一种从培育长春花中提取高纯度长春新碱的方法技术领域
本发明涉及一种从培育长春花中提取高纯度长春新碱的方法，属于一种生物技术领域。
背景技术
长春碱，别名长春花碱，其硫酸盐硫酸长春碱，为国家基本药物，主要用于治疗霍其金病及绒毛膜上皮癌。目前，长春碱花类生物碱一般从夹竹桃科植物长春花中提取得到。长春花中含有近百种生物碱，其中大多数生物碱都具有活性，其中硫酸长春碱但由于长春花中长春碱的含量极低，化学合成方法很难实现工业化生产，因此，找到高含量的长春花生物碱的生产原料至关要。
迄今为止，我国只有报道长春碱提取的专利，而对于长春碱分离精制的专利未见专门报道。目前我国只有少数长春花提取物生产厂家生产的长春碱的纯度能够达到国际标准，但其生产成本相当高昂，耗费大量的原料，降低了企业的利润；而多数厂家则生产纯度要求不高的长春碱原料药或长春碱粗品，产品纯度不足95％，不能满足国际市场对高纯度长春碱(≥98％)的需求，长春碱得率也低于30％，降低了其工业化生产的价值，造成了很大的浪费，在客观上加大了生产成本，同时也降低了产品的国际竞争力。
双吲哚生物碱长春碱在长春花中的含量大约为十万分之一，长春新碱大约为百万分之一，而植物体内合成长春碱、长春新碱的前体单吲哚生物碱文朵灵和长春质碱的含量是它们的数倍之多，大约在万分之一。双吲哚生物碱长春碱、长春新碱、脱水长春碱、长春瑞滨可由单吲哚生物碱文朵灵和长春质碱通过偶合制备，但国内临床使用的长春新碱、长春瑞滨主要是从长春碱半合成过来。国内的长春花总碱生产从长春花植物中仅提取含量较低的长春碱，而把大量的单吲哚生物碱文朵灵和长春质碱作为废料遗弃，造成资源没有得到很好的综合利用。
发明内容
本发明主要解决的技术问题：针对目前我国长春花中长春花碱含量低，提取纯度一般未达到98％，提取率低于30％，降低了其工业化生产的价值，造成了很大的浪费，本发明提供了一种通过活性污泥、玉米秸秆、磷酸稀醇式丙酮酸等混合作为培养基质，对长春花进行培养，再喷洒混合液等方式，提高长春花中长春花碱含量，再将其处理后，盐水浸泡，发酵，再经浓缩，提纯得长春花碱的方法。
为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案：
（1）按质量百份比计，取50～55份活性污泥，20～25份40～60目玉米秸秆粉末，8～10份葡萄糖，4～5份磷酸稀醇式丙酮酸，8～10份浓度为80～100mg/L色氨酸以及1～2份茉莉酸甲酯放入容器中，搅拌均匀；
（2）将上述所得的混合物放入发酵池中，温度设定为30～35℃，密封搅拌发酵5～7h去除发酵液，将发酵物作为培养基质，均匀铺在培养池中厚度为8～10cm，按每立方米种植2～4对真叶的长春花，移入培养池进行培养，保持温度为20～33℃，培养基质的含水量为20～35％，每隔1～2天喷洒混合液，其喷洒量为每棵长春花喷洒4～5mL混合液，所述混合液为按照每升质量分数为8％的盐酸溶液加入84g6-糠氨基嘌呤均匀混合而成，待长春花结出花蕾时，拔出长春花，取其根部；
（3）将上述去根后的长春花放入容器中，向其中加入质量分数为70～80％的氯化钠溶液浸没长春花，待长春花含水量为5～10％后将其取出，并用去离子水冲洗1～2次，然后放入风干机中进行风干，放入粉碎机中粉碎成40～50目颗粒；
（4）把上述所得的粉末放入容器中，向其中加入质量分数为35～50％的硫酸溶液浸泡30～40min，然后再向其中加入硫酸溶液体积30～40％的碳酸二甲酯，以及粉末质量的10～15％的纤维素酶，搅拌1～2h，温度设定为50～55℃；
（5）使用质量分数为30％的氨水调节上述溶液pH为6.5～7，降温至20～25℃，搅拌均匀过滤，向滤液中加入氨水体积0.3～0.5倍的二丙二醇二甲醚，以转速500～600r/min搅拌30～40min后，静置10～20min分层，取下层液，然后再向上层液加入氨水体积0.1～0.2倍的二丙二醇二甲醚，重复操作取下层液；
（6）合并两次上述所取得的下层液，在温度为90～100℃，压力为100～200Pa
下，旋转蒸发浓缩30～40min，回收二丙二醇二甲醚与氨水，然后将所得的浓缩液放入容器中，向其中加入浓缩液体积2～3倍的无水乙醇，温度降至4～6℃，搅拌直至无沉淀产生，过滤收集过滤物，并用乙醇冲洗1～3次，干燥即可得到长春新碱。
所述的步骤（2）中混合液为按照每升质量分数为8％的盐酸溶液加入84g6-糠氨基嘌呤均匀混合而成。
本发明的有益效果是：
（1）通过培养长春花，将长春花中长春花碱的含量提高了20～30％；
（2）本发明所提取得到的长春花碱的纯度达到98％以上，提取率达到55～60％。
具体实施方式
按质量百份比计，取50～55份活性污泥，20～25份40～60目玉米秸秆粉末，8～10份葡萄糖，4～5份磷酸稀醇式丙酮酸，8～10份浓度为80～100mg/L色氨酸以及1～2份茉莉酸甲酯放入容器中，搅拌均匀；将上述所得的混合物放入发酵池中，温度设定为30～35℃，密封搅拌发酵5～7h去除发酵液，将发酵物作为培养基质，均匀铺在培养池中厚度为8～10cm，按每立方米种植2～4对真叶的长春花，移入培养池进行培养，保持温度为20～33℃，培养基质的含水量为20～35％，每隔1～2天喷洒混合液，所述混合液为按照每升质量分数为8％的盐酸溶液加入84g6-糠氨基嘌呤均匀混合而成，其喷洒量为每棵长春花喷洒4～5mL混合液，待长春花结出花蕾时，拔出长春花，取其根部；将上述去根后的长春花放入容器中，向其中加入质量分数为70～80％的氯化钠溶液浸没长春花，待长春花含水量为5～10％后将其取出，并用去离子水冲洗1～2次，然后放入风干机中进行风干，放入粉碎机中粉碎成40～50目颗粒；把上述所得的粉末放入容器中，向其中加入质量分数为35～50％的硫酸溶液浸泡30～40min，然后再向其中加入硫酸溶液体积30～40％的碳酸二甲酯，以及粉末质量的10～15％的纤维素酶，搅拌1～2h，温度设定为50～55℃；使用质量分数为30％的氨水调节上述溶液pH为6.5～7，降温至20～25℃，搅拌均匀过滤，向滤液中加入氨水体积0.3～0.5倍的二丙二醇二甲醚，以转速500～600r/min搅拌30～40min后，静置10～20min分层，取下层液，然后再向上层液加入氨水体积0.1～0.2倍的二丙二醇二甲醚，重复操作取下层液；合并两次上述所取得的下层液，在温度为90～100℃，压力为100～200Pa下，旋转蒸发浓缩30～40min，回收二丙二醇二甲醚与氨水，然后将所得的浓缩液放入容器中，向其中加入浓缩液体积2～3倍的无水乙醇，温度降至4～6℃，搅拌直至无沉淀产生，过滤收集过滤物，并用乙醇冲洗1～3次，干燥即可得到长春新碱。
实例1
取5kg活性污泥，2.3kg40目玉米秸秆粉末，1kg葡萄糖，0.5kg磷酸稀醇式丙酮酸，1kg浓度为80mg/L色氨酸以及0.2kg茉莉酸甲酯放入容器中，搅拌均匀；将上述所得的混合物放入发酵池中，温度设定为30℃，密封搅拌发酵5h去除发酵液，将发酵物作为培养基质，均匀铺在培养池中厚度为8cm，按每立方米种植2对真叶的长春花，移入培养池进行培养，保持温度为20℃，培养基质的含水量为20％，每隔1天喷洒混合液，所述的混合液为按照每升质量分数为8％的盐酸溶液加入84g6-糠氨基嘌呤均匀混合而成，其喷洒量为每棵长春花喷洒4mL混合液，待长春花结出花蕾时，拔出长春花，取其根部；将上述去根后的长春花放入容器中，向其中加入质量分数为70％的氯化钠溶液浸没长春花，待其长春花含水量为5％后将其取出，并用去离子水冲洗1次，然后放入风干机中进行风干，放入粉碎机中粉碎成40目颗粒；把上述所得的粉末放入容器中，向其中加入质量分数为35％的硫酸溶液浸泡30min，然后再向其中加入硫酸溶液体积30％的碳酸二甲酯，以及粉末质量的10％的纤维素酶，搅拌1h，温度设定为50℃；使用质量分数为30％的氨水调节上述溶液pH为6.5，降温至20℃，搅拌均匀过滤，向滤液中加入氨水体积0.3倍的二丙二醇二甲醚，以转速500r/min搅拌30min后，静置10min分层，取下层液，然后再向上层液加入氨水体积0.1倍的二丙二醇二甲醚，重复操作取下层液；合并两次上述所取得的下层液，在温度为90℃，压力为100Pa下，旋转蒸发浓缩30min，回收二丙二醇二甲醚与氨水，然后将所得的浓缩液放入容器中，向其中加入浓缩液体积2倍的无水乙醇，温度降至4℃，搅拌直至无沉淀产生，过滤收集过滤物，并用乙醇冲洗1次，干燥即可得到长春新碱。
本发明方法独特，通过检测得到通过培养长春花中长春花碱的含量提高了20％，提取得到的长春花碱的纯度达到98％，提取率达到55％。
实例2
取5.5kg份活性污泥，2.3kg60目玉米秸秆粉末，0.8kg葡萄糖，0.5kg磷酸稀醇式丙酮酸，0.8kg浓度为100mg/L色氨酸以及0.1kg茉莉酸甲酯放入容器中，搅拌均匀；将上述所得的混合物放入发酵池中，温度设定为35℃，密封搅拌发酵7h去除发酵液，将发酵物作为培养基质，均匀铺在培养池中厚度为10cm，按每立方米种植4对真叶的长春花，移入培养池进行培养，保持温度为33℃，培养基质的含水量为35％，每隔2天喷洒混合液，所述的混合液为按照每升质量分数为8％的盐酸溶液加入84g6-糠氨基嘌呤均匀混合而成，其喷洒量为每棵长春花喷洒5mL混合液，待长春花结出花蕾时，拔出长春花，取其根部；将上述去根后的长春花放入容器中，向其中加入质量分数为80％的氯化钠溶液浸没长春花，待其长春花含水量为10％后将其取出，并用去离子水冲洗2次，然后放入风干机中进行风干，放入粉碎机中粉碎成50目颗粒；把上述所得的粉末放入容器中，向其中加入质量分数为50％的硫酸溶液浸泡40min，然后再向其中加入硫酸溶液体积40％的碳酸二甲酯，以及粉末质量的15％的纤维素酶，搅拌2h，温度设定为55℃；使用质量分数为30％的氨水调节上述溶液pH为7，降温至25℃，搅拌均匀过滤，向滤液中加入氨水体积0.5倍的二丙二醇二甲醚，以转速600r/min搅拌40min后，静置20min分层，取下层液，然后再向上层液加入氨水体积0.2倍的二丙二醇二甲醚，重复操作取下层液；合并两次上述所取得的下层液，在温度为100℃，压力为200Pa下，旋转蒸发浓缩40min，回收二丙二醇二甲醚与氨水，然后将所得的浓缩液放入容器中，向其中加入浓缩液体积3倍的无水乙醇，温度降至6℃，搅拌直至无沉淀产生，过滤收集过滤物，并用乙醇冲洗3次，干燥即可得到长春新碱。
本发明方法独特，通过检测得到通过培养长春花中长春花碱的含量提高了30％，提取得到的长春花碱的纯度达到99.5，提取率达到60％。
实例3
取5.2kg份活性污泥，2.3kg40～60目玉米秸秆粉末，0.9kg葡萄糖，0.5kg磷酸稀醇式丙酮酸，0.9kg浓度为90mg/L色氨酸以及0.2kg茉莉酸甲酯放入容器中，搅拌均匀；将上述所得的混合物放入发酵池中，温度设定为32℃，密封搅拌发酵6h去除发酵液，将发酵物作为培养基质，均匀铺在培养池中厚度为9cm，按每立方米种植3对真叶的长春花，移入培养池进行培养，保持温度为25℃，培养基质的含水量为25％，每隔1天喷洒混合液，所述的混合液为按照每升质量分数为8％的盐酸溶液加入84g6-糠氨基嘌呤均匀混合而成，其喷洒量为每棵长春花喷洒5mL混合液，待长春花结出花蕾时，拔出长春花，取其根部；将上述去根后的长春花放入容器中，向其中加入质量分数为75％的氯化钠溶液浸没长春花，待其长春花含水量为7％后将其取出，并用去离子水冲洗2次，然后放入风干机中进行风干，放入粉碎机中粉碎成45目颗粒；把上述所得的粉末放入容器中，向其中加入质量分数为40％的硫酸溶液浸泡35min，然后再向其中加入硫酸溶液体积35％的碳酸二甲酯，以及粉末质量的12％的纤维素酶，搅拌1h，温度设定为52℃；使用质量分数为30％的氨水调节上述溶液pH为6.8，降温至22℃，搅拌均匀过滤，向滤液中加入氨水体积0.4倍的二丙二醇二甲醚，以转速550r/min搅拌35min后，静置15min分层，取下层液，然后再向上层液加入氨水体积0.1倍的二丙二醇二甲醚，重复操作取下层液；合并两次上述所取得的下层液，在温度为95℃，压力为150Pa下，旋转蒸发浓缩35min，回收二丙二醇二甲醚与氨水，然后将所得的浓缩液放入容器中，向其中加入浓缩液体积3倍的无水乙醇，温度降至5℃，搅拌直至无沉淀产生，过滤收集过滤物，并用乙醇冲洗2次，干燥即可得到长春新碱。
本发明方法独特，通过检测得到通过培养长春花中长春花碱的含量提高了25％，提取得到的长春花碱的纯度达到99％以上，提取率达到57％。