技术领域
本发明涉及酵母菌和发酵豆乳加工领域，具体涉及一株产香酵母(PichiaamethioninaY)及其在发酵豆乳中的应用。
背景技术
大豆中富含蛋白质、不饱和脂肪酸、维生素、黄酮等成分，具有辅助降血脂、抑制肿瘤和阻止动脉硬化等作用。发酵豆乳不仅保留了大豆的营养功能成分，还具有发酵豆乳特有的发酵清香、醇香和酯香，发酵过程中产生的多种蛋白水解酶可使大豆蛋白水解为小分子肽和氨基酸，有利于人体的消化吸收并产生新的功能特性如降血压肽。国内酸豆乳的研究已有十余年时间，但还没有投入工业化生产，主要原因是缺少适合发酵豆乳生产的专用菌种，导致其风味与发酵牛乳相比仍存在明显的缺陷，其中比较突出的问题就是发酵豆乳中存在豆腥味。
豆腥味产生的主要原因是大豆种子中的脂肪氧化酶因为浸泡萌发而活化，并催化油脂产生氢过氧化物，再降解成小分子醇、醛、酮、酸和胺等腥味成分。目前去除豆腥味的方法主要有通过基因工程技术培育脂肪氧化酶缺失的大豆新品种，通过酸碱处理，添加还原剂、氧化剂来钝化脂肪氧化酶活性等物理化学方法，但这些方法有的存在一定的食品安全隐患，有的脱腥臭的效率不高；而采用微生物发酵法不仅可以去除其豆腥味，还可以提高其营养价值和保健功能，是目前的研究热点。因此，筛选出适合发酵豆乳生产的专用菌种，具有重要实际意义。
发明内容
本发明的目的在于根据现有技术中存在的问题，提供一种生长迅速，生长温域宽，培养条件简单，产香效率高的产香酵母(PichiaamethioninaY)。该产香酵母与乳酸菌XPL-1种子液接种到灭菌的豆浆中，进行发酵，获得一种新型的豆乳发酵剂，解决了发酵豆乳中豆腥味难以去除的问题，提高了发酵豆乳的风味特征。
本发明的另一个目的在于提供上述酵母(PichiaamethioninaY)在改善发酵豆乳风味中的一种应用。
本发明通过以下技术方案予以实现：
一种产香酵母，该产香酵母为阿米塞毕赤酵母(PichiaamethioninaY)菌株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地点为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏号为CGMCCNO.10183，保藏日期为2014年12月15日。
该酵母的26SrDNA序列为SEQ.ID.NO1。
一种所述产香酵母在发酵豆乳中的应用。
所述的产香酵母在发酵豆乳中的应用，该应用方法包括如下步骤：
(1)大豆浸泡、打浆、过滤、煮沸、添加蔗糖、灭菌，制备豆浆原液，每毫升豆浆中加入0.06-0.08克蔗糖；
(2)按豆浆体积计，接入5％-10％(v/v)的乳酸菌XPL-1种子液和5％-10％(v/v)的产香酵母种子液；
(3)在32-36℃保温培养8-16h，待发酵豆乳凝乳。
所述的灭菌方式为高压蒸汽灭菌，温度为100-115℃，时间为10-20min。
相对于现有技术，本发明具有的优点和有益效果：
(1)将乳酸菌XPL-1种子液与产香酵母(PichiaamethioninaY)种子液接种到灭菌的豆浆中，进行发酵，获得了一种新型的豆乳发酵剂，解决了发酵豆乳中豆腥味难以去除的问题，提高了发酵豆乳的风味特征。
(2)该菌株生长温域宽(图3)，其最适生长温度与乳酸菌XPL-1接近，便于选择合适的培养温度，使得乳酸菌和酵母均可稳定快速生长，以缩短培养周期，降低生产成本。
(3)该菌株产香及脱去豆腥味的效率高，培养条件简单，易于工业化生产，具有良好的开发应用前景。
附图表说明
图1a为本发明PichiaamethioninaY菌株的菌落形态图；
图1b为本发明PichiaamethioninaY菌株的菌体形态图；
图2为本发明PichiaamethioninaY菌株PCR产物电泳图；
图3为本发明PichiaamethioninaY菌株对温度适应性曲线示意图。
具体实施例
为了更好地阐述本发明，下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明，但实施例不构成对本发明保护范围的限定。
实施例中需要说明的是：
(1)对温度的适应性检测方法：取100mL三角瓶，加入50mL麦芽汁液体培养基，115℃灭菌15min，冷却后接种PichiaamethioninaY菌株，37℃培养过夜，作为种子培养液备用。在灭菌的麦芽汁液体培养基三角瓶中加入1mL种子培养物(发酵接种量为2％(v/v))，分别在22℃，27℃，32℃，37℃，42℃，47℃，52℃等温度下恒温培养，设置3组平行发酵，18h后，用紫外-可见分光光度计在600nm处测其OD值(见图3)。
(2)对pH、酸度和持水力的测定：分别采用pH计法、NaOH滴定法和离心法测定，其中持水力值越高，表示样品的持水能力越强。
(3)对发酵豆乳香气成分的测定与分析：采用固相微萃取及气质联用的分析方法。
①固相微萃取的条件：将首次使用的50/30μmDVB/CAR/PDMS固相微萃取头(固相微萃取装置为美国Supelco公司产品，型号为Supelco)在气相色谱进样口老化至无杂峰，在250℃下老化30min。吸取5mL样品放入15mL样品瓶中，在40℃加热平台上保持10min，将萃取头插入瓶中，磁力搅拌速度40r/min，40℃条件下萃取30min。
②GC-MS参数条件：色谱柱为DB-5MSUI毛细管色谱柱(60m×0.25mm，0.25μm)；气质联用仪为美国Agilent公司产品(Agilent6890/5975B)。进样口温度250℃，萃取头插入进样孔解吸3min；程序升温：始温35℃，保持3min，以3℃/min升至80℃，再以4℃/min升至120℃，再以10℃/min升至230℃，保持8min；载气(He)流速1.0mL/min，不分流。
(4)乳酸菌及酵母种子液的制备：
①乳酸菌XPL-1种子液：取100mL三角瓶，加入50ml的12％(w/v)牛奶培养基，60℃水浴30min后，115℃灭菌15min。按0.004g/100ml的比例接种XPL-1菌粉，37℃培养12h，作为种子培养液备用。
②产香酵母PichiaamethioninaY种子液：取100mL三角瓶，加入50mL麦芽汁液体培养基，115℃灭菌15min，接种PichiaamethioninaY菌株，36℃培养24h，作为母发酵剂。取100mL三角瓶，加入40ml的12％(w/v)牛奶培养基，60℃水浴30min后，115℃灭菌15min。按1/40(v/v)的比例将上述母发酵剂接入牛奶培养基中，36℃培养24h，作为种子培养液备用。
③葡萄酒活性干酵母VIC种子液：取100mL三角瓶，加入50ml的12％(w/v)牛奶培养基，60℃水浴30min后，115℃灭菌15min。按0.004g/100ml的比例接种葡萄酒活性干酵母菌粉，28℃培养24h，作为种子培养液备用。
(5)实施例中的w/v是指质量体积比，其中质量w单位为克；体积v的单位为毫升。v/v是指体积比。
实施例1菌株筛选
(1)使用无菌采样瓶，现场采样自然发酵而成的酸浆水，低温带回。立即使用无菌水分别稀释至10-3、10-4、10-5倍，涂布于麦芽汁琼脂培养基上。然后放入37℃的恒温培养箱中，培养48h。挑取疑似菌落，进行平板划线分离，如此重复4～5次，直至获得纯的单菌落。将纯化的单菌落用接种针接种于麦芽汁琼脂斜面培养基中，于4℃冰箱内保存。
(2)从自然发酵的酸浆水中分离出菌株Y，其在麦芽汁琼脂培养基上的菌落呈圆形、直径一般为3-5mm，乳白色、不透明状，湿润粘稠，易被挑起(图1a)；进行革兰氏染色和细胞形状观察，菌株Y的菌体呈圆柱形(图1b)。表明菌株Y为革兰氏阳性菌。
实施例2菌株鉴定
利用DNA提取试剂盒提取酵母DNA并进行琼脂糖凝胶电泳，然后设计酵母菌26SrDNA引物，进行PCR扩增，电泳图如图2所示，条带单一，条带大小在500bp左右。(1,2为酵母菌26SrDNA序列PCR扩增产物；M为10000bpMarker)。
将纯化回收的DNA片段进行测序，测序结果见SEQ.ID.NO1。然后利用BLAST软件与已报到的26SrDNA进行比对，比对结果显示该DNA序列与毕赤酵母属中的东方伊萨酵母(Issatchenkiaorientalis)、库德里阿兹威(氏)毕赤酵母(Pichiakudriavzevii)以及阿米塞毕赤酵母(Pichiaamethionina)等相似度达到99％以上。因此，进一步接种到YT鉴定板，28℃培养72h后，得到YTMicroPlate同化试验结果(表1a)和异化试验结果(表1b)，可知该菌株能同化环境中的右旋葡萄糖、D-木糖、D-葡萄糖酸、甘油等化合物，也能分解自身的右旋葡萄糖、α-酮戊二酸和琥珀酸等化合物来提供能量，应用Biolog自动微生物鉴定系统鉴定，得出最为可能的结果为阿米塞毕赤酵母(PichiaamethioninaY)。
该阿米塞毕赤酵母(PichiaamethioninaY)定义为一株产香酵母，2014年12月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地点为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏号为CGMCCNO.10183。
进一步检测该菌株对温度的适应性，结果见图3。由图3可知，菌株Y的最适生长温度为36℃，当培养温度低至26℃或高达42℃时，菌种仍能良好生长，说明该菌株生长温域宽，在实际应用中，便于选择合适的培养温度进行发酵，降低了生产成本。
实施例3菌株PichiaamethioninaY与乳酸菌XPL-1在32℃发酵豆乳的效果
(1)称取100g优质大豆浸泡、打浆、过滤、煮沸后量取400ml纯豆浆装入500ml锥形瓶中，添加8％(w/v)的蔗糖，100℃灭菌15min，待豆浆冷却至室温，接种5％(v/v)乳酸菌XPL-1种子液和10％(v/v)PichiaamethioninaY种子液。32℃发酵16h，所得的发酵豆乳用Y32表示。
(2)经测定，Y32的酸度为81.62°T，持水力为86.48％，经GC-MS共检测到21种挥发性风味物质(表2,发酵豆乳香气成分的分析结果)，主要由醇类、酯类和烯烃组成；其中醇类8种，相对含量为52.38％，酯类11种，相对含量为18.88％，烯烃2种，相对含量为0.43％。该发酵豆乳呈现出非常浓郁的发酵香.气、清甜香和适度的酒精风味。
由表2可知，由乳酸菌XPL-1单独发酵制得的发酵豆乳未检测到酯类；由葡萄酒活性干酵母VIC与乳酸菌XPL-1发酵制备的豆乳检测到6种酯类香气成分，含量仅为10.27％。由此可见，本实施例的产香效率更高。
实施例4菌株PichiaamethioninaY与乳酸菌XPL-1在36℃发酵豆乳的效果
(1)称取100g优质大豆浸泡、打浆、过滤、煮沸后量取400ml纯豆浆装入500ml锥形瓶中，添加6％(w/v)的蔗糖，100℃灭菌15min，待豆浆冷却至室温，再接种10％(v/v)乳酸菌XPL-1种子液和5％(v/v)PichiaamethioninaY种子液。36℃发酵12h，所得的发酵豆乳用Y36表示。
(2)经测定，Y36的酸度为73.89°T，持水力为89.17％，经GC-MS共检测出21种挥发性风味物质(表2)，主要由醇和酯类物质组成，醇类物质有11种，相对含量为43.87％，酯类物质有8种，相对含量为23.62％，其他物质有3种，相对含量为1.05％。
与Y32相比，Y36中酯类香气成分含量由18.88％升高至23.62％，乙醇含量由37.84％降低至22.39％，酸度由81.62°T降低至73.89°T，持水力由86.48％升高至89.97％。可知，Y36香气更加浓郁，酒精风味和酸度适中，持水能力更强。可知，本发明PichiaamethioninaY菌株更适合在相对较高的温度下与乳酸菌XPL-1混合发酵豆乳。
实施例5(对比实施例)乳酸菌XPL-1单独发酵豆乳的效果
(1)称取100g优质大豆浸泡、打浆、过滤、煮沸后量取400ml纯豆浆装入500ml锥形瓶中，添加8％(w/v)的蔗糖，100℃灭菌15min，待豆浆冷却至室温，再接种5％(v/v)乳酸菌XPL-1种子液。32℃发酵16h，所得的发酵豆乳用XPL-1表示。
(2)经测定，XPL-1的酸度为63.85°T，持水力为85.73％，经GC-MS共检测出10种挥发性风味物质(表2)，主要由醇类、烯烃和呋喃组成。其中醇类8种，相对含量为60.87％；烯烃1种，相对.含量为0.35％；呋喃1种，相对含量为2.67％。其中，正己醇、1-辛.烯-3-醇和2-戊基呋喃的相对含量较高，它们占总香气成分的50.85％，这些醇和呋喃物质呈浓郁的大豆青腥气。
直接由大豆打浆制备的新鲜豆浆中醛、醇类物质含量非常高(表2)，其中相对含量较高的有正己醛(35.36％)、正己醇(6.788％)、1-辛烯-3-醇(11.33％)和2-戊基呋喃(4.868％)，呈现很强烈的豆腥味。而XPL-1中正己醇(7.137％)、1-辛烯-3-醇(11.02％)和2-戊基呋喃(2.672％)的相对含量基本未变。相比之下，Y32和Y36中醛、醇、呋喃类物质明显减少，酯类物质含量增加，其中，正己醇和1-辛烯-3-醇的含量降低至3％以下，且未检出正己醛和2-戊基呋喃，可证明，本发明PichiaamethioninaY菌株发酵豆乳能有效去除其豆腥味。
实施例6(对比实施例)葡萄酒活性干酵母VIC与乳酸菌XPL-1发酵豆乳的效果
(1)称取100g优质大豆浸泡、打浆、过滤、煮沸后量取400ml纯豆浆装入500ml锥形瓶中，添加8％(w/v)的蔗糖，100℃灭菌15min，待豆浆冷却至室温，接种5％(v/v)乳酸菌XPL-1种子液和10％(v/v)葡萄酒活性干酵母VIC种子液。32℃发酵16h，所得的发酵豆乳用VIC表示。
(2)经测定，VIC的酸度为84.01°T，持水力为81.50％，经GC-MS共检测到18种挥发性风味物质(表2)，主要由醇类、酯类、烯烃、有机酸和呋喃组成。其中醇类8种，相对含量为59.55％；酯类6种，相对含量为10.27％；烯烃类2种，相对含量为0.56％；有机酸1种，相对含量为0.27％；呋喃1种，相对含量为0.41％。它们呈现发酵豆乳发酵清甜香、脂香，但带有明显的酸味、豆腥味和较强烈的酒精风味。
32℃下分别增加葡萄酒活性干酵母VIC和PichiaamethioninaY制得的发酵豆乳VIC和Y32的.香气主要由果香、清甜香和脂香构成，它们的香气构成成分、数量和相互比例不同，因此呈现的发酵香气强度不同。VIC中酯类只有6种，相对含量为10.27％，且含有有机酸、呋喃等物质，因此其清甜香淡薄，发酵香气较弱；Y32中酯类有11种，相对含量为19.88％，且具有较协调的香气种类量比，因此具有浓郁的清甜香，香气质量最佳。可证明，在相同条件下，本发明PichiaamethioninaY菌株在发酵豆乳中的产香效率更高。