步骤：
在水相缓冲液的条件下，以式III所示的缺电子的苯甲醛类化合物作为亲电试剂，以式II所示的多肽或蛋白质的酰肼作为亲核试剂进行腙连接反应，得到具有通式I所示的结构的腙连接产物，
其中，在式III中，R为结构多变的取代基，例如，甲基、荧光分子取代基、药物分子取代基等。
2.根据第1项所述的方法，其中所述水相缓冲液为盐类缓冲液，如PBS缓冲液、PME缓冲液等。
3.根据第1项所述的方法，其中所述多肽或蛋白质的酰肼通过固相多肽或蛋白质合成技术或基因重组表达技术制备得到。
4.根据第1项所述的方法，其中所述缺电子的苯甲醛类化合物为式1、式2或式3所示：
5.根据第1项所述的方法，其中所述亲核试剂的浓度为10-1000微摩尔/升，亲电试剂浓度为10-20000微摩尔/升。
6.根据第1项所述的方法，其中所述亲电试剂的摩尔用量为亲核试剂的摩尔用量的1-20倍，优选为5-10倍。
7.根据第1项所述的方法，其中反应的酸碱度为pH 4-pH 10，优选为pH 5-pH 8；温度为10℃-45℃，优选为20℃-30℃，更优选为25℃；反应时间为5min-48h，优选为10min-24h，更优选为30min-2h，最优选为1h。
8.一种缺电子苯甲醛类化合物，其如式III所示：
其中R为结构多变的取代基，例如，甲基、荧光分子取代基、药物分子取代基等。
9.根据第8项所述的缺电子苯甲醛类化合物，其为式1所示。
10.根据第8项所述的缺电子苯甲醛类化合物，其为式2所示。
11.根据第8项所述的缺电子苯甲醛类化合物，其为式3所示。
12.式III所示的缺电子苯甲醛类化合物在无催化剂添加的腙连接多肽或蛋白质修饰方法中作为亲电试剂的用途，
其中R为结构多变的取代基，例如，甲基、荧光分子取代基、药物分子取代基等。
13.根据第12项所述的用途，其中所述缺电子苯甲醛类化合物为式1、式2或式3所示。
14.通过第1-7项任一项的无催化剂添加的腙连接多肽或蛋白质修饰方法得到的由缺电子的苯甲醛类化合物修饰的多肽或蛋白质。
本发明的有益效果是：
(1)相比较于现在的技术，本发明直接使用缺电子苯甲醛类化合物作为亲电试剂并与作为亲核试剂的多肽或蛋白质的酰肼进行反应。体系加料方式简单，不需要添加任何催化剂，并可在水相缓冲液的条件下高效进行。
(2)亲电试剂可以进一步衍生化以携带多种不同结构的取代基，这些衍生物能够通过简单的化学反应合成得到。亲核试剂可以是多肽或者蛋白质的酰肼，两者均可以方便的通过固相多肽合成或者基因重组表达制备得到。
(3)式III所示的亲电试剂中R为结构多变的取代基，例如，甲基、荧光分子取代基、药物分子取代基等，当R为药物分子取代基时，利用本发明的无催化剂添加的腙连接多肽或蛋白质修饰方法能够实现将药物分子与目标多肽或蛋白质的偶联。
附图说明
从下面结合附图的详细描述中，本发明的上述特征和优点将更明显，其中：
图1显示泛素蛋白酰肼的液相色谱图(A)和质谱图(B)。
图2显示实施例3制得的式12所示的产物质谱图。
图3显示式1所示的亲电试剂的核磁氢谱。
图4显示式1所示的亲电试剂的核磁碳谱。
图5显示式3所示的亲电试剂的核磁氢谱。
图6显示式3所示的亲电试剂的核磁碳谱。
图7显示式2所示的亲电试剂的高分辨质谱。
具体实施方式
下面参照具体的实施例进一步描述本发明，但是本领域技术人员应该理解，本发明并不限于这些具体的实施例。
另外，除非具体指明，下述实施例中所用的试剂均为市售试剂。
实施例1制备式1、2和3所示的亲电试剂
(1)式1的亲电试剂通过化学合成制得。具体过程如下：
称取商业购得的4-氨基-2-氯苯腈(1.5g，10mmol，购自梯希爱(上海)化成工业发展有限公司)加入到25mL的圆底烧瓶中。向其中加入5mL去离子水以及12mmol的浓盐酸，需要注意的是浓盐酸需缓慢滴加。滴加完成后，继续搅拌30分钟。之后向烧瓶中加入亚硝酸钠(0.76g，11mmol)，搅拌反应直到沉淀物大部分消失(10分钟左右)。观察到此现象后，向烧瓶中加入碘化钾(1.82g，11mmol)，继续搅拌反应1小时。待反应结束后，加入50mL的乙酸乙酯稀释反应，并以此用去离子水和饱和食盐水洗两遍。收集有机相并使用无水硫酸钠干燥，用旋转蒸发仪浓缩后使用色谱法进行分离纯化，即可得到化合物1a(2.24g，8.5mmol)。
取化合物1a(2.24g，8.5mmol)和醋酸钯(190mg，0.85mmol)加入到反应管中，使用双排管进行氩气保护，之后再加入丙烯酸甲酯(0.8mL，8.93mmol)以及无水N，N-二甲基甲酰胺17mL。反应加热至70℃，反应10小时。之后加入50mL乙酸乙酯稀释反应液，再使用去离子水和饱和食盐水各洗两次，收集有机相并使用无水硫酸钠干燥。浓缩后用色谱法分离即可得到化合物1b(0.95g，4.3mmol)。
之后将得到的化合物1b溶解于25mL甲酸，加入兰尼镍后置于105℃加热搅拌。不断补加兰尼镍直至反应结束。之后加入乙酸乙酯稀释反应液，并用去离子水和饱和食盐水各洗两遍，收集有机相并使用无水硫酸钠干燥。浓缩后用色谱法分离即可得到化合物1(0.44g，2mmol)。化合物1即为式1所示的亲电试剂。式1的化合物的名称为(E)-3-(3-氯-4-甲酰基苯基)丙烯酸甲酯[methyl(E)-3-(3-chloro-4-formylphenyl)acrylate]，其表征见图3(核磁氢谱)和图4(核磁碳谱)。
1H NMR(400MHz，CDCl3)δ10.49(dd，J＝22.1，0.7Hz，1H)，7.94(d，J＝8.1Hz，1H)，7.63(d，J＝16.1Hz，1H)，7.59(d，J＝1.5Hz，1H)，7.52(dd，J＝8.1，0.7Hz，1H)，6.55(d，J＝16.0Hz，1H)，3.84(s，3H).13C NMR(101MHz，CDCl3)δ189.02，166.44，141.71，141.05，138.36，132.96，129.83，129.81，126.51，122.12，52.11。
(2)式2的亲电试剂的合成方法如下：
具体的，称取式1所示的化合物(0.45g，2mmol)以及一水合氢氧化锂(126mg，3mmol)加入到25mL烧瓶中。加入四氢呋喃∶水＝1∶1(体积比)的混合溶剂10mL。室温下搅拌2小时。待反应结束后，向反应液中加入稀盐酸酸化至pH 2。之后使用二氯甲烷萃取三次，合并有机相并用无水硫酸钠干燥。使用旋转蒸发仪浓缩有机相即可得到含有自由羧基的化合物1c，该化合物不需要进一步纯化，待用。
取商业购得的4-氯-7-硝基苯并呋咱(0.6g，3mmol，购自梯希爱(上海)化成工业发展有限公司)加入到10mL圆底烧瓶中，再加入5mL乙醇胺，室温下搅拌10小时。之后加入20mL去离子水稀释反应液并使用二氯甲烷萃取三次。合并有机相并用无水硫酸钠干燥。浓缩后纯化得到式13所示的化合物(0.2g，5.4mmol)。
之后再取式13(62mg，0.28mmol)、含有自由羧基的化合物1c(58mg，0.28mmol)、二环己基碳二亚胺(72mg，0.35mmol，购自百灵威科技有限公司)以及4-二甲氨基吡啶(3.8mg，0.028mmol，购自百灵威科技有限公司)加入反应管中，加入四氢呋喃1mL。搅拌反应10小时。之后反应体系加入去离子水稀释，并使用二氯甲烷萃取水相。合并有机相，浓缩后使用色谱法纯化，即可得到式2所示的化合物(82mg，0.2mmol)。式2的化合物在所尝试的氘带试剂(CDCl3/DMSO-D6/DMF-D7/D2O)中均无法达到有效浓度，故选择使用高分辨质谱进行表征。式2的化合物的表征见图7(高分辨质谱)，其名称为(E)-3-(3-氯-4-甲酰基苯基)丙烯酸2-((7-硝基苯并[c][1，2，5]噁二唑-4-基)氨基)乙酯[2-((7-nitrobenzo[c][1，2，5]oxadiazol-4-yl)amino)ethyl(E)-3-(3-chloro-4-formylphenyl)acrylate]。
(3)式3的偶联有达沙替尼的缺电子苯甲醛类化合物是通过两步化学反应制得：
具体地，称取式1所示的化合物(0.45g，2mmol)以及一水合氢氧化锂(126mg，3mmol)加入到25mL烧瓶中。向烧瓶中加入四氢呋喃∶水＝1∶1(体积比)的混合溶剂10mL。室温下搅拌2小时。待反应结束后，向反应液中加入稀盐酸酸化至pH 2。之后使用二氯甲烷萃取三次，合并有机相并用无水硫酸钠干燥。使用旋转蒸发仪浓缩有机相即可得到相应的含有自由羧基的化合物1c，该化合物不需要进一步纯化即可进行下一步反应。取该含有自由羧基的化合物1c(53mg，0.23mmol)添加到5mL离心管中，并添加0.5mL四氢呋喃溶解。再称取商业购买的达沙替尼(136mg，0.28mmol，购自上海麦克林生化科技有限公司)、二环己基碳二亚胺(72mg，0.35mmol，购自百灵威科技有限公司)以及4-二甲氨基吡啶(3.8mg，0.028mmol，购自百灵威科技有限公司)加入反应管中，之后再加入四氢呋喃1mL。搅拌反应10小时。之后反应体系加入去离子水稀释，并使用二氯甲烷萃取水相。合并有机相，浓缩后纯化，即可得到式3所示的化合物(135mg，0.2mmol)。式3的化合物的表征见图5(核磁氢谱)和图6(核磁碳谱)，其名称为(E)-3-(3-氯-4-甲酰基苯基)丙烯酸2-(4-(6-((5-((2-氯-6-甲基苯基)氨甲酰基)噻唑-2-基)氨基)-2-甲基嘧啶-4-基)哌嗪-1-基)乙酯[2-(4-(6-((5-((2-chloro-6-methylphenyl)carbamoyl)thiazol-2-yl)amino)-2-methylpyrimidin-4-yl)piperazin-1-yl)ethyl(E)-3-(3-chloro-4-formylphenyl)acrylate]。
实施例2制备式9的多肽腙连接产物
该实施例的反应式如下所示：
具体的反应步骤如下：
(1)在空气下，将多肽酰肼(Leu-Tyr-Arg-Ala-Phe-NHNH2)的粉末溶解于PME缓冲液(100mM PIPES，1mM MgSO4，2mM EGTA，pH 7.0)并配制成1mg/mL的储备液，将缺电子苯甲醛化合物1溶解于乙醇中并配制成10mM的储备液。
(2)取一只4mL的塑料圆底离心管，向管中加入1mL PME缓冲液。再取步骤(1)中配制好的多肽酰肼储备液以及缺电子苯甲醛1储备液适量至上述离心管中，两者的最终浓度分别为30μM和200μM。加入一个磁力搅拌子于离心管中，在室温下充分搅拌反应30分钟。
(3)反应30分钟后，取200μL反应液直接进行高效液相色谱以及电喷雾质谱分析。经分析确定得到表1中所示的产物9。
其中多肽酰肼(Leu-Tyr-Arg-Ala-Phe-NHNH2)是通过固相肽合成技术制得。方法如下：
取适量2-氯三苯甲基树脂(购自天津南开和成科技有限公司)于多肽合成管中，二氯甲烷：N，N-二甲基甲酰胺＝1∶1(体积比)的混合溶剂溶胀树脂约30分钟。弃去管中的溶剂，并加入含有20％水合肼的N，N-二甲基甲酰胺溶液至液面没过树脂表面。将反应管置于摇床中反应4小时。之后再加入N，N-二甲基甲酰胺溶剂充分清洗树脂。之后再加入含有20％甲醇的N，N-二甲基甲酰胺的溶液至液面没过树脂表面，将反应管置于摇床反应2小时。之后再使用N，N-二甲基甲酰胺充分清洗树脂，即制得可用于固相肽合成的肼取代2-氯三苯甲基树脂。此后进行固相肽合成操作，需要注意的是在向树脂上耦合氨基酸时需要对商业购买的氨基酸进行预先活化，即在离心管中加入3.6当量的HCTU(6-氯苯并三氮唑-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸酯，购自百灵威科技有限公司)，4当量的氨基酸，用适量N，N-二甲基甲酰胺溶解后加入8当量的DIEA(N，N′-二异丙基乙胺，购自百灵威科技有限公司)，充分混合活化，活化时间控制在1分钟以内。紧接着将活化的氨基酸混合液加入到固相合成管中进行耦合。约1小时后，依次用N，N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷、N，N-二甲基甲酰胺各洗三遍树脂。之后加入含有20％哌啶的N，N-二甲基甲酰胺溶液反应两次，第一次反应2分钟，第二次反应10分钟。此时，树脂继续用N，N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷、N，N-二甲基甲酰胺依此各洗三遍。此时加入下一个预先活化的氨基酸混合液进行耦合，重复上述步骤直到耦合到最后一个氨基酸。使用N，N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷、N，N-二甲基甲酰胺依此各洗三遍树脂，之后使用与前述方法相同的20％哌啶处理树脂两次，分别为2分钟和10分钟。之后依此用N，N-二甲基甲酰胺、二氯甲烷各洗树脂三遍，需要注意的是，最后一次必须用二氯甲烷洗树脂。洗完后加入切割试剂(88％三氟乙酸，5％去离子水，5％苯酚以及2％三异丙基硅烷)，反应2小时后收集切割液并使用氮气鼓泡法浓缩切割液。之后使用预先冷却的乙醚沉淀切割液中的粗肽并离心收集。粗肽用去离子水溶解后使用分析型高效液相色谱以及高分辨质谱进行分析鉴定。通过这种方法得到多肽酰肼。
进一步地，本发明人依据该实施例对所用的各物质的量及反应条件进行试验拓展，结果证明了本发明的技术方案具有良好的多肽或蛋白质的末端氨基酸兼容性。拓展反应式如下：
表2试验拓展
表2列出了依据该实施例对所用的各物质的量及反应条件进行试验拓展的结果。这些结果表明本发明的无催化剂添加的腙连接多肽或蛋白质修饰方法适用于包含不同氨基酸末端的多肽或蛋白质。表2中序号1-6分别对应表1中的式4-9。
实施例3制备式12的蛋白质腙连接产物
该实施例的反应式如下所示：
该实施例可以证明本发明适用于蛋白质与药物分子之间的偶联，今后将有可能应用于抗体药物偶联领域。
具体的反应步骤如下：
(1)在空气下，将泛素蛋白酰肼的粉末溶解于PME缓冲液(100mM PIPES，1mM MgSO4，2mM EGTA，pH 7.0)并配制成1mg/mL的储备液，将偶联有达沙替尼分子的缺电子苯甲醛(式3)溶解于N，N-二甲基甲酰胺中并配制成10mg/mL的储备液。
(2)取一只4mL的塑料圆底离心管，向管中加入1mL PME缓冲液。再取步骤(1)中配制好的蛋白酰肼储备液以及偶联有达沙替尼的缺电子苯甲醛储备液适量至上述离心管中，两者的最终浓度分别为30μM和200μM。加入一个磁力搅拌子于离心管中，并补加200μL N，N-二甲基甲酰胺，在室温下充分搅拌反应30分钟。
(3)反应30分钟后，取50μL反应液直接用高效液相色谱进行取样用以电喷雾质谱分析。得到表1中所示的产物12，其质谱表征情况如图2所示。
图2清楚了显示了制得的式12所示的修饰的泛素蛋白产物的质谱图。这充分证明可以先将药物分子偶联到本发明的缺电子的苯甲醛类化合物骨架上，然后通过无催化剂添加的腙连接多肽或蛋白质修饰方法可以成功地将带有药物分子的缺电子的苯甲醛类化合物与目的多肽或蛋白质偶联，从而实现药物分子与多肽或蛋白质的偶联。
其中，泛素蛋白酰肼是通过重组表达得到的，具体如下：
使用构建的pTXB1-Ub(1-75)重组表达载体(表达载体pTXB1购自New England Biolab，Beverly，MA；全合成引物购自生工生物工程(上海)股份有限公司，其中5’引物为5’-GGTGGTCATATGCCGTCCGAGAAGACCT-3’，3’引物为5’-GGTGGTTGCTCTTCCGCACGTCTCCTGGGAGGC-3’；酶切位点为NdeI和BspQI；编码的蛋白序列为MQIFVKTLTGKTITLEVEPSDTIENVKAKIQDKEGIPPDQQRLIFAGKQLEDGRTLSDYNIQKESTLHLVLRLRG；利用常规分子克隆技术构建)转化进大肠杆菌ER2566(NEB)细胞。使用添加了0.2mM IPTG的1升LB培养基培养细胞至OD600达到0.6。细胞液使用超声破碎并且离心沉淀不溶物，收集上清。使用几丁质树脂回收蛋白，并用切割缓冲液(20mM Tris-HCl，300mM NaCl，4％NH2NH2·H2O，pH 7.5)处理吸附有蛋白的树脂约4小时。收集切割缓冲液并使用超滤管浓缩至小体积，再使用分析型色谱以及质谱进行分析鉴定，之后再使用半制备色谱进行分离，最终得到泛素蛋白酰肼(简称为Ub蛋白质酰肼)，其色谱及质谱表征如图1所示，(A)是纯化后的泛素蛋白酰肼色谱图，(B)是对应的泛素蛋白酰肼质谱图。
应该理解，尽管参考其示例性的实施方案，已经对本发明进行具体地显示和描述，但是本领域的普通技术人员应该理解，本发明并不限于此，在不背离由后附的权利要求所定义的本发明的精神和范围的条件下，可以在其中进行各种形式和细节的变化，可以进行各种实施方案的任意组合。即，依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。