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1、(10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201210379619.9 (22)申请日 2012.09.26 C12N 5/0786(2010.01) (73)专利权人 中国人民解放军总医院 地址 100853 北京市海淀区复兴路 28 号 (72)发明人 刘长庭 郭英华 郭娜 方向群 王俊峰 李天志 常德 苏龙翔 陈振鸿 王立 CN 1532276 A,2004.09.29, 摘要， 权利要求 1. (54) 发明名称 一种单核细胞太空培养基及其制备方法 (57) 摘要 本发明涉及一种生物技术领域， 尤其是涉及 一种单核细胞太空培养基的制备。包括 ： 将无 L- 谷氨酰胺、 无。
2、 HEPES 的 1640 基础培养基， 3g/ L L- 谷氨酰胺， 1.5mg/L 氢化可的松， 胎牛血清及 1000U/ml 青霉素和链霉素按一定百分比配制成 单核细胞太空培养基。本发明保障了单核细胞在 太空环境中长时间无源生长， 并不需要对现有的 培养基原料进行大量变动， 保证单核细胞在长时 间太空模拟环境中抵御低温、 强辐射及微重力等 恶劣环境， 确保其适度生长、 降低凋亡率， 这为空 间医学细胞领域的研究提供必需的条件。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 宋智刚 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书1页 说明书3页 附图3页 (10)授。
3、权公告号 CN 103060270 B (45)授权公告日 2015.03.18 CN 103060270 B 1/1 页 2 1. 单核细胞太空培养基的制备方法， 其特征在于 ： 具体配置过程为 ： 向 225ml 无 L- 谷氨酰胺、 无 HEPES 的 1640 培养基中依次加入浓度为 3g/L 的 L- 谷 氨酰胺25ml及浓度为1.5mg/L氢化可的松0.075ml， 配制为无血清单核细胞太空培养基， 共 计 250.075mL ； 再取 250mL 胎牛血清及 1000U/ml 青霉素和链霉素 1mL， 加入到无血清细胞太空培养 基中， 充分混合均匀 ； 上述过程均在超净工作台上完。
4、成， 严格遵守无菌操作原则， 配制好的培养基放 4储 存备用。 权 利 要 求 书 CN 103060270 B 2 1/3 页 3 一种单核细胞太空培养基及其制备方法 技术领域 0001 本发明涉及一种单核细胞太空培养基的配制， 属于太空生物技术领域， 确保单核 细胞抵御太空环境中的不利因素， 适度增长， 降低凋亡率， 从而为空间医学细胞领域的研究 提供必需的条件。 背景技术 0002 太空环境复杂多变， 是一个低温、 强辐射、 微重力的恶劣环境。在太空环境中作业 的宇航员要面对复杂的外界环境， 研究已经证明这些环境因素对宇航员的健康会产生影 响。为进一步探索其影响机制以及制定相应的对策， 。
5、需要从人体、 组织、 细胞以及动物实验 等全方位开展研究。 随着我国空间医学的不断发展， 载人航天技术的进步， 太空环境对人体 方面的研究越来越多， 细胞领域的研究也广泛开展。无论是地面模拟太空环境还是太空搭 载， 在细胞研究领域仍存在许多瓶颈问题， 尤其在细胞培养基制备方面仍有许多难以攻克 的技术难题， 例如细胞在长期太空飞行中， 如何抵抗恶劣的太空环境， 利用有限的培养条件 继续生存、 维持增殖和凋亡的平衡？ 0003 目前在地面实验室中， 细胞培养的方法已趋于成熟， 根据细胞营养状态、 细胞周 期、 培养条件的不同， 选择恰当的时间点更换新鲜的细胞培养基、 进行细胞传代、 保存细胞 等。。
6、通常情况下， 如人单核巨噬细胞 (THP-1)， 2-3 天更换一次细胞培养基， 根据细胞密度 (106-107/mL) 进行传代， 37、 5 CO2 的培养条件下 4-5 天传代一次， 在保存细胞时需配制 专门的含二甲基亚砜的细胞冻存液， 将细胞保存在液氮中。在地面实验室中细胞培养通常 要达到的条件包括 ： 定期更换新鲜的细胞培养基、 保持一定的细胞密度并且具有适宜细胞 生长条件 (37、 5 CO2 的细胞培养箱 )。然而在太空搭载实验中， 因为微重力和辐射等因 素的影响， 无法达到和地面一样的适宜细胞生存的条件， 因此太空培养具有特殊性。 为了增 加太空细胞培养实验的可操作性、 减少空。
7、间人力消耗、 降低污染风险， 因此就要求培养基的 更换频率减少， 甚至不更换细胞培养基。在太空实验中， 整个细胞培养过程是一个密闭环 境， 这就要求对培养基进行更新， 研发出适合细胞太空生存的新型培养基， 在已有的研发成 果中， 某些太空培养基已成功应用于肿瘤细胞、 干细胞等贴壁细胞的太空实验中， 但对于单 核细胞太空培养基的研发缺少特异性， 单核细胞属于悬浮细胞， 其生长周期及生长特性有 其独特性， 已研发的太空培养基不能达到其最佳的生长状态。 发明内容 0004 本发明目的在于 ： 克服现有技术的缺陷， 提供一种具有适应太空环境的单核细胞 培养基， 可以为空间医学细胞领域的研究提供必需的研。
8、究条件。 0005 本发明中将下列物质按一定百分比配制成单核细胞太空培养基 ： 35 45的 无 L- 谷氨酰胺、 无 HEPES 的 1640 基础培养基， 4 5的 3g/LL- 谷氨酰胺， 0.01 0.015的 1.5mg/L 氢化可的松， 50 60的胎牛血清， 1的 1000U/ml 青霉素和链霉 素。配制单核细胞太空培养基的基本步骤为 ： 向无 L- 谷氨酰胺、 无 HEPES 的 1640 培养基中 说 明 书 CN 103060270 B 3 2/3 页 4 依次加入浓度为 3g/L 的 L- 谷氨酰胺及浓度为 1.5mg/L 氢化可的松， 配制为无血清单核细 胞太空培养基 。
9、； 按上述太空培养基的比例再取胎牛血清及青霉素和链霉素加入到无血清单 核细胞太空培养基中， 充分混合均匀 ； 上述过程均在超净工作台上完成， 严格遵守无菌操作 原则， 配制好的培养基放 4储存备用。配制成功后， 将单核细胞接种于太空培养基中 ： 首 先将培养基 37复温， 其次以 800r/min 1000r/min 的速度将地面培养的单核细胞离心 5min进行细胞收集， 血细胞计数板计数细胞数量， 最后按照105个/mL的密度将细胞接种于 装有太空培养基的搭载装置中， 密闭保存运输。 0006 本发明通过提高培养基中胎牛血清的比例， 血清浓度达到 50， 可大大提高单核 细胞的存活时间， 有。
10、利于单核细胞保持增殖与凋亡之间的平衡， 利用本发明培养的单核细 胞在太空环境下生存 397 小时后， 显微镜下观察细胞。 附图说明 0007 图 1 为单核细胞太空培养基的配制方法流程图 ； 0008 图 2 为普通光学显微镜下， 正常单核细胞地面培养照片 (100 倍 ) ； 0009 图 3 为普通光学显微镜下， 太空搭载飞行 397 小时后单核细胞照片 (100 倍 )。 具体实施方式 0010 本发明中按一定百分比配制成单核细胞太空培养基 ： 35 45的无 L- 谷氨 酰胺、 无 HEPES 的 1640 基础培养基， 4 5的 3g/L L- 谷氨酰胺， 0.01 0.015的 1。
11、.5mg/L 氢化可的松， 50 60的胎牛血清， 1的 1000U/ml 青霉素和链霉素。 0011 太空培养基中 1640 基础培养基作为单核细胞生长发育的基本微环境， 确保细胞 生长所必需的营养物质 ； 适当加大了 L- 谷氨酰胺的比例， 为单核细胞生长过程中合成核 酸、 蛋白质提供了更为充足的原料 ； 氢化可的松 (HC) 是一种肾上腺皮质激素类物质， 小剂 量 HC( 远小于生理剂量 ) 不但能够促进细胞生长发育， 而且发挥抗炎作用 ； 青、 链霉素发挥 了预防细菌污染的作用 ； 太空培养基中最重要的是胎牛血清及其浓度配比， 血清含有丰富 的营养成份， 胎牛血清品质最高、 所含对细胞。
12、有害的成分最少， 血清中的各种血浆蛋白、 多 肽、 脂肪、 碳水化合物、 生长因子、 激素、 无机物等协调细胞生长平衡。地面环境中细胞培养 通常选择血清浓度为1020， 本发明中将血清浓度调整为5060， 主要考虑到在 无源环境中， 细胞长时间生长会消耗掉大量的营养物质， 血清中营养物质丰富， 故提高血清 比重。 0012 例如 ： 配制 500mL 单核细胞太空培养基的基本步骤为 ： 0013 按所述自 Gibco 公司购买无 L- 谷氨酰胺、 无 HEPES 的 1640 细胞培养基， 按 45的比例取 225mL 无 L- 谷氨酰胺、 无 HEPES 的 1640 培养基， 25mL 的。
13、 3g/L L- 谷氨酰胺， 0.075mL 的 1.5mg/L 氢化可的松 ( 按 0.015比例 )， 配制为无血清细胞太空培养基共计 250.075mL ； 0014 按所述 50的比例再取 250mL 胎牛血清及青霉素和链霉素 1mL( 按 1比例 ) 加入到无血清细胞太空培养基中， 充分混合均匀 ； 0015 上述过程均在超净工作台上完成， 严格遵守无菌操作原则， 配制好的培养基放 4储存备用。 说 明 书 CN 103060270 B 4 3/3 页 5 0016 搭载前将单核细胞太空培养基放置在 37水浴箱中复温， 根据搭载装置容积， 取 500L的单核细胞太空培养基放入搭载装置。
14、中。 取生长状态良好的单核细胞， 如图1所示 ： 细胞形态大小规则， 成圆球形， 多呈簇排列， 似葡萄串珠状。利用水平转子离心机以 1000r/ min 的速度将单核细胞离心 5min 收集细胞， 血细胞计数板计数细胞， 按 105个 /mL 的细胞密 度将细胞接种于添加单核太空培养基的搭载装置中， 密闭保存运输。随神州八号飞船太空 飞行 397 小时。太空飞行结束后， 普通光学显微镜下观察细胞， 如图 2 所示 ： 部分细胞仍保 持原来大小， 性状较规整， 成圆球状， 细胞透光度较好， 视野中也有部分固缩死亡的细胞， 死 亡细胞体积较存活细胞明显变小， 细胞成黑色团块状， 无透光性。 0017 本发明未详细阐述部分属于本领域公知技术。 说 明 书 CN 103060270 B 5 1/3 页 6 图 1 说 明 书 附 图 CN 103060270 B 6 2/3 页 7 图 2 说 明 书 附 图 CN 103060270 B 7 3/3 页 8 图 3 说 明 书 附 图 CN 103060270 B 8 。