技术领域
本发明涉及生物技术和分析技术领域，具体的说是一种基于冰核蛋白 的木糖脱氢酶细菌表面展示系统及其在木糖快速检测中的应用。
背景技术
木糖是一种重要的碳水化合物，在人们的生产生活中具有非常重要的 作用。在自然界中，天然D-木糖是以多糖的形态存在于植物中，它们在农 产品的废弃部分中(例如玉米的穗轴、秸秆、棉桃的外皮)含量很高，木 糖是其自然降解和人为降解中的重要产物。利用木糖发酵生产乙醇可以提 高原料的利用率和燃料乙醇的产量，降低燃料乙醇的生产成本，因此目前 已经受到越来越多的关注。在细菌中有的能利用D-木糖作为碳源生长，在 动物中羊几乎能完全地利用木糖。在动物的蛋白多糖中D-木糖与多肽链的 丝氨酸残基以糖苷键连接，成为多糖侧链与蛋白质的桥接结构。木糖醇是 木糖通过加氢制得的，其用途非常广泛。在发达国家木糖已应用于宠物饲 料。木糖可以作为糖尿病人的耐受性好的无热量甜味剂、营养剂和治疗剂。 它还可以作为加热食品增香剂，用于焙烤食品、火腿、香肠、腊肉、人造 肉等。木糖还被广泛应用于肉食加工、肉类香料以及制备食品抗氧剂等方 面。另外，木糖已作为软化剂、离子表面活性剂、增塑剂、水分调节剂等 用于油漆、牙膏、卷烟、制革、铸造、火药等多种行业。因此，快速、高 灵敏度、高选择性、实时的木糖检测对遗传、人类营养、食品技术、医药 以及包括生物燃料在内的生物过程等领域极其重要。
目前，木糖的检测方法有还原法、酶学方法、色谱法、拉曼光谱法和 红外光谱法等。但是这些方法存在各种各样的问题，例如，采用还原法检 测时，其灵敏度较低，而且易受到其他有颜色和还原性物质的干扰；在酶 学方法中，酶的来源和纯化是个至关重要的问题；色谱法包括气相色谱法、 液相色谱法和离子色谱法，存在的主要问题是样品制备过程复杂、操作费 时、误差较大、需要昂贵设备等。因此，建立一种快速、灵敏、特异的木 糖实时检测方法，势在必行。
酶学方法的优点是灵敏度高、特异性好，但是酶的纯化和稳定性是难 以解决的问题。木糖脱氢酶(XDH)(EC 1.1.1.175)是一些微生物中木糖代 谢途径的关键酶。木糖在木糖脱氢酶的催化下，借助于辅酶NAD+，被氧化 成木糖酸内酯，辅酶NAD+则被还原为NADH。
细菌表面呈现系统是微生物表面呈现系统的一个重要分支，其基本策 略也是将外源蛋白或多肽与细菌表面蛋白融合或嵌合并活性表达于细菌表 面。自从发现大肠杆菌外膜蛋白LamB、OmpA和PhoE能够作为外源蛋白的 表面呈现载体以来，该技术得到了迅猛发展，现已成为研究的热点，在微 生物学、分子生物学、疫苗学等多个领域的基础和应用研究中得到了广泛 应用。冰核蛋白(ice-nucleation protein，INP))是丁香假单胞菌等菌 株的外膜蛋白，可加速纯水的冰晶形成。INP通过糖基磷脂酰肌醇而锚定 在细菌表面，利于大分子蛋白的表面呈现。冰核蛋白细菌包括假单胞菌属、 欧文氏菌属和黄单胞菌等。目前，利用全长的冰核蛋白、去掉中间重复序 列的串连N端、C端结构域的蛋白或只用N端结构域的蛋白均在大肠杆菌表 面成功展示了外源蛋白，例如：绿色荧光蛋白、几丁质酶和磷酸盐结合蛋 白等。近年来，在Pseudomonas borealis菌株中发现一种新的冰核蛋白基 因inaPb，它与已熟知的冰核蛋白只有～66％的同源性。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于冰核蛋白的细菌表面展示系统及其在木 糖检测中的应用。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种基于冰核蛋白的木糖脱氢酶细菌表面展示系统：细菌表面展示系 统为编码目标蛋白木糖脱氢酶的基因序列xylB和负责跨膜定位和转运的冰 核蛋白N端结构域的基因序列inaPb-N。
编码目标蛋白木糖脱氢酶的基因序列xylB和负责跨膜定位和转运的冰 核蛋白N端结构域的基因序列inaPb-N融合，表达于宿主细胞表面，得到 基于冰核蛋白的木糖脱氢酶细菌表面展示系统。
基于冰核蛋白的木糖脱氢酶细菌表面展示系统的应用：所述细菌表面 展示系统用于木糖的高特异性、高灵敏度检测。所述细菌表面展示系统用 于D-木糖的高特异性、高灵敏度检测。
检测原理是木糖在菌体表面的木糖脱氢酶的催化下，借助于辅酶烟酰 胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)被氧化成木糖酸内酯，辅酶NAD+则被还原为还原 态的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)。NADH在340nm处有特征吸收峰，因 此可以根据340nm处的吸光值来求得木糖的含量。
本发明的效果是：
1.本发明利用冰核蛋白表面展示系统将木糖脱氢酶稳定地展示在细菌 的表面，从而解决了胞内酶提取过程复杂和稳定性低的难题。
2.本发明细菌表面展示的木糖脱氢酶酶活高，与原始菌株中胞内的木 糖脱氢酶相比，稳定性好。
3.本发明细菌表面展示的木糖脱氢酶特异性好，其他糖类，如D-葡萄 糖、纤维二糖、D-半乳糖、D-甘露糖、D-核糖、D-果糖、D-蔗糖、D-木糖 醇、D-麦芽糖和L-阿拉伯糖对D-木糖的测定均无干扰。
4.本发明构建的基于冰核蛋白的木糖脱氢酶细菌表面展示系统灵敏度 高，具有较宽的木糖检测范围(5-900μM)和较低的检测限(2μM)。
5.本发明构建的木糖脱氢酶展示菌株可以固定在电极上，构建电化学 生物传感器，实现木糖的检测，而且此菌体可以重复多次使用，稳定性好。
6.本发明构建的木糖脱氢酶展示菌株可开发成一种生物催化剂，用于 生物燃料电池等领域。
7.通过本发明提供的细菌表面展示系统建立了木糖快速检测的方法。 此方法灵敏度高、特异性好、操作简单、成本低，可用于食品、果蔬、糖 酒饮料、肉食、食品添加剂、保健品、医药，和化妆品、牙膏、卷烟等工 业领域，以及发酵、生物转化、生物能源等生物过程领域中木糖的监测。
附图说明
图1为本发明实施例提供的木糖脱氢酶基因xdh的PCR产物胶回收图。 A是DL2000分子量标准；B是基因xdh的PCR产物胶回收条带。
图2为本发明实施例提供的木糖脱氢酶基因inaPb-N的PCR产物胶回 收图。A是DL2000分子量标准；B是基因inaPb-N的PCR产物胶回收条带。
图3为本发明实施例提供的木糖脱氢酶细菌表面展示系统的载体构建 流程图。
图4为本发明实施例提供的紫外分光光度计检测D-木糖的标准曲线 图。
本发明目的、功能及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。
具体实施方式
本发明构建基于木糖脱氢酶细菌表面展示系统，利用紫外分光光度计 检测信号，从而得到木糖的含量，进而用于木糖的快速检测，具体为：
1.构建基于冰核蛋白的木糖脱氢酶细菌表面展示系统；
2.制作木糖检测的标准曲线；
3.测定实际样品中的木糖，根据标准曲线计算得出木糖的含量。
实施例1
细胞表面展示木糖脱氢酶菌体的获得：
1.培养木糖脱氢酶的新月柄杆菌株(Caulobacter crescentus NA1000) (市购产品)：将上述菌株接种于培养基中置30℃，200rpm，摇床培养24 小时。
培养基成分：植物蛋白胨5.0g，酵母提取物2.5g，K2HPO4 3.7g，KH2PO41.3g，MgSO4·7H2O 0.5g，NaCl 1.0g，蒸馏水1.0L，pH 7.2-7.5，高温灭 菌，待用；
2.培养冰核蛋白细菌Pseudomonas borealis(市购产品)：将上述菌株 于培养基中置22℃，200rpm，摇床培养16小时。
培养基成分是：胰蛋白胨1.5％(g/100ml)，大豆蛋白胨0.5％(g/100ml)， 氯化钠0.5％(g/100ml)，用蒸馏水配制而成，调节pH为7.2±0.2，经121 ℃压力蒸汽灭菌后，待用。
3.重组表达载体的构建。
1)以新月柄杆菌(C.crescentus NA1000)基因组DNA为模板，设计 并合成引物，进行PCR扩增，得到编码木糖脱氢酶的基因xylB。
引物是P1(5’→3’)：CGGGATCCATGTCCTCAGCCATCTATCCCAGCC和P2(5’→ 3’)：CCCAAGCTTACGCCAGCCGGCGTCGATCCAGT。
PCR反应体系为：ddH2O 34.7μL，模板DNA 1μL，10×PCR Buffer (Mg2+Free)5μL，MgCl2(25mmol/L)3μL，引物P1(20pmol/μL)1 μL，引物P2(20pmol/μL)1μL，dNTPMixture(各2.5mmol/L)4μL， TaKaRa TaqTM(5U/μL)0.3μL。反应参数为：95℃预变性5min，94℃ 30s，59℃ 30s，72℃ 60s，30个循环，最后72℃延伸10min。
将PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定后纯化回收(参见图1)，连接于 pMD-19T simple载体，构建重组质粒，命名为pMDXdh。
2)以冰核蛋白细菌Pseudomonas borealis菌株基因组DNA为模板，设 计并合成引物，进行PCR扩增，得到编码冰核蛋白N端结构域的基因 inaPb-N。
引物是P3(5’→3’)：CATGCCATGGGCATGAACGATGACAAAGTTTTGGTC和P4(5’ →3’)：CGGGATCCCACCGCTGTCTCCAGCGTTTGTG。
PCR反应体系为：ddH2O 34.7μL，模板DNA 1μL，10×PCR Buffer(Mg2+Free)5μL，MgCl2(25mmol/L)3μL，引物P3(20pmol/μL)1μL，引 物P4(20pmol/μL)1μL，dNTPMixture(各2.5mmol/L)4μL，TaKaRa TaqTM(5U/μL)0.3μL。反应参数为：95℃预变性5min，94℃ 30s，62℃ 30s，72℃ 60s，30个循环，最后72℃延伸10min。
将PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定后纯化回收(参见图2)，连接于 pMD-19T simple载体。得到的重组载体用限制性内切酶Nco I和BamH I 双酶切，然后连接到经同样双酶切的载体pET28a(+)上，得到的重组载体 命名为pTInaPb-N。
3)将上述载体pMDXdh用限制性内切酶BamH I和Hind III双酶切， 然后与同样双酶切的载体pTInaPb-N连接，得到xylB和inaPb-N的融合基 因；
4.重组载体的表达。将重组载体转化大肠杆菌Escherichia coli BL21 (DE3)，即得到细胞表面展示木糖脱氢酶的菌体(参见图3)。酶切鉴定正确 后接种于新鲜的含卡那霉素(30μg/ml)的LB液体培养基中，振荡培养至吸 光度(OD600)为～0.4时，加入IPTG(异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)使其 终浓度为1mmol/L，25℃诱导培养24h，待用。
大肠杆菌E.coli BL21(DE3)在LB培养基中培养，LB培养基成分为： 5g/L酵母膏，10g/L蛋白胨，10g/L NaCl。
实施例2
利用构建的木糖脱氢酶细菌表面展示系统，借助紫外分光光度计进行 木糖的快速检测：
1.标准曲线的绘制：将上述实施例所得细胞表面展示木糖脱氢酶菌体 进行诱导表达，24h后收获菌体，用50mM PBS缓冲液(pH 8.0)洗涤三次， 将菌体密度调整至OD600＝1.0。向1ml反应液(50mM PBS缓冲液，pH 8.0) 中加入上述100μL的菌液、NAD+(终浓度为1mM)和不同浓度的D-木糖溶 液(终浓度为0-1000μM)，进行平行操作，混匀，在30℃水浴锅中放置， 10分钟后取出，12000rpm/min，离心1分钟，取上清液，移入微量比色皿 中，波长340nm处进行光谱测定，以50mMPBS缓冲液(pH 8.0)调零。最后 以木糖浓度为横坐标，波长340nm处的吸光值为纵坐标，绘制标准曲线， 可得一条直线，求出其斜率，即为D-木糖的工作标准曲线斜率(参见图4)。
D-木糖的工作标准曲线如图4所示，由图可知，该工作标准曲线的R2值达到0.999，线性拟合度很好，其斜率为0.0029。
2.D-木糖的检测过程。向反应液中加入上述100μL的菌液、NA+(最 终浓度为1mM)和经稀释过的含有D-木糖的待测样品，进行平行操作，混 匀，在30℃水浴锅中放置，10分钟后取出，离心，取上清液于分光光度 计波长340nm处测量其吸光度，以50mM PBS缓冲液(pH 8.0)调零。根据 测得的吸光度，利用D-木糖工作标准曲线计算出D-木糖的含量。
实施例3
秸秆经过物理化学处理之后的降解产物中D-木糖含量的测定：
1.样品处理：将秸秆经物理化学处理之后的降解液用0.22μm的一次 性滤膜进行过滤处理，用50mM PBS缓冲液(pH 8.0)进行稀释(稀释比例 分别是10倍、100倍、1000倍)，备用。
2.制备展示有木糖脱氢酶的菌体：将上述实施例所得细胞表面展示木 糖脱氢酶菌体接种于新鲜的含卡那霉素(30μg/ml)的LB液体培养基中， 振荡培养至吸光度(OD600)为～0.4时，加入IPTG使其终浓度为1mmol/L， 25℃诱导培养24h，收获菌体，洗涤，用50mM PBS缓冲液(pH 8.0)将 菌体密度调整至OD600＝1.0。
3.D-木糖检测过程：具体步骤见实施例2。
4.D-木糖浓度的计算：取吸光值在标准曲线范围内的稀释比例的吸 光值来进行计算，代入标准曲线得出的计算公式，最后乘以相应的稀释倍 数，从而得到原秸秆降解液中D-木糖的浓度为84.87±1.45mM。D-木糖浓 度计算公式为：
实施例4
青岛啤酒中D-木糖含量的测定：
1.样品处理：将青岛啤酒，用0.22μm的一次性滤膜进行过滤处理， 用50mM PBS缓冲液(pH 8.0)进行稀释(稀释比例分别是10倍、100倍、 1000倍)，备用。
2.制备展示有木糖脱氢酶的菌体：将上述实施例所得细胞表面展示木 糖脱氢酶菌体接种于新鲜的含卡那霉素(30μg/ml)的LB液体培养基中， 振荡培养至吸光度(OD600)为～0.4时，加入IPTG使其终浓度为1mmol/L， 25℃诱导培养24h，收获菌体，洗涤，用50mM PBS缓冲液(pH 8.0)将 菌体密度调整至OD600＝1.0。
3.D-木糖检测过程：向1ml反应液(50mM PBS缓冲液，pH 8.0)中加 入上述100μL的菌液、NAD+(终浓度为1mM)和稀释过的啤酒，混匀，在 30℃水浴锅中放置，10分钟后取出，12000rpm/min，离心1分钟，取上 清液，移入微量比色皿中，波长340nm处进行光谱测定，以50mM PBS缓 冲液(pH 8.0)为空白对照。
4.D-木糖含量的计算：取吸光值在标准曲线范围内的稀释比例的吸光 值来进行计算，代入标准曲线得出的计算公式，最后乘以相应的稀释倍数， 从而得到原样品中D-木糖的含量为1.81±0.13mM。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上 述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改 变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明 的保护范围之内。