技术领域
本发明涉及医学生物工程领域，具体地指一种基于BODIPY的荧光氨基酸及其合成方法与应用。
背景技术
蛋白质作为构成生命体系的三大物质基础之一，几乎参与着生命活动的每一个环节，在生命的诞生、成长和繁衍过程中起着决定性的作用。许多疾病的发生也与多肽、蛋白质在体内发生变异有着密切的关系。因此选择与重大疾病密切相关的蛋白质、多肽以及氨基酸残基作为靶标，发展具有高选择性，高灵敏度的检测方法，对生命奥秘的揭示，疾病的早期诊断与药物的筛选有着重大的意义。
目前诊断多肽及蛋白质的检测方法主要有免疫标记法，同位素标记法和荧光检测法等。免疫标记法很难实现对活体的检测，同位素标记法具有放射性危害，需要专门的人员操作。相对而言，荧光检测法因其具有灵敏度高、选择性好，动态响应范围宽，能在活体内检测等优点在蛋白质检测中得以广泛应用。荧光检测法根据靶向蛋白的结构和性质设计多肽荧光探针，根据荧光光谱的变化来检测目标对象，它是痕量蛋白检测的重要方法。
构建多肽荧光探针需要考虑两个方面问题：一，多肽的氨基酸系列和结构；二，用于标记的荧光基团。已知的多肽及蛋白质的二级结构主要有β-turn，β-sheet和α-helix。通过合成β-turn模拟物并将其引入到一个多肽序列中，从而诱导β-sheet结构的形成，这类工作已多有报道[(a)Robinson,J.A.；The design,synthesis and conformation of some new β-hairpin mimetics:novel reagents for drug and vaccine discovery.Synlett,1999,4,429-441.(b)Souers,A.J.；Ellman,J.A.β-turn mimetic library synthesis:scaffolds and applications.Tetrahedron,2001,57,7431-7448.]。
目前，用荧光基团进行标记主要采用两种方法：一，首先合成多肽，然后在此多肽上通过化学方法引入荧光标记基团。此方法比较繁琐，需要考虑到荧光基团标记的位点和可行性。二，首先合成荧光氨基酸(通过在侧链上导入荧光基团)，然后将其作为一个结构单元直接用于多肽合成。两种方法各有优缺点，前者是在多肽合成后才考虑导入荧光基团，它可以直接连到某个氨基酸的残基上，也可以通过搭桥连到多肽的末端，不足之处是荧光基团的引入有时会影响多肽的生物活性，经常需要优化才能得到理想的标记肽，即耗时，又耗力；第二种方法可以将荧光基团灵活且准确地标记在多肽的特殊位点上，因此成为多肽荧光标记领域新的发展方向。
发明内容
本发明的目的就是要解决上述背景技术的不足，提供一种具有β-turn模拟物特性的、基于BODIPY的荧光氨基酸及其合成方法与应用，该氨基酸不仅可以直接用于多肽的合成，制备荧光标记多肽，在结构上还可以诱导该多肽形成稳定的β-sheet二级结构。
为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：
一种基于BODIPY的荧光氨基酸，其特征在于，结构通式如下式(I)所示。
其中，R为-CH3、-H、-F、-Cl、-Br、-I中的一种，
R1为-H、-CH3、-CH2CH3、-NO3、-F、-Cl、-Br、-I中的一种，
R2为-H、-CH3、-CH2CH3、-NO3、-F、-Cl、-Br、-I中的一种。
优选的，具有如下的结构之一。
本发明还提供具有上述结构的荧光氨基酸的合成方法，其特征在于，所述合成过程如下所示。
其中化合物1为通式(I)中R＝-H、R1＝-H、R2＝-H时的结构。
优选的，合成步骤为：
a.中间体I-1的制备：
氮气气氛下，吡咯、苯甲醛、三氟乙酸TFA混合室温下搅拌1-2h，经后处理得到固体中间体I-1；
b.中间体I-2的制备：
氮气气氛下，-78℃下将溶有氯代丁二酰亚胺NCS的四氢呋喃THF溶液加入溶有中间体I-1的四氢呋喃THF溶液中，保持-78℃搅拌2-3h，室温继续搅拌3-4h，经后处理得到产物；将得到产物溶于二氯甲烷，加入2,3-二氯-5,6-二氰基-1,4-苯醌DDQ，室温搅拌1-2h，经后处理得到固体中间体I-2；
c.中间体I-3的制备：
氮气气氛下，中间体I-2、三乙胺溶于无水二氯甲烷中，加入三氟化硼乙醚溶液，室温搅拌12-16h，经后处理得到固体中间体I-3；
d.中间体I-4的制备：
中间体I-3、Fmoc保护的氨基乙硫醇、三乙胺在乙腈中室温反 应1-3h，经后处理得到固体中间体I-4；
e.中间体I-5的制备：
中间体I-4、β-丙氨酸叔丁醇酯在乙腈中室温反应12-16h，经后处理得到固体中间体I-5；
f中间体I-6的制备：
中间体I-5、Fmoc-Osu、三乙胺在二氧六环中室温反应3-5h，经后处理得到固体中间体I-6；
g.化合物1的制备：
将中间体I-6溶于二氯甲烷中，冰浴下加入三氟乙酸，室温反应2-4h，经后处理得到化合物1；
上述各步骤中投料比为以下摩尔比：
a.吡咯：苯甲醛：三氟乙酸TFA＝20-25:1:0.1-0.2；
b.中间体I-1：氯代丁二酰亚胺NCS：2,3-二氯-5,6-二氰基-1,4-苯醌DDQ＝1:2.2-3:1.2-2；
c.中间体I-2：三乙胺：三氟化硼乙醚＝1:2.2-3:4.2-5；
d.中间体I-3：Fmoc保护的氨基乙硫醇：三乙胺＝1:1.2-2:1.2-2.4；
e.中间体I-4：β-丙氨酸叔丁醇酯＝1:5-7；
f.中间体I-5：Fmoc-Osu：三乙胺＝1:1.2-2:7.2-8；
g.中间体I-6：三氟乙酸＝1:90-100。
本发明中室温范围为：18-30℃
优选的，步骤为：
a.中间体I-1的制备：
氮气气氛下，吡咯、苯甲醛、三氟乙酸TFA混合室温下搅拌1-2h，经NaOH溶液淬灭、萃取、干燥、过滤、浓缩、重结晶得到固体中间体I-1；
b.中间体I-2的制备：
氮气气氛下，-78℃下将溶有氯代丁二酰亚胺NCS的四氢呋喃THF溶液加入溶有中间体I-1的四氢呋喃THF溶液中，保持-78℃搅拌2-3h，室温继续搅拌3-4h，经加水、二氯甲烷萃取、干燥、过 滤、浓缩得到产物；将得到产物溶于二氯甲烷，加入2,3-二氯-5,6-二氰基-1,4-苯醌DDQ，室温搅拌1-2h，经水洗、萃取、干燥、过滤、浓缩、硅胶柱层析分离提纯得到固体中间体I-2；
c.中间体I-3的制备：
氮气气氛下，中间体I-2、三乙胺溶于无水二氯甲烷中，缓慢加入三氟化硼乙醚溶液，室温搅拌12-16h，经水洗、萃取、干燥、过滤、浓缩、硅胶柱层析分离提纯得到固体中间体I-3。
d.中间体I-4的制备：
将三乙胺加入溶有中间体I-3的乙腈溶液中，再缓慢滴加溶有Fmoc保护的氨基乙硫醇的乙腈溶液，室温反应1-3h，经加水、二氯甲烷萃取、干燥、过滤、浓缩，硅胶柱层析分离提纯得到固体中间体I-4；
e.中间体I-5的制备：
将β-丙氨酸叔丁醇酯加入溶有中间体I-4的乙腈溶液中，室温反应12-16h，经加水、二氯甲烷萃取、干燥、过滤、浓缩、硅胶柱层析分离提纯得到固体中间体I-5；
f.中间体I-6的制备：
将Fmoc-Osu、三乙胺加入溶有中间体I-5的二氧六环溶液中，室温反应3-5h，经加稀盐酸、二氯甲烷萃取、干燥、过滤、浓缩、硅胶柱层析分离提纯得到固体中间体I-6；
g.化合物1的制备：
将中间体I-6溶于二氯甲烷中，冰浴下加入三氟乙酸，室温反应2-4h，经加水、二氯甲烷萃取、干燥、过滤、浓缩、硅胶柱层析分离提纯得到固体化合物1。
优选的，各步骤投料比为以下摩尔比：
a.吡咯：苯甲醛：三氟乙酸TFA＝25:1:0.1；
b.中间体I-1：氯代丁二酰亚胺NCS：2,3-二氯-5,6-二氰基-1,4-苯醌DDQ＝1:2.2:1.2；
c.中间体I-2：三乙胺：三氟化硼乙醚＝1:2.2:4.2；
d.中间体I-3：Fmoc保护的氨基乙硫醇：三乙胺＝1:1.2:1.2；
e.中间体I-4：β-丙氨酸叔丁醇酯＝1:5；
f.中间体I-5：Fmoc-Osu：三乙胺＝1:1.2:7.2；
g.中间体I-6：三氟乙酸＝1:90。
本发明基于BODIPY的荧光氨基酸在合成多肽中的应用。
本发明基于BODIPY的荧光氨基酸作为荧光探针的在多肽与蛋白质互组中的应用。
荧光氨基酸结构的设计包括荧光化合物的选择和结构改造。本发明选择氟硼二吡咯(BODIPY)作为荧光基团，原因主要有两点：一，BODIPY是性能优良的荧光发色团，与其他荧光团相比具有高的荧光量子产率、高的摩尔消光系数、良好的光稳定性、双光子吸收好，可用于活体内检测。二，BODIPY的骨架结构如下所示，C3与C5之间的距离为与天然β-turn中Ri+1与Ri+2之间的距离相符，所以在3、5连接多肽最有可能形成β-sheet结构。
根据上述原因，设计了如下式(I)荧光氨基酸的结构：BODIPY的8位引入苯环，增强其稳定性，BODIPY的骨架结构模拟β-turn的i+1和i+2残基，3，5位分别用Fmoc保护的2-氨基乙巯基和2-羧基乙氨基取代，模拟i和i+3残基。
本发明的有益效果为：将荧光化合物改造成氨基酸类似物，不 仅可以直接用于多肽合成，制备荧光标记多肽，同时在结构上它还可以诱导多肽形成稳定的二级结构，使得到的荧光多肽具有一定的生物活性，作为探针可以直接用于与蛋白质的相互作用研究，具有重大的实际应用前景。
附图说明
图1为化合物2的二氯甲烷溶液的红外光谱图
图2为不同温度下对化合物2氨基氢的核磁位移值图
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步的详细说明。
本发明中荧光氨基酸的合成策略是首先合成BODIPY的骨架结构，3、5位进行氯代，然后分别用Fmoc保护的2-氨基乙硫醇和-丙氨酸分别在3、5位进行亲核取代。
实施例1
a.中间体I-1的制备：
取干燥的500ml的两口瓶，瓶内置换成氮气，加入吡咯(104ml，1.5mol)，苯甲醛(6mL，60mmol)和催化剂三氟乙酸(0.67mL，6mmol)，室温搅拌1h，加入浓度为1M的NaOH溶液(100mL)淬灭，乙酸乙酯萃取(200mL×3)，无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩，乙醇重结晶得褐色固体10.5g，收率80.7％。
b.中间体I-2的制备：
将中间体I-1(5g，22mmol)溶于200mL无水四氢呋喃中，置换成氮气体系，-78℃下加入氯代丁二酰亚胺(6.5g，48.4mmol)的四氢呋喃溶液(60mL)，保持-78℃搅拌2h，然后室温搅拌3h，反应结束后，加水(300mL)，二氯甲烷萃取(200mL×3)，无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩，将得到的产物溶于二氯甲烷(250mL)中，加入2,3-二氯-5,6-二氰基-1,4-苯醌(6g，26.4mmol)，室温搅拌反应1h，反应结束后，水洗(100mL×3)，无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩，硅胶柱层析分离提纯(体积比石油醚：乙酸乙酯＝50:1)得黄色固体5g，收率为79％。
c.中间体I-3的制备：
将中间体I-2(5g，17mmol)溶于无水二氯甲烷(150mL)，置换成氮气体系，加入催化剂三乙胺(5.2mL，37.4mmol)，然后缓慢加入三氟化硼乙醚溶液(8.9mL，71.4mmol)，室温搅拌12h，水洗(100mL×3)，二氯甲烷萃取(200mL×3)，无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩，硅胶柱层析分离提纯(体积比石油醚：乙酸乙酯＝10:1)得深红色固体5.1g，收率89％。
d.中间体I-4的制备：
将中间体I-3(2g，6mmol)溶于100mL乙腈中，加入催化剂三乙胺(1mL，7.2mmol)，将Fmoc(9-芴甲氧羰基)保护的氨基乙硫醇Fmoc-NHCH2CH2SH(2.2g，7.2mmol)溶于80mL乙腈中，将此溶液缓慢滴加入中间体I-3、三乙胺的乙腈溶液中，滴加时间与反应时间相同，室温反应1h，加水(200mL)，二氯甲烷萃取(200mL×3)，无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩，硅胶柱层析分离提纯(体积比石油醚：乙酸乙酯：二氯甲烷＝4:1:0.5)的深红色固体2.5g，收率为70％。m.p.103.8-104.2℃。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.75(d,J＝7.5Hz,2H),7.54-7.51(m,4H),7.46-7.36(m,7H),7.29-7.27(m,2H),6.87(d,J＝4.0Hz,1H),6.72(d,J＝4.0Hz,1H),6.67(d,J＝4.0Hz,1H),6.35(d,J＝4.0Hz,1H),5.40(br,1H),4.36(d,J＝8.0Hz,2H),4.16(t,J＝8.0Hz,1H),3.57-3.53(m,2H),3.29-3.26(m,2H).13C NMR(100MHz,CDCl3)δ156.4,143.7,141.3,140.4,136.6,133.2,133.0,132.4,130.4,130.4,130.3,128.4,128.3,127.7,127.1,125.1,119.9,118.9,116.9,66.9,47.2,40.8,32.8.MS(ESI)calcd for C23H25BClF2N3NaO2S+(M+Na)+622found 622.
e.中间体I-5的制备：
将中间体I-4(1.0g，1.7mmol)溶于80mL乙腈中，然后加入β-丙氨酸叔丁醇酯(1.2mL，8.5mmol)，室温反应12h，加水(100mL)，二氯甲烷萃取(100mL×3)，无水硫酸镁干燥，过滤， 浓缩，硅胶柱层析分离提纯(体积比二氯甲烷：甲醇＝50:1)，得红色固体0.6g，收率为73％。m.p.101.5-103.2℃。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.48–7.43(m,5H),6.88(d,J＝8.0Hz,1H),6.40(d,J＝4.0Hz,1H),6.35(d,J＝4.0Hz,1H),6.24(d,J＝8.0Hz,1H),3.69-3.66(m,2H),3.09-3.06(m,2H),2.99-2.94(m,2H),2.63-2.60(m,2H),1.47(s,9H).13C NMR(100MHz,CDCl3)δ169.9,161.4,137.6,135.4,134.4,134.2,133.3,131.6,130.3,129.1,128.1,120.8,117.9,110.2,82.0,40.7,40.6,39.4,35.9,28.0；MS(ESI)calcd for C24H30BF2N4O2S+(M+H)+487found 487.
f.中间体I-6的制备：
将中间体I-5(0.60g，1.2mmol)溶于50mL二氧六环(1,4-二氧己环)中，加入Fmoc-OSu 9-芴甲基琥珀酰亚氨基碳酸酯(0.50g，1.4mmol)，催化剂三乙胺(1.2mL，8.6mmol)，室温反应3h，加入浓度为1M的稀盐酸50mL，乙酸乙酯萃取(50mL×3)，无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩，硅胶柱层析分离提纯(体积比石油醚：乙酸乙酯＝4:1)得红色固体0.52g，收率为96％；m.p.86.1-87.1℃。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.76-7.74(m,2H),7.61-7.60(m,3H),7.47-7.30(m,8H),7.28-7.27(m,2H),6.87(d,J＝4.0Hz,1H),6.63(s,1H),6.41(m,2H),6.25(d,J＝4.0Hz,1H),5.76(s,1H),4.31-4.29(m,2H),4.21-4.18(m,1H),3.68-3.61(m,2H),3.45-3.44(m,2H),3.09(m,2H),2.60-2.57(m,2H),1.46(s,9H).13C NMR(100MHz,CDCl3)δ169.8,161.5,156.4,144.0,141.2,136.9,135.6,134.3,134.1,133.5,131.7,130.2,129.1,128.1,127.60,127.0,125.3,120.9,119.8,118.6,110.4,82.0,67.0,47.2,40.6,40.1,36.5,35.8,28.0；MS(ESI)calcd for C39H39BF2N4NaO4S+(M+Na)+731found 731.
g.化合物1的制备：
将中间体I-6(0.50g，1mmol)溶于10mL二氯甲烷中，冰浴下加入(10mL，90mmol)三氟乙酸，室温反应2h，加水(30mL)，二氯甲烷萃取(20mL×3)，无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩，硅胶 柱层析分离提纯(体积比二氯甲烷：甲醇：乙酸＝70:1:0.1)得红色固体0.32g，收率77％；m.p.82.1-82.9℃。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.75(d,J＝8.0Hz,2H),7.58(d,J＝8.0Hz,2H),7.53-7.33(m,9H),7.31-7.27(m,2H),6.97-6.96(m,1H),6.82(m,1H),6.43(m,1H),6.27-6.26(m,1H),4.35(d,J＝8.0Hz,2H),4.19(t,J＝8.0Hz,1H),3.75-3.71(m,2H),3.35-3.34(m,2H),2.77-2.74(m,4H)；13C NMR(100MHz,CDCl3)δ176.11,161.91,143.98,141.30,136.85,134.07,133.10,130.25,129.39,128.36,127.66,127.07,125.14,123.51,119.93,110.87,66.82,47.23,40.16,36.88,34.21,20.55；MS(ESI)calcd for C35H31BF2N4NaO4S+(M+Na)+675found 675.
各步骤投料比为以下摩尔比：
a.吡咯：苯甲醛：三氟乙酸TFA＝25:1:0.1；
b.中间体I-1：氯代丁二酰亚胺NCS：2,3-二氯-5,6-二氰基-1,4-苯醌DDQ＝1:2.2:1.2；
c.中间体I-2：三乙胺：三氟化硼乙醚＝1:2.2:4.2；
d.中间体I-3：Fmoc保护的氨基乙硫醇：三乙胺＝1:1.2:1.2；
e.中间体I-4：β-丙氨酸叔丁醇酯＝1:5；
f.中间体I-5：Fmoc-Osu：三乙胺＝1:1.2:7.2；
g.中间体I-6：三氟乙酸＝1:90。
本发明中室温为18-30℃(本实施例优选25℃)。
实施例2
a.中间体I-1的制备：
取干燥的500ml的两口瓶，瓶内置换成氮气，加入吡咯(83.2ml，1.2mol)，苯甲醛(6mL，60mmol)和三氟乙酸(1.34mL，12mmol)，室温搅拌2h，加入1M NaOH溶液(100mL)淬灭，乙酸乙酯萃取(200mL×3次)，无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩，乙醇重结晶得褐色固体中间体I-1。
b.中间体I-2的制备：
将中间体I-1(5g，22mmol)溶于200mL无水四氢呋喃中，置换成氮气体系，-78℃下加入氯代丁二酰亚胺(8.86g，66mmol)的四氢呋喃溶液(60mL)，保持-78℃搅拌3h，然后室温搅拌4h，反应结束后，加水(300mL)，二氯甲烷萃取(200mL×3次)，无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩。将得到的产物溶于二氯甲烷(250mL)中，加入2,3-二氯-5,6-二氰基-1,4-苯醌(10g，44mmol)，室温反应2h，反应结束后，水洗(100mL×3次)，无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩，硅胶柱层析分离提纯(体积比石油醚：乙酸乙酯＝50:1)得黄色固体中间体I-2。
c.中间体I-3的制备：
将中间体I-2(5g，17mmol)溶于无水二氯甲烷(150mL)，置换成氮气体系，加入三乙胺(7.09mL，51mmol)，然后缓慢加入三氟化硼乙醚溶液(10.6mL，85mmol)，室温搅拌16h，水洗(100mL×3)，无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩，硅胶柱层析分离提纯(体积比石油醚：乙酸乙酯＝10:1)得深红色固体中间体I-3。
d.中间体I-4的制备：
将中间体I-3(2g，6mmol)溶于100mL乙腈中，加入三乙胺(2mL，14.4mmol)，将Fmoc保护的氨基乙硫醇(3.6g，12mmol)溶于80mL乙腈中，将此溶液缓慢滴加入中间体I-3、三乙胺的乙腈溶液中，滴加时间与反应时间相同，室温反应3h，加水(200mL)，二氯甲烷萃取(200mL×3)，无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩，硅胶柱层析分离提纯(体积比石油醚：乙酸乙酯：二氯甲烷＝4:1:0.5)的深红色中间体I-4。
e.中间体I-5的制备：
将中间体I-4(1.0g，1.7mmol)溶于80mL乙腈中，然后加入-丙氨酸叔丁醇酯(1.68mL，11.9mmol)，室温反应16h，加水(100mL)，二氯甲烷萃取(100mL×3)，无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩，硅胶柱层析分离提纯(体积比二氯甲烷：甲醇＝50:1)，得红 色固体中间体I-5。
f.中间体I-6的制备：
将中间体I-5(0.60g，1.2mmol)溶于50mL二氧六环中，加入Fmoc-OSu(0.86g，2.4mmol)，三乙胺(1.34mL，9.6mmol)，室温反应5h，加入1M稀盐酸50mL，乙酸乙酯萃取(50mL×3)，无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩，硅胶柱层析分离提纯(体积比石油醚：乙酸乙酯＝4:1)得红色固体中间体I-6。
g.化合物1的制备：
将中间体I-6(0.50g，1mmol)溶于10mL二氯甲烷中，冰浴下加入三氟乙酸(11.11mL，100mmol)，室温反应4h，加水(30mL)，二氯甲烷萃取(20mL×3)，无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩，硅胶柱层析分离提纯(体积比二氯甲烷：甲醇：乙酸＝70:1:0.1)得红色固体化合物1。
各步骤投料比为以下摩尔比：
a.吡咯：苯甲醛：三氟乙酸TFA＝20:1:0.2；
b.中间体I-1：氯代丁二酰亚胺NCS：2,3-二氯-5,6-二氰基-1,4-苯醌DDQ＝1:3:2；
c.中间体I-2：三乙胺：三氟化硼乙醚＝1:3:5；
d.中间体I-3：Fmoc保护的氨基乙硫醇：三乙胺＝1:2：2.4；
e.中间体I-4：β-丙氨酸叔丁醇酯＝1:7；
f.中间体I-5：Fmoc-Osu：三乙胺＝1:2:8；
g.中间体I-6：三氟乙酸＝1:100。
本发明中室温为18-30℃(本实施例优选18℃)。
实施例3
a.中间体I-1的制备：
取干燥的500ml的两口瓶，瓶内置换成氮气，加入吡咯(93.6ml，1.35mol)，苯甲醛(6mL，60mmol)和三氟乙酸(1.01mL，9mmol)，室温搅拌1.5h，加入1M NaOH溶液(100mL) 淬灭，乙酸乙酯萃取(200mL×3次)，无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩，乙醇重结晶得褐色固体中间体I-1。
b.中间体I-2的制备：
将中间体I-1(5g，22mmol)溶于300mL无水四氢呋喃中，置换成氮气体系，-78℃下加入氯代丁二酰亚胺(7.39g，55mmol)的四氢呋喃溶液(100mL)，保持-78℃搅拌2.5h，然后室温搅拌3.5h，反应结束后，加水(300mL)，二氯甲烷萃取(200mL×3次)，无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩。将得到的产物溶于二氯甲烷(280mL)中，加入2,3-二氯-5,6-二氰基-1,4-苯醌(7.5g，33mmol)，室温反应1.5h，反应结束后，水洗(100mL×3次)，无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩，硅胶柱层析分离提纯(体积比石油醚：乙酸乙酯＝50:1)得黄色固体中间体I-2。
c.中间体I-3的制备：
将中间体I-2(5g，17mmol)溶于无水二氯甲烷(250mL)，置换成氮气体系，加入三乙胺(5.91mL，42.5mmol)，然后缓慢加入三氟化硼乙醚溶液(9.54mL，76.5mmol)，室温搅拌14h，水洗(100mL×3)，无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩，硅胶柱层析分离提纯(体积比石油醚：乙酸乙酯＝10:1)得深红色固体中间体I-3。
d.中间体I-4的制备：
将中间体I-3(2g，6mmol)溶于200mL乙腈中，加入三乙胺(1.7mL，12mmol)，将Fmoc保护的氨基乙硫醇(2.7g，9mmol)溶于120mL乙腈中，将此溶液缓慢滴加入中间体I-3、三乙胺的乙腈溶液中，滴加时间与反应时间相同，室温反应2h，加水(200mL)，二氯甲烷萃取(200mL×3)，无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩，硅胶柱层析分离提纯(体积比石油醚：乙酸乙酯：二氯甲烷＝4:1:0.5)的深红色中间体I-4。
e.中间体I-5的制备：
将中间体I-4(1.0g，1.7mmol)溶于120mL乙腈中，然后加入β-丙氨酸叔丁醇酯(1.44mL，10.2mmol)，室温反应14h，加水 (100mL)，二氯甲烷萃取(100mL×3)，无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩，硅胶柱层析分离提纯(体积比二氯甲烷：甲醇＝50:1)，得红色固体中间体I-5。
f.中间体I-6的制备：
将中间体I-5(0.60g，1.2mmol)溶于100mL二氧六环中，加入Fmoc-OSu(0.64g，1.8mmol)，三乙胺(1.26mL，9mmol)，室温反应4h，加入1M稀盐酸50mL，乙酸乙酯萃取(50mL×3)，无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩，硅胶柱层析分离提纯(体积比石油醚：乙酸乙酯＝4:1)得红色固体中间体I-6。
g.化合物1的制备：
将中间体I-6(0.50g，1mmol)溶于30mL二氯甲烷中，冰浴下加入三氟乙酸(10.56mL，95mmol)，室温反应3h，加水(30mL)，二氯甲烷萃取(20mL×3)，无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩，硅胶柱层析分离提纯(体积比二氯甲烷：甲醇：乙酸＝70:1:0.1)得红色固体化合物1。
各步骤投料比为以下摩尔比：
a.吡咯：苯甲醛：三氟乙酸TFA＝22.5:1:0.15；
b.中间体I-1：氯代丁二酰亚胺NCS：2,3-二氯-5,6-二氰基-1,4-苯醌DDQ＝1:2.5:1.5；
c.中间体I-2：三乙胺：三氟化硼乙醚＝1:2.5:4.5；
d.中间体I-3：Fmoc保护的氨基乙硫醇：三乙胺＝1:1.5:2；
e.中间体I-4：β-丙氨酸叔丁醇酯＝1:6；
f.中间体I-5：Fmoc-Osu：三乙胺＝1:1.5:7.5；
g.中间体I-6：三氟乙酸＝1:95。
本发明中室温为18-30℃(本实施例优选30℃)。
实施例4
a.中间体I-1的制备：
取干燥的500ml的两口瓶，瓶内置换成氮气，加入吡咯 (99.84ml，1.44mol)，苯甲醛(6mL，60mmol)和三氟乙酸(1.14mL，10.2mmol)，室温搅拌1h，加入1M NaOH溶液(100mL)淬灭，乙酸乙酯萃取(200mL×3次)，无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩，乙醇重结晶得褐色固体中间体I-1。
b.中间体I-2的制备：
将中间体I-1(5g，22mmol)溶于250mL无水四氢呋喃中，置换成氮气体系，-78℃下加入氯代丁二酰亚胺(8.27g，61.6mmol)的四氢呋喃溶液(80mL)，保持-78℃搅拌2h，然后室温搅拌3h，反应结束后，加水(300mL)，二氯甲烷萃取(200mL×3次)，无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩。将得到的产物溶于二氯甲烷(300mL)中，加入2,3-二氯-5,6-二氰基-1,4-苯醌(9g，39.6mmol)，室温反应1h，反应结束后，水洗(100mL×3次)，无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩，硅胶柱层析分离提纯(体积比石油醚：乙酸乙酯＝50:1)得黄色固体中间体I-2。
c.中间体I-3的制备：
将中间体I-2(5g，17mmol)溶于无水二氯甲烷(200mL)，置换成氮气体系，加入三乙胺(6.62mL，47.6mmol)，然后缓慢加入三氟化硼乙醚溶液(10.17mL，81.6mmol)，室温搅拌过夜，水洗(100mL×3)，无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩，硅胶柱层析分离提纯(体积比石油醚：乙酸乙酯＝10:1)得深红色固体中间体I-3。
d.中间体I-4的制备：
将中间体I-3(2g，6mmol)溶于150mL乙腈中，加入三乙胺(1.3mL，9mmol)，将Fmoc保护的氨基乙硫醇(3.24g，10.8mmol)溶于100mL乙腈中，将此溶液缓慢滴加入中间体I-3、三乙胺的乙腈溶液中，滴加时间与反应时间相同，室温反应1h，加水(200mL)，二氯甲烷萃取(200mL×3)，无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩，硅胶柱层析分离提纯(体积比石油醚：乙酸乙酯：二氯甲烷＝4:1:0.5)的深红色中间体I-4。
e.中间体I-5的制备：
将中间体I-4(1.0g，1.7mmol)溶于100mL乙腈中，然后加入β-丙氨酸叔丁醇酯(1.32mL，9.35mmol)，室温反应过夜，加水(100mL)，二氯甲烷萃取(100mL×3)，无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩，硅胶柱层析分离提纯(体积比二氯甲烷：甲醇＝50:1)，得红色固体中间体I-5。
f.中间体I-6的制备：
将中间体I-5(0.60g，1.2mmol)溶于80mL二氧六环中，加入Fmoc-OSu(0.75g，2.1mmol)，三乙胺(1.31mL，9.36mmol)，室温反应3h，加入1M稀盐酸50mL，乙酸乙酯萃取(50mL×3)，无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩，硅胶柱层析分离提纯(体积比石油醚：乙酸乙酯＝4:1)得红色固体中间体I-6。
g.化合物1的制备：
将中间体I-6(0.50g，1mmol)溶于20mL二氯甲烷中，冰浴下加入三氟乙酸(10.98mL，98mmol)，室温反应2h，加水(30mL)，二氯甲烷萃取(20mL×3)，无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩，硅胶柱层析分离提纯(体积比二氯甲烷：甲醇：乙酸＝70:1:0.1)得红色固体化合物1。
各步骤投料比为以下摩尔比：
a.吡咯：苯甲醛：三氟乙酸TFA＝24:1:0.17；
b.中间体I-1：氯代丁二酰亚胺NCS：2,3-二氯-5,6-二氰基-1,4-苯醌DDQ＝1:2.8:1.8；
c.中间体I-2：三乙胺：三氟化硼乙醚＝1:2.8:4.8；
d.中间体I-3：Fmoc保护的氨基乙硫醇：三乙胺＝1:1.8:1.5；
e.中间体I-4：β-丙氨酸叔丁醇酯＝1:5.5；
f.中间体I-5：Fmoc-Osu：三乙胺＝1:1.75:7.8；
g.中间体I-6：三氟乙酸＝1:98。
本发明中室温为18-30℃(本实施例优选20℃)。
化合物1使其连接的多肽形成二级结构(β-sheet)能力的验证
验证化合物1是否能诱导连接的多肽形成β-sheet的结构，主要考察其氨基氢和羰基氧是否存在分子内的氢键，通过合成化合物2(结构如下式所示)来验证。
合成路线：
中间体1-8的制备：
将中间体I-3(100mg，0.30mmol)溶于30mL乙腈中，加入三乙胺(0.2mL，1.44mmol)，N-乙酰基半胱胺(32μL，0.30mmol)溶于10mL乙腈中，将此溶液缓慢加入反应体系中，室温搅拌1h，加水(50mL)，二氯甲烷萃取(50mL×3)，无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩，硅胶柱层析分离提纯(体积比二氯甲烷：甲醇＝30:1)得红色固体105mg，收率为84％。m.p.208.8-209.6℃。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.56-7.45(m,5H),6.91(d,J＝4.5Hz,1H),6.73(d,J＝4.5Hz,1H),6.70(d,J＝4.0Hz,1H),6.36(d,J＝4.0Hz,1H),6.19(s,1H),3.58(q,J＝6.3Hz,2H),3.27(t,J＝6.4Hz,2H),1.95(s,3H).13C NMR(100MHz,CDCl3)δ170.7,159.8,140.6,136.5,133.2,132.9,132.4,130.4,130.3,128.6,128.5,119.4,117.1,39.27,32.96,23.10；MS(ESI)calcd for C19H17BClF2N3NaOS+(M+Na)+422found 422.
化合物2的制备：
将中间体1-8(50mg，0.12mmol)溶于20mL乙腈中，加入N-甲基-β-丙氨酰胺(25mg，0.18mmol)，室温反应过夜，加水(20mL)，二氯甲烷萃取(20mL×3)，无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩，硅胶柱层析分离提纯(体积比二氯甲烷：甲醇＝20:1)得红色固体45mg，收率为78％。m.p.104.8-105.4℃。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.53-7.39(m,5H),6.89(d,J＝5.0Hz,1H),6.75(s,1H),6.58(s,1H),6.45-6.38(m,2H),6.31(d,J＝5.0Hz,1H),5.78(s,1H),3.80-3.75(m,2H),3.47-3.43(m,2H),3.06-3.03(m,2H),2.80(d,J＝4.8Hz,3H),2.54(t,J＝6.4Hz,2H),1.92(s,3H).13C NMR(100MHz,CDCl3)δ170.4,170.2,161.7,136.6,135.7,134.2,134.0,133.5,131.5,130.2,129.2,128.2,120.9,118.9,110.8,41.1,38.3,36.8,36.5,26.4,23.1；MS(ESI)calcd for C23H26BF2N5NaO2S+(M+Na)+508found 508.
化合物2分子内氢键测试：
化合物2存在分子内的氢键主要有两种类型，如下2-A和2-B所示，据文献报道(Nesloney,C.L.；Kelly,J.W.Synthesis and hydrogen bonding capabilities of biphenyl-based amino acids designed to nucleate β-sheet structure.J.Org.Chem.1996,61,3127-3137.)酰胺键的氮氢伸缩振动峰在3200-3500cm-1的范围内，通常在3400-3500cm-1范围内的较窄的峰为自由的氮氢键伸振动峰，3200-3400cm-1范围内的宽峰为存在氢键的氮氢伸缩振动峰。
我们将合成所得的化合物2溶解于无水二氯甲烷，室温条件下 测得红外光谱图，如图1所示，在最高峰为3310cm-1处有一宽峰，主要为2-A和2-B两种混合状态下存在分子内氢键的氮氢伸缩振动，因为红外检测速度远大于这两种构象达到平衡的速度。而在最高峰为3410cm-1处的窄峰则为2-A与2-B中氨基的氮氢和酰胺键未形成分子内氢键的氮氢伸缩振动之和。
对化合物2进行红外光谱研究的同时，也研究了其在不同温度下酰胺键的氨基氢的核磁位移值。如图2所示，通常情况下，25℃，CD2Cl2为溶剂进行氢谱扫描，存在氢键的氨基氢的位移值一般在低场(～7.0-9.0ppm)，而自由的氨基氢的位移值一般在(～5.5-6.0ppm)。并且存在分子内的氢键的氨基氢的核磁位移值与温度存在很大的关系(Δδ/ΔT～-10至-13ppb/K)，自由氨基的氢则随着温度变化相对较小(Δδ/ΔT～-3ppb/K)。不同温度下对化合物2进行核磁氢谱的研究，化合物2中氨基氢随温度逐渐降低而像低场移动，其中存在2-A与2-B的平衡，它们的Δδ/ΔT约为-12ppb/K。
通过基于对化合物2的红外光谱和变温核磁氢谱两方面的研究可以证明此类化合物存在分子内的氢键，具有诱导其连接的多肽形成β-sheet的结构的能力。