技术领域
本发明属于生物技术领域，具体而言，本发明涉及用于PCR-悬浮芯片 方法检测油料的组合物及试剂盒，检测油料的PCR-悬浮芯片方法及其在检 测油料中的应用。
背景技术
目前全球食用油消费主要以植物油为主，近十年基本保持5％左右的年需 求及消费增幅。我国是世界第二大食用油消费国，也是世界油料生产大国。 食用油品种丰富，因油料和加工工艺的不同而分为20多个品种，主要包括大 豆油、花生油、葵花籽油、芝麻油、菜籽油、棕榈油等普通食用油和山茶油、 橄榄油、红花油、葡萄籽油等高档食用油。随着食用植物油的消费需求日趋 多样化、细分化和高档化，要求政府部门加大对食用油市场的规范和管理力 度，以保障消费者利益，促进食用油产业的健康发展。目前食用油标准未对 消费者十分关心的一些质量指标和检测方法进行说明。其中，食用油品种标 识真实性问题在高端食用油产品中尤为突出。
植物性油料作物品种繁多，加工强度大且步骤多，质量问题错综复杂， 决定了食用油检测具有较大的技术难度。目前，分子生物学检测手段(例如， 普通PCR法、多重PCR法、多重实时荧光PCR法以及芯片检测方法等)在食 用油料的检测中具有较为广泛的应用，但尚存在一定的缺陷。常用的普通PCR 法一次实验只能检测一种成分，且易产生假阴性及交叉污染现象。多重PCR 法一次实验检测到的成分通常小于五种，而且由于需要将多对引物混合，容 易出现相互干扰，影响判断。多重实时荧光PCR受到荧光数量的限制，荧光 之间存在干扰。芯片检测方法需要对每种目标成分均设计其特异的引物，操 作比较繁琐。传统的探针杂交技术因需要多次洗涤步骤，分析结果容易受本 底影响，且因对分子集合的光学信号进行检测，不进行统计，结果的可靠性 低。
因此，寻求简便、准确、高效、可靠的分子生物学检测方法成为该领域 的研究热点。
PCR-悬浮芯片技术是分子生物学技术领域新兴的一种检测技术，该技 术是将PCR和悬浮芯片系统结合使用，首先对样品中的靶基因进行PCR扩增， 然后通过液相杂交将偶联有探针的微球与样品中的靶基因序列结合，通过流 式细胞技术和酶标检测技术的整合对样品中的多种目标成分进行同时检测。 其中，悬浮芯片系统的核心技术是“多功能多指标同步分析体系”(Flexible Multiple Analyte Profiling，简称xMap)技术，其使用特制的100种不同色标编 码的5.5um高分子材料微球。每一种编码的微球标记一种可以捕获相应目标 分子的探针，任选几种或多至100种标记好的微球混合后与样品中待检测目标 分子作用，然后在液流带动下逐个通过一个微细石英管，两束不同波长激光 对每个微球进行检测，一束激光检测微球的色标编码从而区分微球种类并进 而确定检测的是何种分子，另一束激光检测与探针结合的目标分子上的荧光 标记进行定量，通过计算机分析和标准曲线拟合，直接给出每一种目标分子 的分子量。
PCR-悬浮芯片技术具有如下独特优点：
(1)、高通量，目前供悬浮芯片技术使用的微球有100种，可以同时对于 同一样品中的多种不同目标分子进行定性和定量分析。
(2)、重复性好，不同种类微球分别标记后混合，再分装成小份，用于 分别检测各样品，各小份的性质完全一致。
(3)、灵敏度高，悬浮芯片系统使用微球作为反应载体，增加了反应物 接触面积，每个微球表面带有100种不同色标，以共价键偶联寡核苷酸探针， 探针密度高，产生的信号强，使用荧光检测，放大了反应信号，灵敏度大大 提高。
(4)、快速，在1小时内可完成对PCR产物的检测。
(5)、可靠性高，本技术对多个微球荧光信号进行单独检测后，用配套 的软件进行统计分析，使检测结果更加准确可靠。
目前，尚无使用PCR-悬浮芯片技术检测油料的报道。
发明内容
本发明的一个目的在于，提供用于PCR-悬浮芯片方法检测油料的组合 物。
本发明的另一个目的在于，提供用于PCR-悬浮芯片方法检测油料的 试剂盒。
本发明的再一个目的在于，提供用于检测油料的PCR-悬浮芯片方法。
本发明的再一个目的在于，提供PCR-悬浮芯片方法在检测油料中的 应用。
针对上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明的发明人针对植物性油料作物的叶绿体rbcL基因设计了用于检测 油料的通用引物和特异性寡核苷酸探针。
一方面，本发明提供了一种用于PCR-悬浮芯片方法检测油料的组合物， 所述组合物包含1对通用引物对和7条探针，所述通用引物由上游引物和下游 引物组成，所述上游引物的核苷酸序列为SEQ ID No.1所示，所述下游引物 的核苷酸序列为SEQ ID No.2所示，所述探针的核苷酸序列为SEQ ID No.3-9 所示，其中，所述下游引物的5’端标记有生物素，所述探针的5’端连接有20 个用氨基修饰的T碱基。
具体地，上述引物和探针的核苷酸序列分别为：
SEQ ID No.1(上游引物)：5’TTGGCAGCATTCCGAGTAAC 3’；
SEQ ID No.2(下游引物)：5’AGTAAACATGTTAGTAACAG 3’；
SEQ ID No.3(橄榄探针)：5’CCATATTGAGCCCGTTCCTG 3’；
SEQ ID No.4(花生探针)：5’CCGGTTGCTGGCGAAGAAAA 3’；
SEQ ID No.5(菜籽探针)：5’CCAGGAGAAGAAACTCAATT 3’；
SEQ ID No.6(芝麻探针)：5’CCGGTTCCTGGAGAAACAGA 3’；
SEQ ID No.7(大豆探针)：5’CCTGTTGCTGGGGAAGAAAA 3’；
SEQ ID No.8(葵花籽探针)：5’TGGACTTGAGCCTGTTCCTG 3’；
SEQ ID No.9(玉米探针)：5’CCCGTTCCTGGGGACCCAGA 3’。
另一方面，本发明提供了一种用于PCR-悬浮芯片方法检测油料的试剂 盒，其中，所述试剂盒包含本发明所述的组合物。
根据本发明所述的试剂盒，其中，所述试剂盒还包含使用说明书，所 述说明书中给出的PCR扩增条件是：95℃预变性10min；95℃30s，60℃ 30s，72℃30s，共35个循环；72℃延伸5min；4℃保存；所述说明书给出 的杂交条件是95℃变性5min，60℃杂交15min。
根据本发明所述的试剂盒，其中，所述试剂盒还包含作为标准品的目标 油料的DNA和作为阴性对照的无菌双蒸水。
根据本发明所述的试剂盒，其中，所述试剂盒还包含用于样品DNA提 取的试剂和用于PCR扩增反应的试剂。
再一方面，本发明提供了一种检测油料的PCR-悬浮芯片方法，其中， 所述方法包括使用本发明所述的组合物或试剂盒。
根据本发明所述的方法，其中，所述方法还包括使用本发明所述的引物 进行PCR扩增及使用本发明所述的探针进行杂交的步骤。
根据本发明所述的方法，其中，所述PCR扩增条件为：95℃预变性10 min；95℃30s，60℃30s，72℃30s，共35个循环；72℃延伸5min；4℃ 保存。
根据本发明所述的方法，其中，所述杂交条件为：95℃变性5min，60 ℃杂交15min。
根据本发明所述的方法，其具体包括如下步骤：
(1)、提取待检测样品的DNA模板；
(2)、对于本发明所述下游引物5’端进行生物素标记；
(3)、使用本发明所述上游引物和所述步骤(2)获得的标记有生物素的 下游引物对于所述步骤(1)获得的DNA模板进行PCR扩增；
(4)、对于本发明所述探针的5’端连接20个用氨基修饰的T碱基；
(5)、将所述步骤(4)获得的探针与微球进行偶联；
(6)、将所述步骤(5)获得的偶联于微球的探针与所述步骤(3)获得 的PCR扩增产物进行杂交；
(7)、采用xMap技术对于目标成分的DNA进行定性与定量。
根据上述方法，其中，所述步骤(5)中探针与微球的偶联是通过如下操 作进行的：在涡旋仪上重悬微球，取50μL(6.25×105个)微球到1.5mL离 心管中，10000×g离心2min，弃上清，用50μL 0.1M MES缓冲液(pH4.5) 重悬微球，彻底涡旋使微球分散，加入0.05nmol探针。加入2.5uL新鲜制备 的EDC溶液(10mg/mL)至微球中，充分混匀，室温避光孵育30min，再重 复一次该步操作。分别用1mL 0.02％Tween-20和1mL 0.1％SDS各洗涤(15000 ×g离心1min)一次，最后用75μL TE缓冲液重悬微球，4℃避光保存。
还一方面，本发明提供了PCR-悬浮芯片方法在检测油料中的应用。
优选地，根据本发明所述的应用，其中使用了本发明所述的组合物或试 剂盒。
优选地，根据本发明所述的应用，其中，所述油料为橄榄、花生、菜籽、 芝麻、大豆、葵花籽以及玉米。
本发明的PCR-悬浮芯片技术针对叶绿体rbcL基因片段设计1对通用 引物和7条寡核苷酸探针，通过PCR扩增目标DNA片段，然后将偶联有7 条寡核苷酸探针的微球与扩增产物进行杂交，用悬浮芯片系统进行检测，可 以在一次实验中对样品中包含的7种不同油料成分进行快速检测。本发明建 立的PCR-悬浮芯片技术除了具有高通量、重复性好、灵敏度高、快速以及 可靠性高等优点外，由于只用1对通用引物，有助于检测样品中的其他未知 植物性油料成分，可以很容易地通过设计更多的探针来进一步拓宽应用范围。
附图说明
图1是使用本发明设计的通用引物对各样品DNA模板的PCR扩增产物的 琼脂糖凝胶电泳图。M为分子量标准，1-19分别为如下油料的PCR扩增产物： 1：玉米；2：油菜籽；3：大豆；4：油橄榄；5：花生；6：油葵花籽；7：芝 麻；8：普通葵花籽；9：棉籽；10：松籽；11：腰果；12：小麦；13：大米； 14：芥末；15：芹菜；16；山茶；17：猪；18：羊；19：空白。
具体实施方式
下面通过实施例的方式对本发明作进一步的说明，但是本发明并不仅 仅局限于以下实施例。
本发明所使用的术语“油料”是指油脂制作工业中使用的植物性原料。
本发明的PCR-悬浮芯片技术针对叶绿体rbcL基因设计了1对通用引物 和7条特异性寡核苷酸探针。该技术可鉴定如下七种食用油料：橄榄、花生、 菜籽、芝麻、大豆、葵花籽以及玉米。
本领域技术人员应该知道，本发明的PCR-悬浮芯片技术不仅限于检测 食用油中的油料成分，对于所有涉及到应用植物性油料的领域(例如生物柴 油)中均可以使用。
实验仪器与试剂
本发明所使用的主要检测仪器如下：
微量移液器(10μL、100μL、1000μL，Eppendorf，德国)、PCR仪(Eppendorf， 德国)、高速台式离心机(Pico17型，Thermo，德国)、高速粉碎机 (IKA-WEARKE，德国)、悬浮芯片系统(2100型，Biorad，美国)。
本发明所使用的主要检测试剂如下：
氯仿、异丙醇分别购于北京六合通公司；DNA提取试剂盒购自美国Promega；Taqman聚合酶试剂Hotstar购自德国Qiagen；本发明所设 计的通用引物对(包括SEQ ID No.1所示的上游引物和SEQ ID No.2所示的下 游引物，其中下游引物标记有生物素)和7条寡核苷酸探针(其核苷酸序列示 于SEQ ID No.3-SEQ ID No.9，这些探针的5’端连接有20个用氨基修饰的T碱 基)由北京英俊生物科技有限公司合成。
实施例
本实施例通过如下试验对本发明的PCR-悬浮芯片技术的特异性、灵敏 度、重复性以及实际检测效果进行了验证。
检测步骤如下：
1、样品DNA模板提取：
(1)分别对于目标检测油料油橄榄叶、大豆、玉米、花生、芝麻、菜 籽、普通葵花籽以及油葵花籽进行DNA模板提取，同时对于其他参照物棉 籽、松籽、腰果、小麦、大米、芥末、芹菜、山茶、羊、猪以及空白对照(无 菌水)进行DNA模板提取。具体地，取200mg各样品，用高速粉碎机磨成 粉末，采用DNA提取试剂盒参照制造商的说明书提取DNA。
(2)将上述提取的油料DNA模板原液分别用无菌水分别稀释至 10ng/μl、1ng/μl、0.1ng/μl、10pg/ul、1pg/ul、0.1pg/ul以及0.01pg/ul，用于分 析本发明PCR-悬浮芯片技术的绝对灵敏度。
(3)将上述提取的油料(油橄榄、玉米、油葵花籽、大豆、玉米、大 豆、芝麻以及花生)DNA模板原液分别用无菌水稀释至10ng/μl，并将油橄 榄与玉米、油葵花籽与大豆、玉米与大豆、芝麻与花生DNA模板分别按照 一定的体积比进行配比来制备相应混合物(其中，油橄榄与玉米的DNA模 板混合物为按油橄榄的体积比分别为100％、90％、70％、50％、30％以及0％； 油葵花籽与大豆的DNA模板混合物为按油葵花籽的体积比分别为100％、 90％、70％、50％、30％以及0％；玉米与大豆的DNA模板混合物为按玉米 的体积比分别为100％、90％、70％、50％、30％以及0％；芝麻与花生的DNA 模板混合物为按芝麻的体积比分别为100％、90％、70％、50％、30％以及0％)， 用于分析本发明PCR-悬浮芯片技术的相对灵敏度。
(4)将上述提取的油料(油橄榄、玉米、油葵花籽、大豆、玉米、大 豆、芝麻以及花生)DNA模板原液分别用无菌水稀释至10ng/μl，并分别取 三份进行重复实验，以验证本发明PCR-悬浮芯片技术的稳定性。
(5)对于本实验室制备的7份食用油标准样品(分别为葵花籽油、花生 油、橄榄油、大豆油、芝麻油、菜籽油、玉米油)分别使用DNA提取试剂 盒提取DNA模板，用于分析本发明的PCR-悬浮芯片技术的实际检测效果。
2、PCR扩增：
(1)、PCR扩增体系：总体积为25ul，其中包含：1×Multi HotStart Buffer (不含Mg2+)，1.5mM MgCl2，200nM dNTP混合物，上、下游引物各200nM (其中下游引物5’端用生物素标记)，1U Multi HotStart DNA聚合酶，50ng 的DNA模板，用灭菌的双蒸水补足体积至25ul。
(2)、PCR扩增参数：95℃预变性10min；95℃30s，60℃30s，72℃30s， 共35个循环；72℃延伸5min；4℃保存。
3、PCR扩增产物分析：
PCR扩增产物使用2％的琼脂糖凝胶电泳进行检测。
4、将连接有20个用氨基修饰的T碱基的探针与微球进行偶联，具体操 作如下进行：在涡旋仪上重悬微球，取50μL(6.25×105个)微球到1.5mL 离心管中，10000×g离心2min，弃上清，用50μL 0.1M MES缓冲液(pH4.5) 重悬微球，彻底涡旋使微球分散，加入0.05nmol探针。加入2.5uL新鲜制备 的EDC溶液(10mg/mL)至微球中，充分混匀，室温避光孵育30min，再重 复一次该步操作。分别用1mL 0.02％Tween-20和1mL 0.1％SDS各洗涤(15000 ×g离心1min)一次，最后用75μL TE缓冲液重悬微球，4℃避光保存。
5、对于上述偶联于微球的探针与上述获得的PCR扩增产物进行杂交， 杂交反应条件为：95℃变性5min，60℃杂交15min。
6、采用xMap技术对于目标成分的DNA进行定性与定量：将杂交产物 转到无菌抽滤板中，抽干，同时记录杂交体系对应孔位置。将SA-PE用1× TE稀释到4ng/ul，每孔加入50ul，先1100rpm避光震荡2min，然后450rpm 室温孵育5min；抽干抽滤板，然后用100ul TE洗三次，最后用100ul TE进 行重悬。将抽滤板置入仪器进行读数。
实验结果分别示于表1-5和图1。
如图1所示，油橄榄、大豆、玉米、花生、芝麻、菜籽、葵花籽(普通 葵花籽以及油葵花籽)7种油料通过扩增均得到与预期片段长度吻合(246bp) 的产物。除此之外，棉籽、松籽、腰果、小麦、大米、芥末、芹菜、山茶样 品也扩增得到目的片段。而羊、猪、空白对照均未扩增到246bp的产物。
本发明的PCR-悬浮芯片技术对于7种油料检测的特异性结果示于下 表1中。
表1：本发明的PCR-悬浮芯片技术对于7种油料检测的特异性结果
a：MFI-Bkgd表示样品的荧光值MFI扣除掉本底的荧光值
采用悬浮芯片技术，将7条探针偶联到微球后用微球混合物对19个样品 (油橄榄叶、大豆、玉米、花生、芝麻、菜籽、普通葵花籽、油葵花籽、棉 籽、松籽、腰果、小麦、大米、芥末、芹菜、山茶、羊、猪以及空白对照) 进行检测。如表1所示，7种油料成分均产生较强的荧光信号，油橄榄、大 豆、玉米、花生、葵花籽、菜籽、芝麻分别为813、1095、1091、2301、2894.5 和1818(油葵花籽和普通葵花籽)、1573、1323。对应的空白对照信号分别 为8、10、6、5、9、10、10。对应的阴性样品最高信号值分别为102(玉米)、 65(玉米)、10(菜籽)、17(腰果)、50(小麦)、50(芥末)、7(菜籽)。检 测过程中需要注意的是，阳性信号的判定标准既要避免假阳性，即要完全排 除阴性样品，又不能将标准设置太高而影响检测灵敏度。本发明对每个探针 分别设立如下阈值：1)花生：高于4倍空白信号；2)菜籽：高于8倍空白 信号；3)芝麻：高于2倍空白信号；4)玉米：高于3倍空白信号；5)葵花 籽：高于8倍空白信号；6)大豆：高于2倍空白信号及高于2倍玉米DNA 信号；7)橄榄：高于10倍空白信号及高于2倍玉米DNA信号。根据上述 判定标准，本方法对7种目标油料成分具有很好的特异性。
本领域技术人员应该知道的是，所述阈值的设立是基于以下考虑：1)目 前在涉及核酸杂交的检测方法的阈值设立方面没有统一固定的数学模式可以 参考；2)文献报道的方法主要根据实验者经验性判断，在综合考虑方法特异 性和灵敏度的前提下设定阈值；3)目前，在关于悬浮芯片方法的文献报道中， 空白对照值的2倍是较为常见的设定方法，但这些报道大多针对每种成分设 计特异性引物，而本方法采用通用引物对大范围的油料成分进行扩增，需要 适当提高阈值；4)根据实验的结果，保证阈值大于阴性样品的最高值，同时 兼顾灵敏度达到检测需求；5)在实际应用中，随着阴性样品种类的增加，可 以根据是否出现假阳性适当调整阈值。
本发明的PCR-悬浮芯片技术对于7种油料检测的绝对灵敏度结果示于 下表2中，阳性信号判定标准同上文所述。
表2：本发明的PCR-悬浮芯片技术对7种油料的绝对灵敏度检测结果
如表2所示，按照上文所述的判定标准，除了油橄榄，其余油料的检测 灵敏度均达到1pg/μl，油橄榄检测灵敏度为10pg/μl，证实该方法的灵敏度 很好。
本发明的PCR-悬浮芯片技术对于7种油料检测的相对灵敏度结果示于 下表3中，阳性信号判定标准同上文所述。
表3：本发明的PCR-悬浮芯片技术对混合油料的相对灵敏度检测结果
如表3所示，各混合油料中的油料成分都在最低比例限(30％)检测到 阳性信号，证实本发明的PCR-悬浮芯片方法的灵敏度很好，能够对于不同 油料混合物中不同成分进行检测。
验证本发明PCR-悬浮芯片技术的稳定性的实验结果示于下表4中。
表4：本发明PCR-悬浮芯片技术对于7种油料检测的3次重复实验结果
如表4所示，使用本发明PCR-悬浮芯片技术对于7种油料检测进行了 3次重复实验，结果发现变异系数均低于10％，达到目前悬浮芯片法通常的 变异系数要求，表明本发明的PCR-悬浮芯片方法具有良好的稳定性。
本发明的PCR-悬浮芯片技术对于本实验室的7份食用油标准样品的实 际检测效果示于下表5。
表5：本发明PCR-悬浮芯片技术对于7份食用油标准样品的检测结果
如表5所示，采用本发明的PCR-悬浮芯片技术对本实验室制备的7份 食用油标准样品进行检测，所有样品都检测到相应的油料成分，而未检测到 其他成分，表明本发明的PCR-悬浮芯片法对于油料的检测效果良好。
虽然已经对本发明的具体实施方式进行了描述，但是本领域技术人员应 认识到，在不偏离本发明的范围或精神的前提下可以对本发明进行多种改变 与修饰。因而，本发明意欲涵盖落在权利要求书及其同等物范围内的所有这 些改变与修饰。