技术领域
本发明涉及水产品精深加工领域，具体涉及一种混合酶酶解制备鱿鱼肝脏蛋白 ACE抑制肽的方法。
背景技术
鱿鱼是重要的海洋头足类水产物，广泛分布于大西洋、印度洋和太平洋各海区。 近年来，我国鱿鱼捕获量连年增加，鱿鱼加工已成为国内水产品加工的主要组成部分 之一。一般来说，鱿鱼经解冻加工后有30％左右的头、足、内脏及表皮等废弃物产生。 从世界范围来看，每年100多万吨鱿鱼捕获量将会产生25～30万吨的鱿鱼废弃物。对 这些废弃物，一般处理方法是就地掩埋或者加工成鱼粉，这不但对渔业资源造成浪费， 而且还存在环境污染。
随着现代海洋加工业和养殖业的发展，鱼油废弃物的综合利用越来越受到重视。 国外有研究发现，占鱿鱼废弃物总量8～13％的鱿鱼皮中含有丰富的蛋白质资源，蛋白 质含量约占鱿鱼皮干重的88％左右。其中以胶原蛋白为主，含有丰富的甘氨酸、脯氨 酸及羟脯氨酸，其水解产物中还有生物活性肽。对于鱿鱼肝脏的利用，在国外，如西 班牙、日本采用自身酶解发酵法生产鱿溶浆、鱿鱼粉等作为鱼类饲料。鱿鱼肝脏在我 国生物废弃物中占有很大的比例，解决鱿鱼肝脏的处理问题，最佳方式是再加工利用。 目前，国内仅有鱿鱼肝脏干粉的加工，并且是用作饲料，技术水平不高，对于鱿鱼肝 脏的利用研究还有比较大的发展空间。
中国专利公告号CN102250994A，公告日2011年11月23日，公布了一种利用鱿 鱼肝脏蛋白制备血管紧张素转换酶抑制肽的方法，包括将提取鱼油后的鱿鱼肝脏蛋白 用丙酮处理除脂，选用胃蛋白酶在水解温度35～38℃，pH为1.5～2.5，酶与底物的比为 2～3％，底物浓度为1～3％条件下水解鱿鱼肝脏蛋白18～25h；将酶解液进行超滤处理后， 跟踪其ACE抑制活性，应用凝胶过滤层析、DEAE阴离子交换柱、RP-HPLC等方法分 离纯化ACE抑制肽，制得的ACE抑制肽在温度2～100℃、pH在1～12之间对ACE的 抑制活性基本没有变化，比较稳定，而且模拟胃肠消化实验对组分的ACE抑制活性的 影响不大，经过胃肠消化后仍具有较高的ACE抑制活性。该发明采用生物酶法利用鱿 鱼肝脏制备ACE抑制肽，具有安全性高、反应条件温和以及环保等优点。但是该发明 只采用了单酶酶解鱿鱼肝脏，目前对于采用混合蛋白酶制备鱿鱼肝脏蛋白ACE抑制肽 的研究尚未见报道。
发明内容
本发明提供了一种混合酶酶解制备鱿鱼肝脏蛋白ACE抑制肽的方法，为制备鱿鱼 肝脏蛋白ACE抑制肽提供更多的选择途径，以解决目前鱿鱼肝脏加工利用率低造成鱿 鱼资源浪费的问题。
本发明的具体技术方案为：一种混合酶酶解制备鱿鱼肝脏蛋白ACE抑制肽的方法， 包括如下步骤：
(1)鱿鱼肝脏预处理：将鱿鱼肝脏绞碎与水按质量比1:1～1:1.5混合，在35～50℃ 下加入6mol/L的氢氧化钠溶液调节pH至7～9，保温20～30min，然后升温至70～90℃， 反应1～1.5h，加入占肝脏重量2～4％的氯化钠，盐析5～15min，以4000～10000r/min离 心15～30min，去掉上层鱼油，得到粗制的鱿鱼肝脏蛋白；
(2)鱿鱼肝脏蛋白脱脂：将粗制的鱿鱼肝脏蛋白脱水后，按料液比1g:3mL加入正 己烷和异丙醇的混合液洗涤2～3次，真空干燥得到脱脂鱿鱼肝脏蛋白；
(3)混合酶酶解：将脱脂鱿鱼肝脏蛋白配成质量分数为3～5％的水溶液，调节 pH6.5～7.5，加入占脱脂鱿鱼肝脏蛋白质量1～6％的混合蛋白酶，在40～65℃的水浴锅中 水解10～18h，所述的混合蛋白酶由复合蛋白酶、中性蛋白酶和木瓜蛋白酶组成；
(4)酶灭活：酶解结束后，以100℃水浴加热10～20min，使酶失活；
(5)离心：失活的酶解液在4000～10000r/min条件下离心20～40min，取上清液， 冷冻干燥，冻干的粉末即为鱿鱼肝脏蛋白ACE抑制肽。
不同的蛋白酶对蛋白质的作用位点不同，单种酶水解作用位点较单一，导致蛋白 质水解度低，本发明采用复合蛋白酶、中性蛋白酶以及木瓜蛋白酶混合作用于鱿鱼肝 脏蛋白，可以提高鱿鱼肝脏蛋白的水解度，获得分子量更低的活性肽。同时由于复合 蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶的最适温度和最适pH比较接近，协同效果会更好。
作为优选，所述步骤(2)中正己烷和异丙醇的体积比为4:3。正己烷和异丙醇的 混合液可以有效脱去粗制的鱿鱼肝脏蛋白中的脂类，获得纯度更高的鱿鱼肝脏蛋白。
作为优选，所述步骤(3)中，复合蛋白酶、中性蛋白酶和木瓜蛋白酶的质量分数 分别为35～40％、35～40％、20～30％。
作为优选，在所述步骤(5)失活的酶解液离心之前，采用保加利亚乳杆菌和瑞士 乳杆菌混合菌对酶解液进行脱腥处理，处理条件为：接种量占酶解液质量3～8％，发酵 温度为35～45℃，发酵时间为3～6h。鱿鱼内脏本身具有很浓的腥味，采用酶解法获得 的酶解液不可避免的带有腥味，为了提高鱿鱼肝脏蛋白活性肽的应用价值，有必要对 酶解液进行脱腥处理。本发明采用保加利亚乳杆菌和瑞士乳杆菌协同作用于酶解液， 能较好的脱除酶解液的腥味。
作为优选，所述保加利亚乳杆菌和瑞士乳杆菌的菌种质量比为1:0.5～1:1.5。
本发明的有益效果是：本发明采用混合酶酶解鱿鱼肝脏蛋白，由于不同的酶底物 特异性不同，相对于一种酶，鱿鱼肝脏蛋白在混合酶的作用下能够水解的更充分，因 而最终获得的活性肽分子量更低，更易于人体吸收；本发明采用混合菌种对酶解液进 行脱腥处理，有效改善了鱿鱼肝脏蛋白活性肽的腥味，提高了其感官价值；同时本发 明将鱿鱼肝脏废弃物进行深加工，不仅改变了当前鱿鱼肝脏加工利用率低造成鱿鱼资 源浪费的现状，而且减少了废物排放，减轻了环境治理的负担。
具体实施方式
下面通过具体实施例，对本发明的技术方案做进一步说明。
本发明使用的复合蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶均购于诺维信(中国)生物 技术有限公司；保加利亚乳杆菌和瑞士乳杆菌购于广东省微生物研究所菌种保藏中心。
实施例1
一种混合酶酶解制备鱿鱼肝脏蛋白ACE抑制肽的方法，具体包括以下步骤：
(1)鱿鱼肝脏预处理：将鱿鱼肝脏绞碎与水按质量比1:1混合，在35℃下加入 6mol/L的氢氧化钠溶液调节pH至7，保温20min，然后升温至70℃，反应1h，加入占 肝脏重量2％的氯化钠，盐析5min，以4000r/min离心15min，去掉上层鱼油，得到粗 制的鱿鱼肝脏蛋白；
(2)鱿鱼肝脏蛋白脱脂：将粗制的鱿鱼肝脏蛋白脱水后，按料液比1g:3mL加入 正己烷和异丙醇的混合液(其中正己烷和异丙醇的体积比为4:3)，洗涤2次，真空干 燥得到脱脂鱿鱼肝脏蛋白；
(3)混合酶酶解：将脱脂鱿鱼肝脏蛋白配成质量分数为3％的水溶液，调节pH至 6.5，加入占脱脂鱿鱼肝脏蛋白质量1％的混合蛋白酶，在40℃的水浴锅中水解10h，混 合蛋白酶由复合蛋白酶、中性蛋白酶和木瓜蛋白酶组成，其质量分数分别为35％、35％、 30％；
(4)酶灭活：酶解结束后，以100℃水浴加热10min，使酶失活；
(5)离心：失活的酶解液在4000r/min条件下离心20min，取上清液，冷冻干燥， 冻干的粉末即为鱿鱼肝脏蛋白ACE抑制肽。
将得到的鱿鱼肝脏蛋白ACE抑制肽经ACE抑制活性的测定，其对ACE活性的抑 制率为82％，感官评分为1。
实施例2
一种混合酶酶解制备鱿鱼肝脏蛋白ACE抑制肽的方法，具体包括以下步骤：
(1)鱿鱼肝脏预处理：将鱿鱼肝脏绞碎与水按质量比1:1混合，在40℃下加入 6mol/L的氢氧化钠溶液调节pH至9，保温30min，然后升温至90℃，反应1h，加入占 肝脏重量3％的氯化钠，盐析10min，以8000r/min离心20min，去掉上层鱼油，得到粗 制的鱿鱼肝脏蛋白；
(2)鱿鱼肝脏蛋白脱脂：将粗制的鱿鱼肝脏蛋白脱水后，按料液比1g:3mL加入 正己烷和异丙醇的混合液(其中正己烷和异丙醇的体积比为4:3)，洗涤3次，真空干 燥得到脱脂鱿鱼肝脏蛋白；
(3)混合酶酶解：将脱脂鱿鱼肝脏蛋白配成质量分数为5％的水溶液，调节pH至 7.5，加入占脱脂鱿鱼肝脏蛋白质量6％的混合蛋白酶，在65℃的水浴锅中水解15h，混 合蛋白酶由复合蛋白酶、中性蛋白酶和木瓜蛋白酶组成，其质量分数分别为35％、40％、 25％；
(4)酶灭活：酶解结束后，以100℃水浴加热20min，使酶失活；
(5)脱腥：酶失活后，采用保加利亚乳杆菌和瑞士乳杆菌对酶解液进行脱腥处理， 处理条件为：接种量占酶解液质量3％，发酵温度为35℃，发酵时间为3h，保加利亚 乳杆菌和瑞士乳杆菌的菌种质量比为1:0.5；
(6)离心：脱腥后的酶解液在10000r/min条件下离心40min，取上清液，冷冻干 燥，冻干的粉末即为鱿鱼肝脏蛋白ACE抑制肽。
将得到的鱿鱼肝脏蛋白ACE抑制肽经ACE抑制活性的测定，其对ACE活性的抑 制率为80％，感官评分为3。
实施例3
一种混合酶酶解制备鱿鱼肝脏蛋白ACE抑制肽的方法，具体包括以下步骤：
(1)鱿鱼肝脏预处理：将鱿鱼肝脏绞碎与水按质量比1:1.5混合，在50℃下加入 6mol/L的氢氧化钠溶液调节pH至8，保温25min，然后升温至80℃，反应1.5h，加入 占肝脏重量4％的氯化钠，盐析15min，以10000r/min离心30min，去掉上层鱼油，得 到粗制的鱿鱼肝脏蛋白；
(2)鱿鱼肝脏蛋白脱脂：将粗制的鱿鱼肝脏蛋白脱水后，按料液比1g:3mL加入 正己烷和异丙醇的混合液(其中正己烷和异丙醇的体积比为4:3)，洗涤3次，真空干 燥得到脱脂鱿鱼肝脏蛋白；
(3)混合酶酶解：将脱脂鱿鱼肝脏蛋白配成质量分数为4％的水溶液，调节pH至 7，加入占脱脂鱿鱼肝脏蛋白4％的混合蛋白酶，在50℃的水浴锅中水解18h，混合蛋 白酶由复合蛋白酶、中性蛋白酶和木瓜蛋白酶组成，其质量分数分别为40％、40％、20％；
(6)酶灭活：酶解结束后，以100℃水浴加热20min，使酶失活；
(7)脱腥：酶失活后，采用保加利亚乳杆菌和瑞士乳杆菌对酶解液进行脱腥处理， 处理条件为：接种量占酶解液质量8％，发酵温度为45℃，发酵时间为6h，保加利亚 乳杆菌和瑞士乳杆菌的菌种质量比为1:1；
(6)离心：脱腥后的酶解液在8000r/min条件下离心40min，取上清液，冷冻干燥， 冻干的粉末即为鱿鱼肝脏蛋白ACE抑制肽。
将得到的鱿鱼肝脏蛋白ACE抑制肽经ACE抑制活性的测定，其对ACE活性的抑 制率为85％，感官评分为4。
本发明所采用的ACE抑制活性的测定方法，具体步骤为：
取30μL马尿酰-组氨酰-亮氨酸底物液，加入10μL抑制剂混合均匀，在37℃±0.5℃ 恒温水浴中预热3～5min，然后加入20μL血管紧张素转化酶(ACE)液充分混合，37℃ 保温30min后，再加入60μL的1mol/LHCl终止反应，得到反应液。同时用10μLpH 为8.3的硼酸缓冲液替代抑制剂溶液作为空白对照图。该反应液用0.45μm滤膜过滤后 直接用HPLC系统进行分析。色谱条件：柱温25℃，流速0.5mL/min，流动相乙腈/水 (0.05％TFA)比例为25/75等度洗脱，检测波长228nm。
ACE抑制活性计算公式如下：
ACE抑制活性(％)＝100(M-N)/M
式中：M为空白对照样组中马尿酸的峰面积；
N为添加抑制剂组中马尿酸的峰面积。
本发明采用的感官评定方法为：由十名经过训练的感官评定小组成员按照表1所 示的评分标准，对酶解液进行感官评分。
表1感官评定评分标准