技术领域
本发明涉及一种能降解黄曲霉毒素B1的裂解酶的分离纯化方法，属于生物工程领域。
背景技术
黄曲霉毒素是一类主要由黄曲霉(Aspergillusflavus)和寄生曲霉(Aspergillusparasiticus) 产生的带有一个氧杂萘邻酮和一个双呋喃环的强毒性次级代谢产物。目前已经鉴定出的黄曲 霉毒素有20多种，而AFB1是粮食中最常见的，也是毒性最大的，被世界卫生组织定为1A 类致癌物质。
AFB1在粮食中的存在严重威胁着动物以及人体的健康，研究高效、安全降解AFB1已成 为当前关注的热点。在各种AFB1去除方法中，由于物理法和化学法存在破坏粮食的营养物 质成分或造成化学物质残留和影响适口性等不足，目前生物脱毒普遍被认为是最有前途的方 法。生物脱毒是指毒素分子上的毒性基团被微生物或是其代谢产物分解破坏，同时产生无毒 降解产物的过程。在自然界已经发现包括细菌，真菌(含酵母)在内的多种微生物能够吸附 真菌毒素或是分泌降解真菌毒素的物质，这些微生物的脱毒机理主要有：菌体细胞对毒素的 吸附作用和发酵产生的酶对毒素的降解作用。
前期我们筛选到1株不但能明显抑制黄曲霉生长，且能高效降解AFB1的安全菌株，目 前已保藏至中国普通微生物菌种保藏管理中心，命名为解淀粉芽孢杆菌CGMCCNO.9021。 对解淀粉芽孢杆菌CGMCCNO.9021降解AFB1的特性研究发现，AFB1的降解不是依赖菌体 吸附，而是由于其代谢产生的胞外活性物质，这种活性物质是一种蛋白质。然而，和目前大 多数降解AFB1菌种研究相类似，由于目的蛋白不明确，发酵工艺优化工作难以开展，导致 大规模工业化应用工作进展迟缓。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供一种能降解黄曲霉毒素B1的裂解酶的分离纯化方法。本发 明通过硫酸铵分级沉淀、DEAEFF阴离子交换层析和Superdux75凝胶过滤层析等步骤获得 解淀粉芽孢杆菌CGMCCNO.9021发酵液中降解AFB1的活性物质，通过质谱鉴定和荧光色 谱技术分析该活性蛋白及其降解机理。
所述方法是从解淀粉芽孢杆菌CGMCCNO.9021的发酵液中，依次利用硫酸铵分级沉淀、 DEAEFF阴离子交换层析和Superdux7510/300GL凝胶过滤层析来分离纯化得到黄曲霉毒素 B1裂解酶。
所述方法，在本发明的一种实施方式中，包括：(1)硫酸铵分级沉淀：解淀粉芽孢杆菌 CGMCCNO.9021发酵液经0-40％硫酸铵沉淀后离心，然后将沉淀的蛋白复溶，透析；(2) 透析后的蛋白溶液经微孔滤膜过滤后，上样于DEAEFF阴离子交换柱，用磷酸盐缓冲液冲洗， 然后用含1mol/LNaCl的磷酸盐缓冲液进行恒梯度洗脱，收集具有降解AFB1活性的组分；(3) 将上一步收集得到的活性组分上样于Superdux7510/300GL凝胶过滤层析柱，用磷酸盐缓冲 液进行洗脱，收集具有降解AFB1活性的组分。
所述步骤(2)，在本发明的一种实施方式中，中收集的是第二个蛋白吸收峰的蛋白溶液。
所述步骤(3)，在本发明的一种实施方式中，收集的是第三个蛋白吸收峰的蛋白溶液。
所述硫酸铵沉淀，在本发明的一种实施方式中，是使用20-40％硫酸铵沉淀。
所述复溶，在本发明的一种实施方式中，是使用20mmol/L、pH7.0的磷酸盐缓冲液。
所述磷酸盐缓冲液，在本发明的一种实施方式中，浓度为10-50mmol/L，pH6.8-7.4。
所述磷酸盐缓冲液，在本发明的一种实施方式中，浓度为20mmol/L，pH7.0。
所述方法，在本发明的一种实施方式中，具体包括：
(1)解淀粉芽孢杆菌CGMCC-9021发酵液经40％硫酸铵沉淀，然后于4℃、10000r/min 离心10min，将沉淀蛋白用20mmol/L、pH7.0的磷酸盐缓冲液复溶，透析过夜；
(2)透析后的蛋白溶液通过0.22μm微孔滤膜过滤，上样于HiPrep16/10DEAEFF离子 交换柱，用20mmol/L、pH7.0的磷酸盐缓冲液冲洗，然后用含1mol/LNaCl的磷酸盐缓冲 液(20mmol/L、pH7.0)进行恒梯度洗脱，收集第二个蛋白吸收峰；
(3)将上一步收集的蛋白溶液上样于Superdux7510/300GL凝胶过滤层析柱，用20 mmol/L、pH7.0的磷酸盐缓冲液进行洗脱，收集第三个蛋白吸收峰。
本发明还提供了一种黄曲霉毒素B1裂解酶的鉴定方法。
所述鉴定方法是：收集分离纯化的各个步骤中具有降解AFB1活性的成分进行 Tricine-SDS-PAGE分析，分析各个泳道中共有的条带，选择共有条带(即目标条带)进行手 动切胶，进行质谱鉴定(MALDI-TOF/TOF)，用Mascot软件在NCBInr数据库中对蛋白质的 质谱数据进行搜索匹配，Mascot分值大于59即可认定物质鉴定有效。
本发明还提供了一种黄曲霉毒素B1裂解酶的黄曲霉毒素降解机理分析方法。
所述分析方法，是将AFB1标准溶液和降解AFB1的活性物质溶液加入棕色反应瓶中，37℃ 避光反应。采用三倍体积的三氯甲烷进行液相萃取AFB1，之后加入50％的甲醇溶液震荡溶解， 在365nm的激发波长下测定荧光强度，通过荧光强度的改变推测降解机理。
本发明的有益效果：成功分离纯化到了电泳纯的解淀粉芽孢杆菌CGMCCNO.9021来源 的黄曲霉毒素B1裂解酶，活性蛋白为分子量约27kDa。本发明的裂解酶通过破坏黄曲霉毒素 B1的内酯环结构降低毒性，本发明方法可以指导优化解淀粉芽孢杆菌CGMCCNO.9021工业 化产黄曲霉毒素B1裂解酶的发酵及纯化工艺，奠定其工业化生产应用的重要基础。
附图说明
图1：硫酸铵分级沉淀各部分对AFB1的降解作用；
图2：HiPrep16/10DEAEFF色谱柱色谱洗脱图谱；
图3：Superdux7510/300GL色谱柱色谱洗脱图谱；
图4：Tricine-SDS-PAGE图谱；其中：M为标样，1为上清液，2为40％硫酸铵沉淀溶液，3 为L1(离子色谱峰1)，4为L2(离子色谱峰2)，5为N3(凝胶色谱峰3)；
图5：蛋白质的质谱分析结果；注：(a)为条带1的MALDI-TOF分析，(b)～(f)为条带1 的MALDI-TOF-TOF分析；
图6：解淀粉芽孢杆菌裂解酶对AFB1荧光特性的影响；
图7：解淀粉芽孢杆菌裂解酶对AFB1的可能作用机理。
具体实施方式
实施例1：黄曲霉毒素B1裂解酶的分离、纯化、鉴定
(1)解淀粉芽孢杆菌CGMCCNO.9021发酵液经饱和硫酸铵分级沉淀，测定各个部分 沉淀蛋白对AFB1的降解效果，结果如图1所示。最终确定饱和硫酸铵沉淀区间为0-40％。发 酵液经40％饱和硫酸铵沉淀后，4℃，10000r/min离心10min，将各部分沉淀蛋白用20mmol/L 磷酸盐缓冲液(pH7.0)复溶，透析过夜。
(2)透析后的蛋白溶液通过0.22μm微孔滤膜过滤，上样于HiPrep16/10DEAEFF离子 交换柱，用磷酸盐缓冲液(20mmol/L、pH7.0)冲洗，然后用含1mol/LNaCl的磷酸盐缓冲 液(20mmol/L、pH7.0)进行恒梯度洗脱，收集到2个蛋白吸收峰，如图2所示，分别命名 为L1和L2。测定L1、L2对AFB1的降解情况。其中，L2具有较高的降解AFB1的活性，其 降解率为80.3％，L1的降解率为17.0％。因此，降解AFB1的活性物质主要集中于第二个色 谱峰，收集第二个色谱峰，并对其蛋白浓度、体积进行测定，储存于4℃以备用。
(3)通过Superdux7510/300GL凝胶过滤色谱将L2色谱峰分离为4个色谱峰，分别命 名为N1、N2、N3、N4，结果如图3所示，并测定其对AFB1的降解效果，其中N3具有明显 降解AFB1的活性，降解率为32.4％。收集第三个色谱峰，并对其蛋白浓度、体积进行测定， 储存于4℃以备用。
(4)收集分离纯化的各个步骤中具有降解AFB1活性的成分进行Tricine-SDS-PAGE分析， 电泳结果如图4所示，从Tricine-SDS-PAGE图谱上可以看出5个泳道中均具有一条共有的条 带，而且N3只有该条带本身，说明其可能为降解AFB1的活性物质，且分子量27kDa左右。
(5)对Tricine-SDS-PAGE泳道5中的蛋白条带1挖点后进行酶切，然后将其进行串联 质谱(MALDI-TOF/TOF)分析和蛋白数据库(NCBInr)检索，匹配结果见表1，质谱分析见图 5。该蛋白点鉴定结果为lyticenzymeL27[Bacillussubtilis](登录号为gi|3986320)，其匹配总 得分为494，蛋白质分子量(Mr)为27479，蛋白质等电点(pI)为6.65。
表1质谱分析中匹配的肽段序列信息
Table1TheinformationofmatchpeptidesequencebyMassSpectrometryanalysis
注：登录号：gi|3986320，分子量：27479，lyticenzymeL27[Bacillussubtilis]。
(6)将25μLAFB1标准溶液，975μL无菌的降解AFB1的活性物质溶液加入棕色反应瓶 中，使得混合溶液中AFB1的浓度为1000ng/mL，37℃避光反应0天、1天、3天。三倍体积 于反应液的三氯甲烷进行液相萃取AFB1，之后加入1.5mL50％的甲醇水溶液震荡溶解，在 365nm的激发波长下测定不同反应条件下的AFB1荧光强度。AFB1经过解淀粉芽孢杆菌裂解 酶的不同时间处理后，其荧光特性发生了明显的改变，随着反应时间的增加，AFB1的荧光特 性不断降低，也即其降解产物的化学结构发生了改变，荧光特性消失，如图6所示。推测解 淀粉芽孢杆菌裂解酶对AFB1的作用位点可能是内酯环结构，如图7所示。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人， 在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以 权利要求书所界定的为准。