技术领域
本发明属于生物防治植物病害领域。具体而言，本发明涉及一株能够高效防治植物病害 的芽孢杆菌及其用途，以及采用该芽孢杆菌制备的生物防治制剂。
背景技术
植物病害是植物在生物或非生物因子的影响下，发生一系列形态、生理和生化上的病理 变化，阻碍了正常生长、发育的进程，从而影响人类经济效益的现象。目前对于植物病害的 防治，常规采用的方法包括传统的化学防治、培育抗病品种以及生物防治。抗病品种培育周 期长，抗性单一，而化学防治，极易造成农药残留，环境污染；同时，化学农药的长期使用， 使得病原菌对其产生抗药性，导致防效下降甚至失败。因此，利用有益微生物防治植物病害 具有广阔的前景。
芽孢杆菌(Bacillus)，在分类上是细菌的一个科，能形成芽孢(内生孢子)的杆菌或球 菌。包括芽孢杆菌属、芽孢乳杆菌属、梭菌属、脱硫肠状菌属和芽孢八叠球菌属等。形成芽 孢后，它们对外界有害因子抵抗力强，分布广，存在于土壤、水、空气以及动物肠道等处。 由于它们代谢快、繁殖快，四小时增殖10万倍；生命力强，耐受性好；体积大，占据空间优 势，抑制有害菌的生长繁殖等优势而备受瞩目。芽孢杆菌是植物病害生防微生物的重要组成 部分，可用于防治多种植物病害。芽孢杆菌作为生防菌防治植物病害的机制主要有：抗生作 用、营养竞争、空间竞争、重寄生作用以及诱导植物产生抗性等机制，芽孢杆菌的生防机制 主要是以产生拮抗物质抑制有害病菌的生长或杀死病原菌。这些物质绝大多数为肽类抗生素， 具有高效、低残留、与环境友好等优点。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于高效防治多种植物病害的新的微生物——蕈状芽孢杆菌 WWM09。本发明的芽孢杆菌菌株具有直径长、耐低氧、作用谱广、适应性强，在低营养下 即可快速生长繁殖等特点，因此具有良好的应用前景。
本发明所提供的菌株为蕈状芽孢杆菌(Bacillus mycoides)WWM09，是从渤海浅海海水 中分离获得的，已于2015年7月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 (简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保 藏编号为CGMCC No.11047。其具有以下生物学特性：在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基或LB培 养基上菌落形态为圆形或不规则形，乳白偏黄色，表面粗糙起褶皱，在牛肉膏蛋白胨琼脂培 养基上，28℃下培养两天后，镜检，菌体细胞呈杆状，能运动。经革兰氏染色呈阳性(以大肠 杆菌为对照)。经芽孢染色后观察芽孢呈椭圆形或柱状。
本发明蕈状芽孢杆菌(Bacillus mycoides)菌株WWM09的培养方法或繁殖方法包括：
(1)普通培养保存采用LB培养基，配方为：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠 10g，琼脂15-20g，蒸馏水1000mL，pH调至7.0-7.2；
(2)实验室液体培养采用LB液体培养基，配方为：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g， 氯化钠10g，蒸馏水1000mL，pH调至7.0-7.2；
(3)固体培养基配方：固料和无机盐溶液，固料和无机盐溶液的质量比为1:2.0；所述 固料由按质量比为65：20：15的玉米面、豆粕和麸皮组成；按质量百分比计，所述无机盐溶 液的组分及含量为：2.7％磷酸二氢钾，0.04％硫酸镁，3.5％硫酸铵，剩余为水；
(4)大量发酵培养基配方：同(3)中固体培养基配方。
本发明还提供一种含有所述的蕈状芽孢杆菌菌株WWM09的生物防治制剂。
本发明所述的生物防治制剂的制备方法包括以下步骤：
(1)制备蕈状芽孢杆菌菌株WWM09的种子液；
(2)将步骤(1)制备的种子液接种到固体培养基中，28-30℃下恒温培养3～5d；
(3)将步骤(2)培养的培养物加入无菌水，过滤，将滤液接种至大量发酵培养基，在 室温28-30℃、相对湿度85％以上的发酵室中进行发酵培养。
其中，步骤(2)中的固体培养基由固料和无机盐溶液组成，所述固料和无机盐溶液的质 量比为1：2.0；所述固料由质量比为65：20：15的玉米面、豆粕和麸皮组成；按质量百分比 计，所述无机盐溶液的组分及含量为：2.7％磷酸二氢钾，0.04％硫酸镁，3.5％硫酸铵，剩余 为水。
并且，步骤(3)中的大量发酵培养基同固体培养基。
在本发明的一个具体实施方案中，所述制备方法包括以下步骤：
(1)将所述蕈状芽孢杆菌菌株WWM09的孢子移植到LB液体培养基中，28-30℃摇床 振荡培养3～5d得到种子液；
(2)将步骤(1)制备的种子液按质量比10％的比例接种到固体培养基中，28-30℃下振 荡培养3～5d；
(3)将步骤(2)培养的培养物加入无菌水按质量比1：15的比例混合，过滤，将滤液 按体积比1：6的比例接种至发酵培养基，室温28-30℃、相对湿度85％以上的发酵室中发酵 培养5～6d。
本发明也提供了上述蕈状芽孢杆菌菌株WWM09或者上述生物防治制剂在防治植物叶部 病害中的用途。所述植物叶部病害可以选自黄瓜白粉病、葡萄霜霉病、月季白粉病等一种或 几种。
并且，本发明还提供了一种用于防治植物叶部病害的生物防治方法，所述生物防治方法 包括向具有叶部病害的植物施用上述蕈状芽孢杆菌菌株WWM09或者上述生物防治制剂。
实验表明，本发明的蕈状芽孢杆菌菌株WWM09具有直径长、耐低氧、作用谱广、适应 性强，在低营养下即可快速生长繁殖等特点，因此具有良好的应用前景。由该蕈状芽孢杆菌 菌株WWM09制备的生物防治制剂可以作为生物农药或生物肥料，防治黄瓜白粉病、葡萄霜 霉病、月季白粉病等叶部病害，还可以防治棉花立枯病、西瓜枯萎病等多种土传植物病害。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清 楚。但这些实施例仅是示例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该 理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或 替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1
1、蕈状芽孢杆菌菌株WWM09的分离与纯化
本发明的蕈状芽孢杆菌菌株WWM09是从海水中采用稀释平板法和平板划线法分离 获得的，分离方法为：
⑴芽孢杆菌的分离：水样的采集，在山东省潍坊北部渤海海域不同地点，采用随机取 样法，分别采集离海岸2.5米范围内的海水适量，混匀。标明采集地点、时间和采集人。 称取1g水于100mL无菌水中，置于30℃摇床中150rpm震荡10min，然后置于60℃水 浴锅中孵育30min，取100μL 10-1、10-2、10-3稀释液涂布于LB培养基平板上，每个梯度 涂布三个平行，在30℃培养2d后挑取LB培养基上的不同形态的微生物菌落于LB培养 基平板上进行划线，定时观察菌落生长情况。然后采用平板划线法，纯化芽孢杆菌菌株， 分别编号保存。
⑵黄瓜白粉病高效拮抗芽孢杆菌的筛选
①初筛：黄瓜白粉病Sphaerotheca fuliginea(Schlecht)Poll.病原为单丝白粉菌属子囊菌亚 门真菌。该菌系专性寄生菌，只在活体寄主上存活。因此，筛选时必须在黄瓜上接种病原菌 培养而不是离体平板培养测定。
黄瓜白粉病喜温湿、耐干燥。温度10～30℃，相对湿度25％～85％，其孢子即可萌发。 发病最适温度16～24℃，最适相对湿度为75％。温度高于30℃，湿度超过95％，则病情受 到抑制。根据白粉病流行的规律，尤其当高温干旱与高温高湿交替出现，又有大量白粉菌源 时很易流行的特点，人为通过人工气候室进行环境模拟，通过人为接种使黄瓜白粉病发生。
我们从2010年开始，每年秋季10至11月份在温室大棚中，人为接种白粉病，进行盆栽 黄瓜白粉病抑菌试验。
栽培的盆栽黄瓜长至5片叶时，进行接种。首先将冷藏在冰箱中的黄瓜白粉病病叶置于 无菌水中，轻微搅拌均匀，用手动微型喷雾器喷洒在黄瓜叶片上，控制条件，使其生长、发 育。
每个试验4盆一组，喷洒生防菌菌液后，用塑料布单独隔离，不设空白对照，只对照发 病轻重。在白粉病发病5天和13天分别调查2次，进行病情记录和统计分析，将抑菌效果好 的菌株排序，选择表现最好的前3株进行复筛，以便进行抑菌稳定性和适应性试验，为确定 工业化菌株奠定基础。
对黄瓜白粉病的抑制试验分两个方法，一是在没有发病时，也就是接种白粉病病原菌 3天后进行生防菌菌液喷布；二是在白粉病已经发病，且菌丝在黄瓜叶片能够用肉眼看到， 并发病均匀后进行菌液喷洒。目的是验证所筛选的生防菌是否具备预防和治疗双重作用。
②复筛：将筛选到的具有高效拮抗活性的芽孢杆菌菌株进行复筛，主要是经过耐温性、 耐酸碱性、耐药性试验，筛选到耐性较好的芽孢杆菌菌株，进行田间试验。
本发明人通过大量筛选工作得到一株能够高效防治多种植物病害的蕈状芽孢杆菌(B. mycoides)WWM09。实验证明，该蕈状芽孢杆菌原粉在防治黄瓜白粉病显示出非常高效 的防治效果，兼有预防和治疗作用，使得黄瓜增产显著。因而，本发明的蕈状芽孢杆菌是 具有广泛应用前景的蕈状芽孢杆菌新菌株，可以用于制备防治黄瓜白粉病的生物防治制 剂。
2、菌株鉴定
(1)微生物学特性：在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基或LB培养基上菌落形态为圆形或不 规则形，乳白偏黄色，表面粗糙起褶皱，在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基上，28℃下培养两天 后，镜检，菌体细胞呈杆状，能运动。经革兰氏染色呈阳性(以大肠杆菌为对照)。经芽孢 染色后观察芽孢呈椭圆形或柱状。
(2)分子生物学特性
该菌株的16s rRNA基因序列测定结果如下(SEQ-1)：
TACATGCAGTCGAGCGAATGGATTAAGAGCTTGCTCTTATTAAGTTAGCGGCGGACGG GTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCCATAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGG CTAATACCGGATAATATTTTGAACTGCATGGTTCGAAATTGAAAGGCGGCTTCGGCTGT CACTTATGGATGGACCCGGGTCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGG CAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGC CCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGAC GGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGCTTTCGGGTCGTAAAACTCTGTCGTTAGGG AAGAACAAGTGCTAGTTGAATAAGCTGGCACCTTGACGGTACCTACCAGAAAGCCAC GGCTAACTACCTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGAATT ATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGTGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGGCT CAACCGTGGAGGGTCATTGGAAACTGGGAGACTTGAGTGCAGAACAGGAAAGTGGA ATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATATGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGC GACTTTCTGGTCTGTAACTGACACTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATT AGATACCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGAGGGTTTCCGCC CTTTAGTGCTGAAGTTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCT GAAACTCAAAGCAATCGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTC GAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGCTCTTGACATCCTCTGAAAACCCTAGAGATAG GGCTTATACCTTCGGGAGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTC GTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCATCAT TAAGTTGCGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTTGGGATGAC GTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACGGTACA AAGAGCTGCAAGACCGCGAGGTGGAGCTAATCTCATAAAACCGTTCTCAGTTCGGAT TGTAGGCTGCAACGCGCCTACATGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATG CCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTT GTAACACCCGAAGTCGGTGGGGTAACCTTTTGGAGCCAGCCGCC
该菌株的ILVD基因序列测定结果如下(SEQ-2)：
TTTTTACGCTTATCTAATTCTTCATTACTCACTCTTACTTCTAGCAAGCGTTCTTCAACA TCAATACATACAATATCCCCTTGTTCAAGAAGTGCGATTGTTCCACCAGCTGCTGCTTC TGGTGAAATATGTCCTACTGAAATTCCACGTGAAGCTCCAGAGAAACGTCCATCCGTT AATAATGCAACCTCAGCACCTAATCCCATTCCAGCAATTGCTGATGTTGGTGCTAACAT TTCTGGCATACCAGGGCCACCTCTTGGTCCTGCATAACGAATGACAACTACATCTCCTT TTTTCACTTTCCCAAGCATAATGCCAGCAAGTGCCTCATCTTGTGAATTAAAAATAACG CAAGGTCCTTCAAAACGCTTTACCTCTGTTGCACCGCTTTTAATAACCGCTCCATCTTT CGCAAGGTTGCCCTTTAATATACGCAATCCTCCTTCCTCACTATGAGGGTTTTTAG
(3)细胞形态和理化实验结果
表1蕈状芽孢杆菌菌株WWM09的细胞形态和理化实验结果
实验项目 结果 实验项目 结果 革兰氏染色 阳性 碳水化合物产酸 + 细胞形状 杆状 葡萄糖 + 细胞直径﹥1μm + 木糖 - 形成芽孢 + L-阿拉伯糖 - 芽孢膨大 - 甘露醇 - 芽孢圆形 - 乳糖 - 伴孢晶体 - 水解明胶 + 接触酶 + 利用柠檬酸盐 + 氧化酶 + 50℃生长 - 厌氧生长 + pH5.7生长 + 淀粉水解 + 7％NaCl生长 - 分解酪素 + 硝酸盐还原 + MR试验 + VP试验 +
实施例2
1、蕈状芽孢杆菌菌株WWM09发酵过程
LB液体培养基配方为：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，蒸馏水1000mL， pH调至7.0-7.2。
大量固体发酵培养基配方(质量百分含量)：固料：质量比65％玉米面、20％豆粕和 15％麸皮组成；无机盐溶液：磷酸二氢钾2.7％，硫酸镁0.04％，硫酸铵3.5％，剩余为水； 固液比为1:2.0(质量比)。
蕈状芽孢杆菌菌株WWM09大量固体发酵过程：
①菌种种子液培养：将蕈状芽孢杆菌菌株WWM09从试管斜面中挑取少量细菌，移 至LB液体培养基中，30℃摇床振荡培养3～5d，此为种子液；
②固体生产菌种的培养：将种子液按10％的比例接种到固体培养基(500mL三角 瓶)中，30℃恒温培养3～5d，中间多次振荡；
③大量固体发酵：将②中固体培养的培养物用无菌水按1:15比例稀释，并用灭菌纱 布过滤，除去粗渣，即为生产菌液，接种比例按1:6接种于大量发酵培养基。将接种的原 料置于发酵室(30℃和相对湿度85％以上)中发酵培养5～6d，得到发酵液，干燥后可得 到蕈状芽孢杆菌菌株WWM09原粉，菌活为200-300亿/克。
④水剂：蕈状芽孢杆菌WWM09原粉(菌活200亿/克)4％、餐洗净3％、黄腐酸1％， 其余为水。菌活为8亿/mL。
实施例3田间防治试验：8亿/mL蕈状芽孢杆菌WWM09水剂防止黄瓜白粉病田间药效 1.试验目的
为了验证利用该菌株生产的8亿/mL蕈状芽孢杆菌WWM09水剂对黄瓜的白粉病防治效 果进行本试验。
2.试验方法：
2.1试验药剂：8亿/mL蕈状芽孢杆菌水剂(WWM09菌株，实施例2制备)
对照药剂：70％代森锰锌可湿性粉剂
2.2供试作物：黄瓜(津研一号)
供试对象：白粉病
2.3试验地点：重庆市璧山县新堰村
2.4试验基本情况：
试验地设在重庆市璧山县新堰村的蔬菜地内，该地常年栽种蔬菜，蔬菜病害(包括黄瓜 白粉病)发生普遍。土壤为灰棕紫泥土，试验时黄瓜为开花结果初期。
2.5试验设计：
本试验为完全随机区组，每处理设4个重复，5各处理共20个小区，每小区面积20平 方米。处理设置如下：
清水对照；
2.6施药方式、时间及气候情况：
施药时间为2014年7月4日，7月11日，7月18日。施药及施药后天气情况为：施药 当日无雨，其余以晴间阴、雨天气(雨水)。其中15日中雨，8、16、17日大雨。施药期间 最高温度为36.2℃，最低温度为22.7℃，相对湿度为62-92％。
处理方法是采用喷雾法，按方案量好处理用药，亩用清水50kg稀释，然后用PB-16手动 喷雾对黄瓜进行茎叶正反两面喷雾，对照喷清水。
2.7调查及计算方法：
2.7.1药效调查：采用定株调查法，每小区对角线5点取样，每点两株，每株上中下调查10 张叶片，共计调查10株100张叶片的发病情况，第一次施药前调查病情基数(7月5日)， 第二次施药前后7天(7月19日)、第三次施药后10天(7月29日)调查病情，根据以下分 级标准分别记录小区发病情况。
病叶分级标准：
0级：无病斑
1级：病斑面积占整个叶面积的5％以下；
3级：病斑面积占整个叶面积的6％-10％；
5及：病斑面积占整个叶面积的11％-20％；
7级：病斑面积占整个叶面积的21％-40％；
9级：病斑面积占整个叶面积的40％以上。
根据病情指数按下列指数公式计算出防治效果：
式中：CK0--空白对照区施药前病情指数；
CK1--空白对照区施药后病情指数；
Pt0--药剂处理区施药前病情指数；
Pt1--药剂处理区施药后病情指数。
3.结果与评价
结果如表2所示。8亿/mL蕈状芽孢杆菌WWM09水剂对黄瓜白粉病有较好的防治效果， 用量为300倍两次施药后校正防效达64.73％；用量为300-400倍三次施药后校正防效达 69.84％-81.71％，且用量为300倍时三次施药后校正防效好于对照处理药剂70％代森锰锌可湿 性粉剂400倍校正防效。经两年试验比较，两年中总体防效今年稍好于去年，但相差不大， 说明其防效相对稳定，且对植株表现安全。
表28亿/mL蕈状芽孢杆菌水剂防止黄瓜白粉病田间药效试验调查结果表
本发明本着经济高效原则，推荐用量为加水300-400倍稀释。可根据病情发展情况每隔 7-10天施药，连续施用2-3次。