泌尿生殖道支原体培养基及检测方法.pdf

本发明涉及泌尿生殖道微生物培养及检测方法，具体涉及泌尿生殖道解脲脲原体(Uu)和人型支原体(Mh)培养基和检测方法。培养基由液体和固体组成，在培养、分离、鉴别支原体时组合使用。配方含有胰酶大豆肉汤、酵母浸液、尿素、精氨酸、L-半胱氨酸、酚红、HEPES液、小牛(胎牛)血清、硫酸锰、万古霉素、两性霉素B、甲氧苄氨嘧啶、多粘菌素、青霉素等的要素，优化了维持支原体生长的营养、抑制杂菌生长抗生素组合，接种和转种样品不需要微孔滤器，支原体生长迅速；液体培养基具有维持和延长支原体生长对数期、指示生长；固体培养基观察Uu和Mh菌落，与背景反差大容易鉴别，显著提高了泌尿生殖道支原体检测的敏感性和特异性。

1.  泌尿生殖道支原体培养基及检测方法，其特征的组成是由液体和固体培养基组成，根据解脲脲原体(Uu)利人型支原体(Mh)生物学特性，优化了维持支原体生长的营养和环境、抑制杂菌生长抗生素组合，具体涉及培养基配方特征是含有胰酶大豆肉汤、酵母浸液、尿素、精氨酸、L-半胱氨酸、酚红、HEPES液、小牛(胎牛)血清、硫酸锰、万古霉素、两性霉素B、甲氧苄氨嘧啶、多粘菌素、青霉素等的要素和组合；具体涉及其液体培养基和固体培养基在培养、分离、鉴别泌尿生殖道支原体时组合使用，突出了培养基抑制杂菌能力，接种和转种样品不需要微孔滤器，支原体生长迅速；液体培养基具有维持和延长支原体生长对数期、指示生长；固体培养基观察Uu和Mh菌落，与背景反差大容易鉴别，其特征是避免了其他生物利用液体培养基中营养的微生物而引起的假阳性或假阴性，显著提高了泌尿生殖道支原体检测的敏感性和特异性。
(1)泌尿生殖道支原体培养基及检测方法，其特征是培养基的要素和组合包括：
A：液体培养基每1000ml液体组成：

1.  胰酶大豆肉汤             5～10g

2.  NaCl                     3～7g

3.  磷酸二氢钾               0.02～0.5g

4.  酵母浸液                 5～20g

5.  尿素                     1～5g

6.  精氨酸                   0.1～1g

7.  L-半胱氨酸               20～50mg

8.  HEPES                    0.01～1g

9.  酚红                     5～30mg

10.  万古霉素                0.1～5mg

11.  两性霉素B               10～50μl

12.  甲氧苄氨嘧啶            0.1～5mg

13.  多粘菌素                0.3～6mg

14.  小牛血清                100ml

15.  蒸馏水                  至1000ml
B：固体培养基每1000ml体积组成：

1.  胰酶大豆肉汤             10～50g

2.  硫酸锰                   0.01～0.03g

3.  琼脂                     11g

4.  蒸馏水                   500ml

5.  小牛血清                 200ml

6.  酵母浸液                 1～3g

7.  尿素                     0.1～0.5g

8.  精氨酸                   0.1～0.5g

9.  L-半胱氨酸               20～30mg

10.  青霉素(钾盐)G 10万U/ml  0.01～0.02g

11.  两性霉素B               10～20μl

12.  蒸馏水                  至1000ml
(2)泌尿生殖道支原体培养基及检测方法，其检测方法的特征是液体培养基和固体培养基在培养、分离、鉴别泌尿生殖道支原体时组合使用。

2.  按照权利要求1所述的泌尿生殖道支原体培养基及检测方法，其特征是每1000ml液体和固体培养基中胰酶大豆肉汤干粉分别是5～10g和10～50g。

3.  按照权利要求1所述的泌尿生殖道支原体培养基及检测方法，其特征是每1000ml液体和固体培养基中L-半胱氨酸含量分别是20～50mg和20～30mg。

4.  按照权利要求1所述的泌尿生殖道支原体培养基及检测方法，其特征是每1000ml液体培养基中HEPES液5～30mg。

5.  按照权利要求1所述的泌尿生殖道支原体培养基及检测方法，其特征是每1000ml液体和固体培养基中两性霉素B含量分别是10～50μl和10～20μl。

6.  按照权利要求1所述的泌尿生殖道支原体培养基及检测方法，其特征是每1000ml液体培养基中万古霉素含量是0.1～5mg。

7.  按照权利要求1所述的泌尿生殖道支原体培养基及检测方法，其特征是每1000ml液体培养基中甲氧苄氨嘧啶含量分别是0.1～5mg。

8.  按照权利要求1所述的泌尿生殖道支原体培养基及检测方法，其特征是每1000ml液体培养基中多粘菌素是0.3～6mg。

9.  按照权利要求1所述的泌尿生殖道支原体培养基及检测方法，其特征是每1000ml固体培养基中硫酸锰0.01～0.03g。

10.  按照权利要求1所述的泌尿生殖道支原体培养基及检测方法，其特征是液体培养基用于接种临床样品、抑制杂菌、促进支原体生长、指示是否有支原体生长；固体培养基用于观察培养物是否支原体、鉴别解脲脲原体(Uu)和人型支原体(Mh)。

11.  按照权利要求1所述的泌尿生殖道支原体培养基及检测方法培养基及制备方法，其特征的主要步骤是：

11.  1液体培养基：

11.  1.1称取胰酶大豆肉汤干粉，加入600ml纯化水溶解，加入NaCl 3～7g和磷酸二氢钾0.02～0.5g；

11.  1.2用1NHCL调正pH至6.2±0.1；

11.  1.3置121℃，15分钟高压灭菌，冷却到56℃；

11.  1.4按照权利要求1所述分别称取酵母浸液、尿素、精氨酸、L-半胱氨酸、酚红，加入适量灭菌纯化水溶解，通过0.22μm过滤器后，加人到基础培养基中；

11.  1.5按照权利要求1所述分别称取万古霉素、两性霉素B、甲氧苄氨嘧啶和多粘菌素，在适量灭菌纯化水溶解，加入到上述培养基中；

11.  1.6加入小牛血清100ml；

11.  1.7补足1000ml体积培养基，用1NHCL调正pH至6.2±0.2后，分装至经过高压灭菌的螺口瓶中，置2～8℃保存备用。

11.  2固体培养基；

11.  2.1按照权利要求1所述分别称取胰酶大豆肉汤干粉、琼脂粉、硫酸锰，加入500ml纯化水溶解；

11.  2.2用1N HCL调正pH至6.2±0.1溶解后；

11.  2.3置121℃，15分钟高压灭菌，冷却到56℃备用；

11.  2.4按照权利要求1所述分别称取酵母浸液、尿素、精氨酸、L-半胱氨酸、酚红，加入适量灭菌纯化水溶解，通过0.22μm过滤器后，加入道基础培养基中；

11.  2.5分别称取两性霉素B和青霉素，在适量灭菌纯化水溶解，加入到上述培养基中；

11.  2.6加入小牛血清200ml；

11.  2.7用预温灭菌纯化水补足1000ml体积培养基。

11.  2.8用1N HCL调正pH至6.2±0.1后，倾注在70mm直径的无菌平皿，室温自然冷却后置置2～8℃保存备用。

12.  按照权利要求11所述的泌尿生殖道支原体培养基及检测方法，其特征是制备的培养基含有胰酶大豆肉汤、酵母浸液、尿素、精氨酸、L-半胱氨酸、酚红、HEPES液、小牛血清、硫酸锰、万古霉素、两性霉素B、甲氧苄氨嘧啶、多粘菌素、青霉素等的要素和组合。具有促进支原体的生长，延长Uu在液体培养基中生长对数期时间，降低因为pH升高导致Uu死亡转种到固体培养基的假阴性率，固体培养基中标本的背景杂质干扰物少。

13.  按照权利要求1所述的泌尿生殖道支原体培养基及检测方法，其特征是先将样品接种到液体培养基中，无论液体培养基是否改变颜色，然后转种到固体培养基。

14.  按照权利要求13所述的泌尿生殖道支原体培养基及检测方法，其特征是转种到固体培养时，不需要微孔过滤装置虑除细菌。

15.  按照权利要求14所述的泌尿生殖道支原体培养基及检测方法，其特征是固体培养中抑制杂菌的能力强，效果显著。

16.  按照权利要求13所述的泌尿生殖道支原体培养基及检测方法，其特征是固体培养中支原体生长迅速，Uu和Mh在24小时就可以出现典型菌落。

17.  按照权利要求16所述的泌尿生殖道支原体培养基及检测方法，其特征是固体培养基在显微镜下观察转种标本中支原体具有金属光泽，固体培养的Uu和Mh菌落形态典型，与背景反差大容易鉴别。

18.  按照权利要求13所述的泌尿生殖道支原体培养基及检测方法，其特征是Uu和Mh在液体和固体培养的阳性率比较吻合，临床样品的阳性检测率高。

泌尿生殖道支原体培养基及检测方法
技术领域
本发明涉及泌尿生殖道微生物培养及检测方法，具体涉及泌尿生殖道解脲脲原体(Uu)和人型支原体(Mh)的培养基和检测方法。
背景技术
支原体是目前所知能独立生长，自行繁殖的最小微生物。它无细胞壁，分布广泛，能在人工培养基上生长，但是营养条件要求高。它们与泌尿生殖道炎症密切相关，还能引起免疫性疾病[支原体学，2008年第2版，41-44]。发病率高和致病性强的是解脲脲原体(Uu)和人型支原体(Mh)。它们与女性生殖道感染，如宫颈炎、子宫内膜炎、盆腔炎以及一些并发症如自然流产、胎膜早破、早产等有关。Uu还可吸付精子上，阻碍其运动，干扰精子与卵子结合，引起不孕；还是引起新生儿呼吸系统和中枢神经系统感染的病原体之一。2000年后，中国在其他传染性疾病报告病例趋于稳定或下降背景下，NGU(非淋菌性尿道炎)报告病例依然呈快速上升趋势，2004年2005年全国由Uu和Mh等微生物感染所引起的NGU占到七种性病之首，构成分别达35.94％和36.78％。2005年上海地区NGU发病率达到56.87/10万[全国性病疫情分析报告，2006.20(2)：1-9]。发病形势严峻。
检测Uu和Mh的方法有免疫学检测、核酸测定、分离培养等。支原体属内不同种的支原体存在着交叉免疫反应，有些支原体还存在着异质性抗原，因此免疫性检测方法目前应用受到限制[中华检验医学杂志，2005，28(7)：677-678]。鉴于PCR检测中存在的严重假阳性问题，中国卫生部颁布了规范性文件[卫医发(2002)10]，对临床应用此项技术开展实验诊断的单位和部门，设定严格的准入条件。况且目前为止国内市场上还没有一个合法的临床诊断试剂盒供应，因此短期内普遍开展还有难度。分离培养一直是微生物检测的“金标准”，也是支原体检测最常用的方法。
纵览国内有关泌尿生殖道支原体培养的文献发现，支原体的鉴定主要依据液体培养，它依据Uu利用尿素和Mh以精氨酸为能源，分解产氨和二氧化碳，使pH值升高，含酚红指示剂的培养液由黄色变红色提示支原体生长。虽然液体培养基使用方便、快速、判断容易，事实上泌尿生殖道中某些微生物含有脲酶，能生物利用液体培养基中某些成份，使pH升高而改变颜色，出现严重的的假阳性[临床检验杂志2004，22(5)：321-322]。广谱抗生素的广泛使用，微生物的耐药性出现了很大的变迁，泌尿生殖道寄居的微生物呈现多样化[中国微生态学杂志2003，15(1)：43]。杂菌的存在，一定程度上竞争Uu生长所需的营养，呈优势生长而干扰支原体最终的结果判断。另外，产尿素酶杂菌的生长导致酸碱变化，也可造成Uu液体培养结果的错误判断[河北医学2004，10(7)：614-616]。
固体培养通过显微镜观察有无油煎蛋状菌落生长、形态特征等性状鉴别多种支原体，但是国产固体培养基在质量上与进口的A7固体培养基相比有较大差距。进口固体培养基价格昂贵，定购周期长，培养基变得干薄可能影响检测效果。另外，直接将样品接种到固体培养基中，其检测阳性率较低。临床实践发现，大量商品化独立使用的支原体液体、或者固体培养基产品，在敏感性和特异性方面存在较大差异，即使同一品牌的液体培养的阳性率显著高于固体培养，目前尚无优质的组合使用的支原体培养基及制备方法。
发明内容
本发明是提供检测泌尿生殖道Uu和Mh的培养基及检测方法，根据2种支原体生物学特性，优化了维持支原体生长的营养、抑制杂菌生长抗生素的组合。突出了液体培养基可以提高阳性率、固体培养基避免了其他微生物因为改变颜色造成的假阳性，并且显著提高了固体培养的阳性率。当组合使用，提高了泌尿生殖道Uu和Mh支原体检测的敏感性和特异性。
本发明提供的泌尿生殖道支原体培养基和检测方法，其特征是含有胰酶大豆肉汤、酵母浸液、尿素、精氨酸、L-半胱氨酸、酚红、HEPES液、小牛血清、硫酸锰、万古霉素、两性霉素B、甲氧苄氨嘧啶、多粘菌素、青霉素等要素的配方，并且液体培养基和固体培养基在培养、分离、鉴别泌尿道支原体时组合使用。液体培养基用于接种临床样品、抑制杂菌、具有同时促进Uu和Mh支原体生长、指示是否有支原体生长；固体培养基用于观察培养物是否支原体、鉴别解脲脲原体(Uu)和人型支原体(Mh)。
本发明提供的泌尿生殖道支原体培养基和检测方法，具有促进支原体的生长，延长Uu在液体中生长对数期时间，降低因为pH升高导致Uu转种到固体培养基的假阴性率，转种过程不需要微孔过滤装置虑除细菌，固体培养中抑制杂菌的效果显著，支原体生长迅速，Uu和Mh在24小时就可以出现菌落，背景干扰少，Uu和Mh菌落形态典型，容易鉴别，Uu和Mh在固体和液体培养的阳性率比较吻合，临床样品的检测阳性率高。
本发明提供的泌尿生殖道支原体培养基和检测方法包括：
一、液体培养基每1000ml液体组成：
1.胰酶大豆肉汤             5～10g
2.NaCl                      3～7g
3.磷酸二氢钾           0.02～0.5g
4.酵母浸液                 5～20g
5.尿素                      1～5g
6.精氨酸                  0.1～1g
7.L-半胱氨酸              20～50mg
8.HEPES                  0.01～1g
9.酚红                     5～30mg
10.万古霉素               0.1～5mg
11.两性霉素B              10～50μl
12.甲氧苄氨嘧啶           0.1～5mg
13.多粘菌素               0.3～6mg
14.小牛血清                  100ml
15.蒸馏水                 至1000ml
二、固体培养基每1000ml体积组成：
1.胰酶大豆肉汤                 10～50g
2.硫酸锰                   0.01～0.03g
3.琼脂                             11g
4.蒸馏水                          500ml
5.小牛血清                        200ml
6.酵母浸液                       1～3g
7.尿素                       0.1～0.5g
8.精氨酸                     0.1～0.5g
9.L-半胱氨酸                   20～30mg
10.青霉素(钾盐)G 10万U/ml  0.01～0.02g
11.两性霉素B                   10～20μl
12.蒸馏水                      至1000ml
三、其检测方法是液体培养基和固体培养基在培养、分离、鉴别泌尿生殖道支原体时组合使用。将样品拭子直接置液体培养基中搅拌十次、或者液状样品取100μl注入液体培养基中，培养4至24小时，无论液体培养基是否改变颜色，不需要微孔过滤器，直接取出10μl～50μl滴种或者划线转种到固体培养基上，培养24小时后，在10倍物镜下观察是否有支原体生长。固体培养基上的支原体具有金属光泽，Uu呈现棕黑色海胆状菌落，Mh呈现比Uu明显大的“煎蛋”形态典型菌落，与背景反差大容易鉴别。
泌尿生殖道支原体培养基的配置包括以下程序：
一、液体培养基的配置：
1.称取胰酶大豆肉汤干粉5～10g，在600ml纯化水中溶解；
2.加入NaCl 3～7g和磷酸二氢钾0.02～0.5g；
3.用1N的HCL调正pH至6.2±0.1，置121℃高压灭菌15分钟，冷却到56℃备用；
4.分别称取酵母浸液、尿素、精氨酸、L-半胱氨酸、酚红，加入适量灭菌纯化水溶解；
5.经过0.22μm过滤器后加人到冷却的培养基中；
6.按照配方分别称取万古霉素、两性霉素B、甲氧苄氨嘧啶和多粘菌素，在适量灭菌纯化水溶解，加入到上述培养基中；
7.加入小牛血清100ml；
8.补足1000ml体积培养基；
9.用1N的HCL调正pH至6.2±0.2后，分装至经过高压灭菌的螺口瓶中，置2～8℃保存备用。
二、固体培养基的配置：
1.分别称取胰酶大豆肉汤干粉、琼脂粉、硫酸锰，加入500ml纯化水溶解；
2.用1N的HCL调正pH至6.2±0.1溶解后；
3.置121℃高压灭菌15分钟，冷却到56℃备用；
4.称取酵母浸液、尿素、精氨酸、L-半胱氨酸、酚红，加入适量灭菌纯化水溶解；
5.经过0.22μm过滤器后，加入到保温的培养基中；
6.分别称取两性霉素B和青霉素，在适量灭菌纯化水溶解，加入到上述培养基中；
7.加入小牛血清200ml；
8.用预温灭菌纯化水补足1000ml体积培养基；
9.用1N HCL调正pH至6.2±0.1后；
10.倾注在50mm~100mm直径的无菌平皿，室温自然冷却后置2～8℃保存备用。
附图说明：
图1是固体培养基显微镜下观察支原体菌落图(400倍)：
固体培养在显微镜下看到：低倍下Uu菌落具有金属光泽，呈现棕黑色海胆状菌落；大小直径约50μm～300μm圆形多见，菌落边缘较中央透明，“油煎蛋”状菌落的外边比较窄，如果Uu和Mh混合感染，Uu菌落数量明显比Mh多。Mh菌落比Uu明显大，大小直径约300μm～800μm圆形多见，菌落边缘较中央透明，“油煎蛋”状菌落的外边比较宽。固体培养基中杂质少，没有污染菌生长。支原体菌落生长良好，并且可见分裂相菌落，支原体菌落与背景反差大容易鉴别。
图2是固体培养基显微镜下观察支原体Dienes染色菌落图(400倍)：
固体培养的Dienes染色在显微镜下看到：菌落不出现褪色，Mh菌落比Uu明显大，“油煎蛋”状菌落边缘较Uu宽。固体培养基中杂质少，没有污染菌生长。支原体菌落生长良好，兰色的支原体菌落与背景反差大，肉眼即可容易鉴别。
具体实施方式：
实施例1
培养基的配置：取1只2000ml的洁净小口径、耐高压的带盖(可塞)玻璃容器，称取胰酶大豆肉汤干粉5g～10g溶解到600ml纯化水中，一并加入NaCl和磷酸二氢钾，用1N的HCL调正至pH6.1～6.3，贴上消毒灭菌指示纸条，置高压容器内，排除冷空气后121℃灭菌15分钟，待压力归零后排除余汽开盖自然冷却备用。
取1个洁净容器加入适量灭菌纯化水，按照配方分别称取酵母浸液、尿素、精氨酸、L-半胱氨酸、酚红逐一溶解到容器中，加压经过0.22μm过滤器后，将溶液加人到冷却的上述培养基中，取无菌容器注入适量灭菌水，按照配方分别称取万古霉素、两性霉素B、甲氧苄氨嘧啶和多粘菌素逐一溶解，并且加入到上述培养基中，再加入小牛血清100ml，并且用灭菌纯化水补足1000ml总体积，用1N的HCL调正pH6.1～6.3后，分装至经过高压灭菌的螺口瓶中，旋紧盖，贴上标签置2～8℃保存备用。
取分装后的液体培养基，无菌条件下划种营养和血琼脂，连同支原体液体培养基置37℃培养24小时，进行培养基的无菌实验。
实施例2
固体培养基的配置：取1只2000ml的洁净小口径、耐高压的带盖(可塞)厚壁玻璃容器，加入约500ml纯化水，按照配方分别称取胰酶大豆肉汤干粉、琼脂粉、硫酸锰，逐一溶解到容器内，用1N的HCL调正至pH 6.1～6.3，贴上消毒灭菌指示纸条，置高压容器内，排除冷空气后121℃灭菌15分钟，待压力归零后排除余汽开盖自然冷却到56℃，保温状态下备用。
取1个洁净容器加入适量灭菌纯化水，称取酵母浸液、尿素、精氨酸、L-半胱氨酸、酚红逐一加入容器拿溶解，通过0.22μm的过滤器后注入保温的培养基中，取无菌容器注入适量灭菌水，先后溶解两性霉素B和青霉素，然后加入到上述培养基中，再加入小牛血清200ml，保温状态下混匀并且用预温灭菌纯化水补足1000ml体积，最后用1N HCL调正pH至pH6.1～6.3后，倾注在50mm～100mm直径的无菌平皿，室温自然冷却后置2～8℃保存备用。
取分装后的固体平皿培养基，置37℃培养24小时，进行培养基的无菌实验。
实施例3
不同培养基对临床样品检测能力的比对：取临床样品的拭子，放入含有50μl～200μl生理盐水的无菌小试管中，充分搅拌后弃拭子，将液体样品均等地分别加入本发明、进口A和国产B的液体培养基中，在37℃、5％CO₂条件下培养24小时，各自转种到本发明和进口A的固体培养基中，由于国产B商品没有相应的固体培养基，只比较液体培养基的性能。含有待检测样品的液体和固体培养基，继续在37℃、5％CO₂条件下培养，至72小时。每12小时观察培养基如下指标：液体培养基是否改变颜色和时间、浑浊度，固体培养菌落生长率，以了解培养的阳性率、pH缓冲能力，记录3种培养基相关指标的改变现象，统计结果见下表：
3种培养基Uu样品检测能力比对结果