发明背景
依据35U.S.C.§119(e)，本申请要求美国临时专利申请No. 61/315,607(2010年3月19日提交)的优先权；美国临时专利申请No. 61/352,521(2010年6月8日提交)的优先权；以及美国临时专利申请No. 61/365,658(2010年7月19日提交)的优先权，在此将其全部内容引用作为参 考。
本发明涉及在发酵过程中利用抗生素备选物控制细菌生长的方法。更具 体来说，本发明涉及使用抗生素备选物进行细菌控制来发酵生产乙醇的方 法，抗生素备选物(alternatives)包括至少一种非氧化型杀生物剂和/或至少一 种稳定的氧化剂(stabilized oxidizer)。
考虑到工业乙醇作为燃料或燃料替代物(例如与汽油混合)的效果，以及 由于其能够通过多种可再生资源和废物材料获得，在全世界范围内对于工业 乙醇的需求逐年递增。
可以通过使用大量含淀粉原料的发酵来生产乙醇。基于淀粉的乙醇生产 通常包括如下步骤：制备大量含有或可以被降解为可发酵的糖的淀粉类原 料、添加水以制备醪液(mash)、使纤维素或其它复杂(complex)碳水化合物糖 化形成可发酵的糖、以及添加发酵糖形成乙醇和二氧化碳的酵母。通过使经 发酵的醪液(fermented mash)进行蒸馏来回收乙醇。乙醇生产中蒸馏的副产品 为含有蛋白质、纤维以及油的非淀粉类固体，该固体可以被加工以生产“具 有可溶物质的干酒糟(distillers dried grains with solubles)”或“DDGS”。DDGS 是营养物富集的，并且可以作为动物饲料、饲料添加物或植物肥料商业售出。
乙醇生产工业中的问题在于乙醇发酵过程设备和/或醪液容易被减少产 量的细菌污染。“乳酸细菌”是引起这方面问题的一类细菌。乳酸细菌包括例 如：乳杆菌属细菌、片球菌属(Pediococcus)细菌、明串珠菌属(Leuconostoc) 细菌和魏斯氏菌属(Weissella)细菌。乙酸细菌例如醋杆菌属细菌也会通过生 产乙酸或其它会污染过程并减少乙醇产量的有机酸来引起问题。酵母将糖转 化为乙醇，但细菌也会将这些相同的糖转化使其产生乳酸或乙酸，而不产生 乙醇，从而导致乙醇产量的减少。为了控制此类细菌的爆发，已经在生物乙 醇发酵过程中使用抗生素。用于这类处理的抗生素可以包括例如：维吉霉素、 青霉素、红霉素和泰乐菌素。这些抗生素还已经用于兽医和人类医学。人们 已经意识到并且逐渐关注由于抗生素的使用或它们的过量使用，会存在细菌 发展为抗生素药物抗性细菌。改变抗生素或增加抗生素的剂量可能无法提供 长期的解决方案，并且会与抗生素抗性问题混合。另外，已经发生了关于抗 生素对于目标细菌和发酵产物的非特异性的问题。此外，人们还关注了由于 在用于动物饲料的DDGS中存在残留抗生素导致的问题。可能会实施对于在 乙醇发酵应用中使用抗生素更为严格的立法和规则控制。需要用于乙醇发酵 过程的抗生素的备选物。
已经提出使用二氧化氯(即ClO2)作为氧化杀生物剂。但是，二氧化氯是 较强的氧化剂，其抗微生物作用是非选择性的。二氧化氯攻击不希望的细菌 和对于发酵过程重要的酵母。酵母的损失会转化为乙醇产量的损失和/或“缓 慢的”发酵和/或“卡住的(stuck)”发酵。二氧化氯还会产生氯离子，其可能会腐 蚀设备并导致铁沉积或剥蚀过程设备，以及向该方法系统中释放铁和铬，这 需要昂贵的维修。
本发明人已经认识到需要可以用其本身对于环境的负面影响最小的物 质来代替抗生素控制细菌的乙醇发酵方案。
发明简述
本发明的特征在于提供一种方法，该方法在乙醇发酵中使用抗生素备选 物控制细菌。
本发明另外的特征在于提供一种方法，该方法在用于乙醇发酵的过程中 使用抗生素备选物控制细菌，诸如在醪液发酵、发酵池(beer well)或其组合 中控制细菌。
本发明另外的特征在于提供一种方法，该方法在乙醇发酵中使用具有较 低或不具有负面环境影响的非抗生素处理来增加乙醇产量。
本发明另外的特征在于提供一种方法，该方法在乙醇发酵中使用基本不 存在于过程终产物中的非氧化型杀生物剂控制细菌。
本发明另外的特征在于提供一种方法，该方法在乙醇发酵中使用基本不 存在于过程终产物中的以及不会损害方法设备的稳定的氧化剂控制细菌。
本发明另外的特征在于提供一种方法，该方法通过向被循环至发酵罐的 至少一种生产用水的后发酵来源中添加杀生物剂从而在乙醇发酵中引入非 抗生素杀生物剂来控制细菌。
本发明另外的特征在于提供一种来自利用如下方法的生物乙醇生产的 不含抗生素的干酒糟产品，该方法在乙醇发酵中使用非抗生素杀生物剂控制 细菌，其中非抗生素杀生物剂基本上不存在于干酒糟产品中。
通过下述说明书来描述本发明另外的特征和优点部分，根据说明书部分 特征和优点是清楚的，或者通过实践本发明可以学习到。尤其借助在下述说 明书和权利要求中指出的元素和组合可以认识和获得本发明的目的以及其 它优点。
为了实现根据本发明目的的这些和其它优点，如本文所收录和广泛描述 的，本发明部分地涉及通过发酵生产乙醇的方法。该方法包括：在容器中存 在至少一种非氧化型杀生物剂和酵母的情况下，发酵可经发酵的醪液以生产 乙醇和固体成分，其中在醪液中所述非氧化型杀生物剂控制细菌的生长而不 会减少酵母种群。然后，该方法涉及蒸馏经发酵的醪液以从固体成分中分离 至少部分乙醇。通过本发酵方法可以增加乙醇产率而不需要使用抗生素。另 外，本发酵方法的乙醇和酒糟产品可以不含或基本不含所使用的抗生素备选 物。经发酵的醪液的酸含量减少，显示实现了提高的细菌控制。
本发明还涉及利用发酵生产乙醇的方法，该方法包括：在容器中存在至 少一种稳定的氧化剂和酵母的情况下，发酵可经发酵的醪液以生产乙醇和固 体成分，其中在培养中所述稳定的氧化剂控制细菌的生长，以及蒸馏经发酵 的醪液以从固体成分中分离至少部分乙醇。
本发明还提供利用发酵生产乙醇的方法，该方法包括：在如下条件下在 容器中提供可经发酵的醪液、非抗生素杀生物剂和酵母作为混合物，在该所 述条件下发酵醪液产生乙醇，以及在醪液中杀生物剂控制细菌的生长而不会 减少酵母种群，以及蒸馏经发酵的醪液以从经发酵的醪液的固体成分中分离 至少部分乙醇，其中非抗生素杀生物剂是非氧化型杀生物剂、稳定的氧化剂 或其组合。
本发明还提供一种利用发酵生产乙醇的方法，该方法包括：在容器中存 在酵母的情况下，发酵可经发酵的醪液以生产乙醇和固体成分，在存在至少 一种非氧化型杀生物剂的发酵池(一个或多个)中储存至少部分经发酵的醪 液，其中在发酵池中非氧化型杀生物剂控制细菌的生长，以及从发酵池向蒸 馏单元进料储存的醪液，在蒸馏单元中蒸馏经发酵的醪液以从固体成分中分 离至少部分乙醇。可以向发酵容器中的可经发酵的醪液和发酵池中的经发酵 的醪液两者中添加非氧化型杀生物剂。
本发明还提供一种利用发酵生产乙醇的方法，该方法包括：在发酵罐容 器中存在酵母和循环的生产用水的情况下，发酵可经发酵的醪液以生产包括 乙醇和固体成分的经发酵的醪液，任选利用含水溶液洗涤来自发酵罐容器的 气体释放(gaseous emission)，并向发酵罐容器中循环至少部分洗涤器出口溶 液，任选在发酵池中储存至少部分经发酵的醪液，向蒸馏单元中进料经发酵 的醪液，在蒸馏单元中蒸馏经发酵的醪液以从釜馏物中分离至少部分乙醇， 将釜馏物分成含液体部分(稀釜馏物(thin stillage))和含固体部分，任选向发酵 罐容器中循环至少部分的稀釜馏物，回收含固体部分至少部分作为湿酒糟产 品和/或干燥至少部分含固体部分以生产干酒糟产品和蒸发的蒸气，任选冷 凝蒸发的蒸气并且向发酵罐容器中循环至少部分经冷凝的蒸气，其中，在向 发酵罐容器中(再)循环水源之前，非氧化型杀生物剂和/或稳定的氧化剂被添 加至(或其存在于)包括洗涤器出口溶液、稀釜馏物、来自酒糟干燥的经冷凝 的蒸气、或它们的任意组合中的经循环水中的至少一种来源中。
本发明还提供一种利用发酵生产乙醇生产的干酒糟副产品的方法，该方 法包括：在发酵罐容器中存在酵母的情况下，发酵可经发酵的醪液以生产包 括乙醇和固体成分的经发酵的醪液，任选利用含水溶液洗涤来自发酵罐容器 的气体释放，并向发酵罐容器中循环至少部分洗涤器出口溶液，任选在发酵 池中储存至少部分经发酵的醪液，向蒸馏单元中进料经发酵的醪液，在蒸馏 单元中蒸馏经发酵的醪液以从釜馏物中分离至少部分乙醇，将釜馏物分成含 液体部分作为稀釜馏物和含固体部分，任选向发酵罐容器中循环至少部分稀 釜馏物，干燥至少部分含固体部分回收含固体部分以生产干酒糟产品和蒸发 的蒸气，以及任选冷凝蒸发的蒸气并且向发酵罐容器中循环至少部分经冷凝 的蒸气，其中用于在发酵容器中控制细菌的非氧化型杀生物剂和/或稳定的 氧化剂被添加至发酵罐容器、发酵池和示出的循环的水源、或它们的任意组 合中的至少一种中。发酵方法的酒糟副产品可以不含或基本上不含所使用的 抗生素备选物。当使用本发明方法生产时，酒糟副产品可以不含或基本上不 含抗生素而不会引起细菌问题或其它污染。
应当理解上述一般性描述和下述详细的描述均为示例性的，并且仅处于 解释的目的且仅意在进一步解释权利要求所描述的本发明。
在本文中使用的“抗生素”涉及控制细菌、霉菌或类似的微生物生长的物 质，其中该物质可以是由细菌或霉菌提供的天然物质、或者是化学/生物化 学合成的物质(其是天然物质的类似物)、或者天然物质的化学改性形式。该 物质可以是例如化合物。
“可发酵的糖”是指可以被酵母或其它微生物使用转化为乙醇或其它终 产物的简单的糖，诸如单糖和二糖(例如，葡萄糖、果糖、半乳糖、蔗糖、 麦芽糖)。
“纤维素类物质”是指含有纤维素的物质。纤维素通常在植物的例如茎、 叶、荚、壳、穗轴或树木的叶、枝和木材中被发现。纤维素类物质可以是但 不限于草本物质、农业废料、林业废料、市政固体废料、废纸、纸浆和造纸 厂废料。应当理解在本文中纤维素可以为木质纤维素的形式，在混合的基质 中含有木质素、纤维素和半纤维素的植物细胞壁物质。
“杀生物剂”是指能够以选择性的方式控制细菌的化学物质。
“非氧化型杀生物剂”是指在发酵醪液中在至少一个剂量下对于细菌具 有选择性(即，攻击至少一种细菌但不攻击酵母)的杀生物剂。
“控制”至少一种细菌的生长保持细菌种群在期望的水平，减少种群至期 望的水平(甚至至不可检测的极限值)，和/或至少部分抑制细菌的生长。另外， 还应当理解“控制”至少一种细菌的生长可以包括生物静力学地减少和/或保 持至少一种细菌的低水平，从而减轻在发酵醪液中糖与细菌的反应，即可以 降低和/或消除细菌生长速率或细菌对于发酵糖的攻击速率。
“干酒糟(distillers dried grains)”(DDG)通常是指通过发酵的乙醇生产的 副产品，其可以包括经干燥的剩余酒糟(grain)固体，其可以是动物饲料级的。
“具有可溶物质的干酒糟”(DDGS)是指通过发酵的乙醇生产的副产品， 其可以包括具有可溶成分(诸如过程浆液(process syrup)或其它可溶物质)的 经干燥的剩余酒糟固体，以及其可以是动物饲料级的。
“湿酒糟(Wet Distillers Grains)”(WDG)是指通过发酵的乙醇生产的副产 品，其可以包括干燥之前的剩余的酒糟固体，其可以含有至少部分过程浆液， 且其可以是动物饲料级的。
下述附图在此并入构成本申请的一部分，其说明本发明的一些实施方式 并且与说明书一起意在解释本发明的要旨。
附图说明
图1示出了根据本发明实施方式具有引入非抗生素杀生物剂控制细菌 的乙醇生产方法的流程图。
图2示出了根据本发明实施方式在生产工厂中具有引入非抗生素杀生 物剂控制细菌的乙醇生产方法的另一流程图。
图3示出了根据本发明实施方式在生产工厂中具有引入非抗生素杀生 物剂控制细菌的乙醇生产方法的另一流程图。
图4示出了随着时间(小时)发酵进行过程中基于二氧化碳产生的质量损 失(g)，其中在实施例1中描述了玉米发酵中，对发酵实施非氧化型杀生物剂 处理和未处理作为对照。
图5示出了实施例1描述的玉米发酵实验中实施了非氧化型杀生物剂处 理和未处理对照中乳酸的终浓度(g/100mL)。
图6示出了在实施例1描述的玉米发酵实验中非氧化型杀生物剂处理和 未处理对照的乙醇产率(g乙醇/g干玉米)，其中用相同字母表示的柱是在95% 置信水平上没有显著区别的结果。
发明详述
本发明提供使用至少一种抗生素备选物控制乙醇发酵中的至少一种细 菌的生长的方法，该抗生素备选物例如非抗生素杀生物剂，其可以不存在于 或基本不存在于过程终产物中。抗生素备选物可以是一种或多种非氧化型杀 生物剂、稳定的氧化剂或它们的任意组合。这些抗生素备选物相对于发酵酵 母，对于细菌是具有选择性的，使得在本发明的方法中能够提高乙醇产率， 例如与不使用抗生素备选物的相同的发酵过程相比，乙醇产率提高至少约 0.5重量%，或约0.5%~约5重量%，或约1%~约3.5重量%，或约1.25%~ 约2.5重量%。在工业水平的生产中，即使产率上看似较少的增加也可以是 显著的。此外，由本发明方法制备的干酒糟(DDG)，诸如具有可溶物质的干 酒糟(DDGS)可以是不含抗生素的。另外，抗生素备选物可以降解或反应形 成其它物质，该其它物质如果在发酵过程中以及乙醇和DDG(例如DDGS) 回收之前，对于环境有影响，该影响也较小。相信本发明方法中使用的抗生 素备选物，即非氧化型杀生物剂或稳定的氧化剂不会保留至形成DDG，诸 如DDGS的过程中(即杀生物剂分解和/或另外不存在)。因此，不期望非抗生 素杀生物剂终止在具有DDG(例如DDGS)的动物饲料中，以及后续终产品 中，例如来自喂食DDG(例如DDGS)的家畜、家禽或鱼类的市售肉制品。发 酵过程的DDG和DDGS副产品，例如可以不含或基本上不含用于在发酵过 程中控制细菌的非氧化型杀生物剂或稳定的氧化剂。例如，本发明方法的 DDG副产品，诸如DDGS副产品可以以如下量含有本发明发酵方法中使用 的抗生素备选物，所述量为小于约100ppm、小于约10ppm、或小于约5ppm、 或小于约1ppm、或小于可检测量(例如，0.01ppm~10ppm、0.0001ppm~5ppm、 0.001ppm~1ppm)。
本发明还提供通过向至少一种循环至发酵罐的生产用水的发酵后水源 (post-fermentation source)中添加杀生物剂，从而向乙醇发酵中引入用于控制 细菌的非抗生素杀生物剂的方法。在将这些水源循环至发酵罐之前，利用指 出的非抗生素杀生物剂处理发酵后水源，可以控制可能在发酵过程中或发酵 后的处理中污染水源的细菌。在将循环的水(再)导入到发酵罐之前，利用指 出的杀生物剂处理循环的水以控制水中的细菌可以防止或减少发酵罐或其 它利用循环的水的处理单元染菌的风险。
通常，将复杂碳水化合物或糖转化为可发酵的糖的过程通常包括多个步 骤。在诸如用于含有颗粒淀粉的谷物和谷类的传统过程中，通常使用例如两 部研磨，在本领域中被称为湿磨和干磨。然后含有经研磨的淀粉的物质与含 水溶液混合以生产浆料。在干磨过程中，与含有经研磨的淀粉的物质混合的 含水溶液通常不仅包括水，还含有变化量的稀釜馏物和/或过程系统中的其 它循环的水源。稀釜馏物和/或其它循环的水源可以用于保存用于可发酵的 糖和/或醇处理中的水。然后，通过液化过程，将淀粉转化为短链不太粘稠 的糊精，液化过程通常涉及淀粉的糊化(gelatinization)，以及同时或随后添加 出于该目的的合适的酶。然后，通过糖化步骤经液化的淀粉被转化为低分子 量的糖，该过程通常包括使用另一种合适的酶催化。然后可以进一步纯化低 分子量糖(纯化糊精)，并且被发酵微生物(诸如酵母)代谢为乙醇。如所示出 的，糖化和发酵步骤可以顺序进行或可以同时进行。可以对得到的经发酵的 醪液进行蒸馏以从釜馏物中分离乙醇产物，并进一步对其进行加工形成干酒 糟副产品(一种或多种)。
在乙醇发酵罐中，乳杆菌属细菌诸如植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum) 通常会成为问题。其它细菌可能会攻击发酵罐中的底物；例如专性厌氧菌， 诸如乙酸细菌。由于不足的氧浓度，在发酵过程中条件通常会变为缺氧的， 从而促进乙酸细菌(例如，醋杆菌属)生长并与需氧细菌竞争养分，它们的过 度生长会通过分解代谢产生乙酸。在乙醇发酵中生产的乙酸可能会成为另外 的问题。与乳杆菌属细菌相比，酵母对于乙酸的敏感性可能高约10倍。因 此，乙酸细菌以及乳杆菌属细菌会负面地影响使用酵母的乙醇发酵。在蒸馏 单元的发酵池中，乙酸可能会引起恶臭发酵。发酵池是蒸馏单元的经发酵的 醪液的原料储罐。在本发明中，用于本发明方法中的一种或多种非氧化型杀 生物剂和/或稳定的氧化剂用于选择性地控制乳杆菌属细菌、乙酸细菌和/或其 它可能降低乙醇产率的细菌或其它损害发酵过程的细菌，但不控制有益的酵 母。因此，在本方法中使用抗生素备选物(诸如非氧化型杀生物剂或稳定的氧 化剂)控制细菌而不损害酵母，使得酵母可以适当地发酵而不会被存在的细菌 或生长的细菌所阻碍(例如，杀生物剂不会减少或杀灭酵母)，该细菌尤其是厌 氧生长的细菌和/或形成对过程有害的乙酸的细菌。目标细菌可以是例如乳杆 菌属细菌(专性厌氧菌)或它们的任意组合。与不存在非氧化型杀生物剂或稳 定的氧化剂进行的相同经发酵的醪液相比，经发酵的醪液可以具有至少约5 倍(5x)、或至少约10倍(10x)、或至少约25倍(25x)少的乳酸或乙酸，或两者， 基于重量%，其表明在本发明方法中实现了提高的细菌控制。提高了乙醇产 率，并且就产品质量而言，尤其是DDGS，其不含或基本上不含可能是环境 不友好的或食物链中不期望的抗生素和杀生物剂。针对本发明的目的，应当 理解“不会减少酵母种群”是指不会明显地减少酵母种群(例如，在引入杀 生物剂的30分钟内，酵母种群的减少小于10%)。
图1示出了说明本发明非限制性方法的流程图。本发明方法的基于淀粉 的乙醇生产通常包括制备原料纤维素或淀粉类物质的处理步骤或操作(例 如，研磨)(1)，混合/蒸煮(cooking)(液化)(2)，糖化(3)，在存在非氧化杀生物 剂或稳定的氧化剂的情况下的发酵(4)，任选的具有非氧化杀生物剂或稳定的 氧化剂处理的发酵池储存(5′)，蒸馏(5)以生产乙醇产品，过滤釜馏物(6)，以 及酒糟干燥(7)以回收DDGS副产品。取决于原料的类型，可以对原料进行 一种或多种在先的单元操作，诸如研磨、切割、筛选和/或使得物质易于处 理和使得物质表面更容易与处理试剂接触的其它方法，通常如图中的步骤1 所示。如步骤2所示，制备后的原料(例如，捣碎的原料)可以与水(21)和溶 解试剂(22)混合，并且被蒸煮。在步骤2中，“液化”是指在原料中溶解和水 解纤维素或其它复杂碳水化合物的过程。合适的热稳定溶解酶或酸可以用于 水解原料淀粉物质，以提供经液化的醪液。在步骤2中可以添加其它添加物， 诸如pH调节试剂。在步骤3中，可以向步骤2的产品中添加糖化试剂(31)， 诸如糖化酶以转化经液化的醪液为可发酵的糖(例如，可发酵的单糖)。通过 发酵生物(诸如酵母)可以代谢可发酵的糖。如所示出的，可能需要多种酶处 理来将起始原料纤维素或复杂碳水化合物转化成不太复杂的淀粉，以及最终 形成可发酵的糖。如步骤4所示，可以在发酵容器中向醪液中添加酵母(41) 和杀生物剂(非氧化型杀生物剂或稳定的氧化剂)(42)，该步骤发酵糖形成乙 醇和二氧化碳(43)。在种子罐(未示出)中生长的酵母，例如可以被添加到醪 液中从而引发转化可发酵的糖形成乙醇的过程。可以向醪液中添加非氧化型 杀生物剂和/或稳定的氧化剂以控制发酵过程中存在的任何问题细菌。如发 酵工业中所理解的，液化和/或糖化步骤可以与发酵步骤同时进行或分别进 行。例如，可以在单独的处理区域进行糖化和酵母发酵过程，或者至少部分 同时在发酵区域中进行。虽然不意在限制，例如糖化可以在准备发酵步骤中， 在将醪液进料到发酵罐的过程中发生。还如工业中所理解的，相同的发酵容 器中分别存在糖化试剂和酵母时，在酵母发酵反应可以发生之前，需要发生 糖化反应。
如过程途径50A所示，可以直接从发酵容器将经发酵的醪液导入到蒸馏 柱或其它蒸馏单元中。如过程途径50B所示，在醪液被导入蒸馏柱或其它蒸 馏单元之前，经发酵的醪液可以储存在发酵池(一个或多个)中，如步骤5’所 示。发酵池可以储存每个批次之间的经发酵的发酵物(beer)，并且可以包括 蒸馏的乙醇回收操作提供连续的经发酵的醪液流。可以使用经发酵的醪液的 一个或两个过程流动途径50A和50B。可以向发酵池中的经发酵的醪液中添 加杀生物剂(非氧化型杀生物剂或稳定的氧化剂)(53)以控制发酵池中存在的 任何问题细菌。可以使用单个发酵池或多个发酵池或利用杀生物剂处理单个 发酵池或多个发酵池。如步骤5所示，通过使经发酵的醪液进行蒸馏以回收 由发酵反应产生的乙醇(51)。取决于蒸馏的类型，可以过滤或另外进一步处 理(未示出)乙醇流(51)以分离出水份并且进一步纯化回收的乙醇产品。在乙 醇生产中的蒸馏的釜馏物(52)副产品包含非淀粉类固体，该固体含有蛋白质、 纤维和油类，可以对其进行加工以生产不含抗生素和不含或基本不含非氧化 型杀生物剂或稳定的氧化剂的DDGS。该釜馏物(52)可以被称作“整个釜馏 物”，其是含有发酵之后剩余的物质以及醇的初馏物(initial distillation)的固体 (“发酵柱底部物质(beer column bottoms)”)。如所示出的，如步骤6所示可以 过滤釜馏物(52)以分离液体(61)，诸如稀釜馏物，其可以被重新用于方法中， 如步骤7所示可以对固体(52)进行干燥以生产DDGS(71)。例如可以离心、 压制、过滤或筛网过滤或进一步处理釜馏物以在分离步骤6中分成液体和固 体。
针对本发明的目的，可以在发酵之前和/或发酵的过程中，添加非氧化 型杀生物剂和/或稳定的氧化剂。可以以任何方式引入杀生物剂，例如为固 体或液体或甚至气体方式。可以连续或分批引入杀生物剂。可以在发酵之前 和/或发酵过程中引入杀生物剂。可以在醪液被引入到发酵容器中之前，可 以在容器上施用杀生物剂(例如，施用至容器壁)。优选，至少在添加酵母之 前和/或在添加酵母的同时(或添加之后立刻)添加杀生物剂(例如，在添加酵 母的6小时之内、3小时之内、1小时之内、30分钟之内、10分钟之内)。 可以将杀生物剂引入到发酵容器中，和/或引入到进入发酵容器的管路中， 和/或发酵容器的容器上游(例如，糖化容器)，和/或直接循环或间接循环至(例 如，上游)发酵容器的水源(一个或多个)中。可以以单独批次、多批次、滴加 流等方式引入杀生物剂。
如所示出的，如果使用储存经发酵的醪液的发酵池(一个或多个)，可以 在发酵池中添加杀生物剂(非氧化型杀生物剂或稳定的氧化剂)。可以在向发 酵池引入醪液之前和/或引入醪液过程中和/或引入醪液之后，引入杀生物剂， 和/或可以将杀生物剂引入到进入发酵池的管线中，诸如向发酵池进料醪液 的管线。可以连续地或分批地向发酵池中引入杀生物剂。可以在将经发酵的 醪液引入到发酵池之前，将杀生物剂施用至发酵池(例如，施用至发酵池壁)。 可以以单独批次、多批次、滴加流等方式向发酵池中引入杀生物剂。可以在 乙醇生产的任何其它处理之前，过程中和/或之后添加杀生物剂以控制问题 细菌。
图2示出了说明本发明非限制方法的流程图，在该方法中，可以在循环 至发酵容器的生产用水的至少一个来源中添加杀生物剂。图2中的过程单元 的处理流和路线基本与图1所示的相同，参考具有相似编号的元素和单元， 其可以具有与图1所示的基本相似的含义。出于水的保护和/或其它目的， 可以将多个发酵后的水源循环至发酵罐上游的一个或多个进入点(例如，在 阶段1、2和/或3)和/或直接循环至用于发酵(4)的一个或多个发酵罐。例如， 可以将稀釜馏物(61)循环至用于发酵的发酵罐(一个或多个)。可以将稀釜馏 物循环至发酵罐(一个或多个)上游的一个或多个导入点，如图2所示的非限 制性方式，或直接循环至发酵罐。可以循环例如约10%~约90%、或约25%~ 约75%、或约40%~约60%、或约50%或其它体积百分比的稀釜馏物用于 制备玉米浆料。根据不同的工厂和操作，相对量可以变化，并且可以随时间 改变相对量，例如为了保持水和固体的平衡。如下文所述，例如可以向任何 稀釜馏物的未循环部分施用其它处理，诸如在制造过程浆料中蒸发，过程浆 料可以在制备DDGS副产品的干燥之前或之后被添加到固体中。发酵池、蒸 馏柱、或它们两者中的水均可能被细菌(例如乙酸细菌)污染，如果在循环(诸 如，循环的稀釜馏物)之前不利用杀生物剂处理细菌，可能会导致如下情况： 向发酵罐(一个或多个)中进料被污染的水，以及会出现(再)感染发酵操作使 其变为处理前或未处理状态的风险。为了消除或至少减少这样的风险，一种 选择，在重新引入到发酵罐(一个或多个)的过程系统上游之前的返回流(61) 中，或在其它过程位点，利用杀生物剂(63)处理稀釜馏物。通常，不是所有 固体(62)所携带的水或其它挥发性液体会在固体(62)通过酒糟干燥步骤(7)以 形成DDGS(71)的过程中从系统中损失。固体(62)中的大部分，例如约80% 或更多或其它百分比的水可以被回收作为来自蒸发器(干燥器)的冷凝液，并 被返回至浆料系统作为循环水。在蒸气冷凝步骤(9)中可以冷却由干燥步骤(7) 产生的蒸气流(72)以提供经冷凝的蒸气流(73)，其也可以被循环并用作进料 到发酵罐(一个或多个)的生产用水源。在另一选择中，在被重新引入到发酵 罐(一个或多个)的过程系统上游之前，或在其它过程位点，可以利用杀生物 剂(74)处理经冷凝的蒸气流(73)。可以以一种形式或以其它形式，将釜馏物 中的大部分水分返回至浆料系统，例如约50体积%~约95体积%、或约75 体积%~约92体积%、或约90体积%、或其它百分比，利用示出的杀生物剂 处理这些生产用水的循环源可以为防止或减少在发酵罐、发酵池或其它过程 单元或管线中出现细菌感染和/或生长问题的风险提供有效的方法。另一个 向供给至发酵罐(一个或多个)的浆料系统或者直接向发酵罐(一个或多个)输 入水的选择可以是洗涤器水。随着酵母发酵糖，二氧化碳气体(43)会与其它 发酵气体(诸如挥发性有机物和水蒸气)一起释放。二氧化碳可以直接被释放 到大气中，或如所示在释放前，利用洗涤器在洗涤步骤(8)经纯化。可以使用 洗涤步骤来从含有二氧化碳的发酵气体中除去挥发性有机物(包括例如乙 醇)。通过洗涤步骤(8)的洗涤器供给水并与发酵气体接触以除去污染物从而 回收可能否则会由于从发酵罐蒸发而损失的乙醇。来自洗涤步骤的含水流出 物(45)也可以被循环作为用于发酵的生产用水源。作为另外的选择，可以在 被重新引入到发酵罐(一个或多个)的过程系统上游之前，或在其它过程位点， 利用杀生物剂(46)处理洗涤器流出物(45)。期望或用于发酵过程或其它处理 的水需求的任何额外来源可以为，例如直接来自工厂水供给(例如，市政水、 井水等)，其量可以是相对较少的或其它量。这些系统的其它潜在水源可能 不需要利用杀生物剂处理，如果期望或需要也可以实施这样的处理。
根据本发明，在发酵过程中和/或发酵之后，利用非氧化型杀生物剂和/ 或稳定的氧化剂处理的细菌水平(例如，乳酸细菌)(例如，在醪液、经发酵的 醪液、或回收的乙醇、或回收的DDGS、或再循环至发酵罐的水源中)可以 低于约109CFU/ml(每毫升的集落生成单位)、或低于约108CFU/ml、或低于 约107CFU/ml、或低于约106CFU/ml、或低于约104CFU/ml、或约1CFU/ml~ 约109CFU/ml、或约10CFU/ml~约108CFU/ml、或约102CFU/ml~约107CFU/ml、或约103CFU/ml~约106CFU/ml、或其它水平。
应当理解在本发明方法中使用非氧化型杀生物剂和/或稳定的氧化剂包 括使用任何含有可发酵的糖的来源的原料的乙醇生产。原料可以是任何类型 的可以通过微生物发酵分解的碳水化合物。例如，用于本发明的原料可以是 任何为可发酵的糖的来源的碳水化合物或淀粉，即可以是可发酵糖的直接来 源，也可以是通过降解或转化其初始物质或其中间体淀粉、纤维素、或多糖 成分提供可发酵的糖的物质。原料的合适的来源的实例为农作物，诸如谷类 (例如，玉米、小麦、高粱)、大麦、水稻、黑麦、甘蔗、甜菜、饲料甜菜、 糖蜜、马铃薯、胡萝卜、木薯、大黄、欧洲防风草(parsnips)以及甜高粱(sweet sorghum)。与作物相关的农业废物也可以使用。可以使用其它淀粉类原料来 通过本发明方法生产乙醇，该其它淀粉类原料诸如生物质，例如木片、锯屑、 柳枝稷(switchgrass(Panicum virgatum))、玉米秸秆、玉米穗轴、麦秆、谷壳、 以及回收的纸和废纸材料和产品、或它们的任意组合。生物质擦料可以是木 质纤维素类生物质材料，诸如木质材料，或其可以是草类材料，诸如柳枝稷， 其木质素含量低。其它原料可以包括果实类和/或果实汁(例如，葡萄、梅、 莓、苹果、梨、樱桃)、香蒲(cattails)、精制的糖(例如蔗糖)、蜂蜜、树液(枫 树、棕榈树)、花(蒲公英、芙蓉属)、或它们的任意组合。应当理解在工业中 这些和/或其它用于乙醇发酵的不同原料具有不同的乙醇产率，诸如由于不 同的淀粉含量和组成，以及不同的副产品导致的不同的乙醇产率。如所示出 的，应当相信使用非氧化型杀生物剂和/或稳定的氧化剂用于乙醇生产的细 菌控制的本发明方法不需要限定淀粉类原料。
其中，所使用的含纤维素原料或其它含复杂碳水化合物的原料不是直接 的可发酵的糖，通常需要几步反应来将复杂的碳水化合物转化为乙醇。如所 示出的，“液化”和“糖化”通常与“发酵”结合，其中所使用的针对乙醇生产的 原料含有复杂碳水化合物，其对于酵母而言不是直接可发酵的糖，但是可以 被降解以释放或提供可发酵的糖。
可以利用酶或酸来进行液化和糖化。该第一步反应可以是例如，纤维素 或其它复杂碳水化合物的酶或酸水解以形成可发酵的糖或其较小的前体。酶 水解，例如可以生成中间体糖类，并需要进一步的酶解以获得可发酵的糖。 例如在下述文献中描述了通过添加酸(诸如稀释的无机酸)的糖化：美国专利 1,323,540号和4,201,596号，在此将其全部并入作为参考。例如在下述文献 中描述了针对含纤维素的原料，通过酶催化水解的糖化，诸如使用纤维素分 解酶(cellulytic enzyme)或纤维素酶(cellulase)：美国专利3,764,475号和 3,642,580号，在此将其全部并入作为参考。用于引发纤维素的微生物糖化 的另外的微生物或酶试剂可以包括，例如美国专利4,094,742号中描述的黑 曲霉(Aspergillus niger)变体817和嗜热分解纤维素生孢噬胞菌属 (sporocytophaga)细菌，在此将其全部并入作为参考。对于玉米而言，例如在 发酵之前，通常利用酶将淀粉分解为糊精和葡萄糖。玉米的液化和糖化分别 例如可以在具有例如分解玉米淀粉形成短链糊精的α-淀粉酶和例如可以分 解糊精形成可发酵的糖的酶的阶段进行。小麦乙醇生产与玉米乙醇生产没有 风险的区别，可以通过工业中所使用的已知的微操作调节来使用小麦代替玉 米。此外，小麦的蛋白质含量高于玉米，但是淀粉含量稍少，具有更多纤维 和戊聚糖，其为半纤维素，粘度较高并且更难以分解形成淀粉。由于较低的 淀粉含量，与玉米相比，小麦通常产生较少的乙醇但更多的酒糟。可以用酶 法处理甘蔗的纤维部分(例如甘蔗渣)以降解纤维素形成可发酵的糖。甘蔗汁 (以及其它果实汁)可以适合用于直接发酵。考虑到乙醇产率、副产品的类型 以及过程的容易程度，取决于所选择和使用的原料的种类，发酵工业的技术 人员通常知道很多折衷方法。在这一方面，可以改变在本发明的方法的发酵 过程中使用的控制细菌的非氧化型杀生物剂或稳定的氧化剂以针对不同的 可能和选择。添加的用于糖化纤维素材料的各种酶的量(例如，纤维素分解 酶(一个或多个))可以是例如，约0.001%~约2重量%的酶、或约0.01%~约1 重量%的酶，或约0.015%~约0.5重量%的酶、或约0.2%~约0.75重量%的酶、 或约0.1重量%~约0.5重量%的酶、或约0.2~约0.4重量%的酶，基于可发 酵的材料(以固体重量为基础)，但也可以使用其它量。添加的用于液化步骤 的溶解酶的量也可以为类似范围的量。在本文中所指出的酶的任何量可以是 基于活性酶的。
发酵可以涉及可发酵的糖向乙醇的转化，其通常通过在本发明的方法中 用酵母进行发酵。通过酵母可以完成由糖形成乙醇，酵母诸如酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)，如美国专利2,802,774号所描述的，以及尖孢镰 刀菌(Fusarium oxysporum)。其它可用的微生物为如美国专利4,094,742号(在 此将其全部并入作为参考)所表述的生产乙醇的芽孢杆菌属细菌。添加用于 发酵糖的酶的浓度(来自例如酿酒酵母)可以为例如，约0.001%~约2重量% 的酶、或约0.01%~约1重量%的酶、或约0.015%~约0.5重量%的酶、或约 0.2%~约0.75重量%的酶、或约0.1重量%~约0.5重量%的酶、或约0.2%~ 约0.4重量%的酶，基于可发酵的材料(以固体重量为基础)，但也可以使用 其它量。
用于在本发明方法的发酵过程中(和/或发酵之前和/或发酵之后)控制细 菌的非氧化型杀生物剂可以是例如：二溴次氮基丙酰胺 (dibromonitrilopropionamide)(例如，2,2-二溴-3-次氮基丙酰胺)、溴-硝基烷- 二醇(例如，2-溴-2-硝基丙烷-1,3-二醇)、二硫氰酸亚甲基酯、2-(硫氰基甲基 -硫代)苯并噻唑、氰基亚胺基二硫代甲酸盐、N-甲基二硫代氨基甲酸盐、聚 [氧亚乙基(二甲基亚氨基)-亚乙基(二甲基亚氨基)亚乙基二盐酸盐、四羟甲基 硫酸鏻、1,1,1-三(羟甲基)硝基甲烷、戊二醛、1,5-戊二醛、烷基苄基氯化铵、 2-溴-2-硝基-丙烷-1,3-二醇、二癸基二甲基氯化铵、二甲基二硫代氨基甲酸 盐、盐酸十二烷基胍、1,2-苯并异噻唑啉-3-酮、5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3- 酮、2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮、正辛基异噻唑啉酮、二氯-正辛基异噻唑啉酮、 溴硝基苯乙烯、四氢-3,5-二甲基-2H-1,3,5-噻二嗪-2-硫酮、或它们的任意组 合。非氧化型杀生物剂可以是例如二卤代次氮基丙酰胺(例如，2,2-二卤代-3- 次氮基丙酰胺)，包括但不限于：二溴次氮基丙酰胺(例如，2,2-二溴-3-次氮 基丙酰胺)、二氯次氮基丙酰胺(例如，2,2-二氯-3-次氮基丙酰胺)、二碘次氮 基丙酰胺(例如，2,2-二碘-3-次氮基丙酰胺)、二氟次氮基丙酰胺(例如，2,2- 二氟-3-次氮基丙酰胺)、或它们的任意组合。其它实例包括但不限于：甲烷 硫代羟丙酯(hydroxypropyl methanethiosulfonate)(HPMTS)和/或2,2-二溴-3-次 氮基丙酰胺(DBNPA)与或不与其它杀生物剂。如本文所指出的任何化合物或 组合物，应当理解特定的卤素可以用不同的卤素取代。例如，溴可以被氯或 碘取代，反之亦然。
非氧化型杀生物剂对发酵醪液的处理率应当是足够控制发酵的问题细 菌而不减少酵母的浓度。通常不需要对浓度进行限定。用于处理发酵醪液的 非氧化型杀生物剂的浓度可以为例如，至少约0.1ppm、或至少约1ppm、或 至少约10ppm、或约0.1ppm~约1000ppm、或约50ppm~约500ppm、或约75ppm~ 约250ppm、或约100ppm~约200ppm，基于可经发酵的醪液(以干固体重量/ 重量为基础)，但也可以使用其它浓度。例如，利用1ppm杀生物剂处理可经 发酵的醪液相当于利用1磅杀生物剂处理1,000,000磅可经发酵的醪液。在 发酵池中用于处理经发酵的醪液的非氧化型杀生物剂的浓度与用于在发酵容 器中基于发酵醪液所指出的水平相似，或可以为其它浓度。用于处理循环至 发酵罐的生产用水(诸如，作为循环的稀釜馏物、循环的洗涤器流出物和/或循 环的来自酒糟干燥的经冷凝的蒸气)的非氧化型杀生物剂的浓度，可以与在发 酵容器中基于发酵醪液所指出的水平相似，或可以为其它浓度。
在本发明发酵方法中用于细菌控制的稳定的氧化剂可以氧化剂物质，该 氧化剂物质是经合成的、配制的或其它方法改性从而使得其以低于通常速率 的速率释放材料的氧化副产品。稳定的氧化剂对于细菌可以是具有选择性 的，但不必须具有选择性。
用于控制细菌的稳定的氧化剂可以是稳定的次氯酸、稳定的次氯酸盐、 稳定的氯胺、稳定的次溴酸(例如，以稳定的溴化的氨基磺酸钠或任何其它 稳定形式)、稳定的二氧化氯(例如，缓慢释放的ClO2)、稳定的过氧乙酸(例 如，缓慢释放的H3C-COOOH)、碘或稳定的碘产品(例如，固体碘或碘化物 或电解产生的碘)、缓释氯三酮、缓释三氯均三嗪三酮钠(sodium trichloro-s-triazinetrione)、缓释二氯均三嗪三酮钠(sodium dichloro-s-triazinetrione)(例如，缓释的氧化剂，其释放速度可以杀灭细菌但 是在杀灭酵母之前停止)、缓释氯三酮、缓释三氯均三嗪三酮钠、稳定的氯 乙内酰胺、稳定的溴乙内酰胺、或稳定改性的乙内酰胺、或它们的任意组合。
可以将这些稳定的氧化剂制备成如下形式的制剂：其延缓材料的氧化副 产品的释放，例如微粒或经缓冲的物质。稳定的二氧化氯可以是例如经缓冲 的亚氯酸钠。在发酵罐中的细菌的酸性，例如乳酸可以将亚氯酸钠转变为二 氧化氯，二氧化氯是可以降解为氯化物和钠离子(盐)无毒成分，而在该过程 中无氯气或二英产生的抗菌剂。在液体中，稳定剂可以是基于氨基磺酸的 物质或基于铵盐的物质。如所示的，一些氧化剂可以在固体形式中稳定。
稳定的氧化剂对醪液的处理率应当是足够控制发酵的问题细菌而不减少 酵母的浓度。通常不需要对浓度进行限定。用于处理发酵醪液的稳定的氧化 剂的浓度可以为例如，至少约0.1ppm、或至少约1ppm、或至少约10ppm、或 约0.1ppm~约1000ppm、或约50ppm~约500ppm、或约75ppm~约250ppm、 或约100ppm~约200ppm，基于可发酵的材料(以干固体重量/重量为基础)，但 也可以使用其它浓度。在发酵池中用于处理经发酵的醪液的稳定的氧化剂的 浓度与用于在发酵容器中基于发酵醪液所指出的水平相同或相似，或可以为 其它浓度。用于处理循环至发酵罐的生产用水(诸如，作为循环的稀釜馏物、 循环的洗涤器流出物和/或循环的来自酒糟干燥的经冷凝的蒸气)的非氧化型 杀生物剂的浓度，可以与在发酵容器中基于发酵醪液所指出的水平相同或相 似，或可以为其它浓度。
作为选择，本发明的任何过程或组合物可以包括一种或多种抗菌肽，例 如多环抗菌肽，诸如乳酸链球菌肽。该肽(一种或多种)可以以任何量存在， 诸如约0.01ppm~500ppm或更多，其中该量可以是在发酵(例如，在发酵罐中) 开始时存在的浓度，或者可以基于向该过程添加的总组合物的重量。作为选 择，一种或多种多环抗菌肽可以以如下重量比例存在：(多环抗菌肽)比(非氧 化杀生物剂和/或稳定的氧化剂)的重量比为1:2~1:1,000、诸如1:5~1:500、或 1:10~1:250、或1:20~1:200、或1:30~1:100、或1:40~1:100、或1:50~1:150、 或在这些范围内或这些范围外的其它比例。
作为选择，如本文所述当一种或多种多环抗菌肽与一种或多种杀生物剂 结合时，可以在防止或控制细菌方面提供协同的效果，尤其是针对乳杆菌属 细菌。换言之，该组合对于防止或控制微生物腐败或污染乙醇发酵系统或过 程可以是有效地，尤其是以协同的方式有效，诸如本文所列举的。
本发明的方法可以在参考本发明进行简单改进的传统乙醇生产工厂中 实施。参考图3，显示了基于干磨过程的乙醇生产工厂(100)，其中可以通过 改变使用本发明的方法。谷类可以被递送至乙醇工厂，在其中谷类可以被装 载至储存仓(101)中，该储存仓被设计为可以盛放供给工厂至少一个生产循环 的足够的谷类。可以筛选谷类并除去杂质，并被研磨成粗粉末，诸如通过研 磨(102)。然后可以对粉末进行蒸煮并使其液化。在蒸煮过程(103)中，物理 和化学地准备了粉末中的淀粉用于发酵。经研磨的谷类可以与生产用水混 合，可以将pH调节为酸性pH，诸如约5.5~约6.0，并可以添加α-淀粉酶。 可以将浆料加热至约180–190°F，并加热30~45分钟以降低粘度。得到的浆 料可以被泵送通过约221°F的压缩的喷射蒸煮器(104)，并保持在其中约5 分钟。然后通过大气压或真空快速冷凝器冷却该混合物。在快速冷凝冷却之 后，可以在液化罐中保持该混合物约1~2小时，在约180–190°F，以为α-淀 粉酶提供时间以分解淀粉为短链糊精。在调节pH和温度后，可以添加第二 种酶、葡糖淀粉酶至混合物，并将其泵送至发酵罐。一旦进入发酵罐，混合 物即被称为醪液(mash)。葡糖淀粉酶将糊精分解为适合发酵反应的简单的 糖。对于发酵(106)，添加酵母以将糖转化为乙醇和二氧化碳。在第一发酵罐 中，非氧化型杀生物剂与醪液结合。取决于特定的试剂，可以改变非氧化型 杀生物剂或稳定的氧化剂的量。添加的量可以有效地消除或控制存在的感染 工厂的细菌，或防止细菌的爆发，而不会减少酵母。在约70°F~约115°F、 或约80°F~约100°F，可以使得醪液发酵约24~60小时，得到含有最高至约 15%乙醇以及来自谷类和添加的酵母的固体的混合物。此外，在pH5.6~6.0 开发酵母发酵可能会导致微生物污染的更大风险，可以使用例如稀释的酸 (例如硫酸)，将液化之后的pH下调节至pH低于5.0。可以将经发酵的醪液 泵送至蒸馏单元(注意多柱蒸馏系统)，其中为了蒸馏(107)可以添加额外的 热。可以使用一个或多个发酵池(126)作为储存器以储存经发酵的醪液，作为 蒸馏柱的进料源。蒸馏柱可以利用乙醇和水的沸点的差异从而沸腾以分离乙 醇。在当产品流可以离开蒸馏柱时，其可以含有约95体积%的乙醇 (190-proof(标准酒精度))。来自该过程的剩余物(被称作釜馏物)含有不可发酵 的固体和水，其可以从柱的底部被泵送至离心或其它过滤装置。190-proof 乙醇仍含有约5%的水。其可以通过分子筛(108)基于水和乙醇分子大小不同， 以物理地从乙醇中分离剩余的水，或以其它传统的方式进一步处理以从乙醇 中分离水分。该步骤可以制备200-proof无水(不含水)乙醇。在乙醇被输送至 储存罐(110)之前，可以添加少量的变性剂(109)，以使其适合人类使用。燃 料乙醇(111)不含杀生物剂或抗生素。在乙醇生产过程中，制备了两个商业上 有价值的副产品：二氧化碳和酒糟。随着酵母发酵糖，它们释放大量二氧化 碳气体(112)，以及其它发酵气体，诸如挥发性有机物和水蒸气。如所示的， 二氧化碳可以作为直接排放的二氧化碳(112)被释放到大气中(作为一个选 择)，或二氧化碳(112A)可以在释放或捕获前被洗涤器(123)纯化(作为另一选 择)。可以使用洗涤器(123)从发酵气体中除去挥发性有机物(包括，例如乙醇)。 洗涤器与发酵气体(通常大部分为二氧化碳)和水(125)接触以除去污染物并 回收否则可能会由于从发酵罐蒸发而损失的乙醇。可以循环来自洗涤器(123) 的含水流出物作为用于发酵的生产用水的来源。如所示的，如果循环作为发 酵的水源，在重新引入到过程系统之前，任选利用非氧化型杀生物剂和/或 稳定的氧化剂处理洗涤器流出物(124)。任选来自洗涤器的经纯化的二氧化碳 被捕获，并被市售至食品加工厂以用于碳酸饮料和速冻用途。来自蒸馏罐底 部的釜馏物(113)(例如，整个釜馏物)含有来自谷类和添加的酵母的固体，以 及来自在过程中添加水的液体。可以将其输送至离心装置(114)以分成稀釜馏 物(115)(具有约5~10%固体的液体)和可以被加工成酒糟的含固体部分(116)。 部分稀釜馏物(115)可以被循环至蒸煮/浆料罐作为补充水，减少蒸煮过程所 需的新鲜水的量。如所示的，如果循环作为发酵的水源，在重新引入到过程 系统之前，任选利用非氧化型杀生物剂和/或稳定的氧化剂处理稀釜馏物 (115)。向浆料中添加稀釜馏物经常会使浆料的pH调节成为必须步骤。例如， 当研磨的全部磨碎玉米颗粒用作含淀粉材料并与水混合时，浆料的pH可以 为例如约pH 5.8~约pH 6.2。但由于添加稀釜馏物可以将浆料的pH降低至约 pH 4.8~pH 5.2，这可能会使糖化试剂不稳定。因此，当再利用液体釜馏物时， 可以使用合适的碱(例如，氢氧化钠或氢氧化钙、碳酸钠或碳酸铵)将浆料的 pH调节至约pH 5.6~6.0。釜馏物的剩余部分(117)可以被输送通过多作用蒸 发系统(118)，在其中可以浓缩形成浆液(例如，25-50%固体)(119)。然后该 浆液(蛋白质和脂肪含量高)可以再次与含固体部分(116)混合，以提供湿酒糟 (WDG)(120)。具有添加的浆液，WDG仍含有大量有营养价值的初始原料， 以及添加的酵母，因此，这使其可以作为本地饲育场和牛奶场的良好的家畜 饲料(livestock ration)，或作为其它类型的动物饲料。在添加浆料之后，可以 将其运送至湿饼垫(wet cake pad)作为WDG(120)，其可以位于其上并用于运 输。许多乙醇工厂没有足够邻近的牲畜利用全部的WDG。为了避免腐败， WDG通常在制备后迅速使用。因此，通常将其输送至干燥系统(121)以很粗 去湿分从而延长其保存期限。可以用于该方面的通常的干燥操作包括在100 ~250psia压力的间接流，或热烟道气以提供用于干燥的热。可以诸如使用冷 凝器(128)(例如，热交换器)来冷凝在干燥器中产生的蒸气(127)以形成含水副 产品，或任选地蒸气(127)可以被释放到大气中(未示出)。如所示的，经冷凝 的蒸气(129)可以用作用于发酵系统的循环的生产用水，例如用作发酵容器 (一个或多个)的水源。还如所示的，如果循环作为发酵的水源，在重新引入 到过程系统之前，任选利用非氧化型杀生物剂和/或稳定的氧化剂处理经冷 凝的蒸气(129)。得到的具有可溶物质的干酒糟(DDGS)(122)通常用作动物饲 料(诸如牛、猪、家禽和鱼类的饲料)中的高蛋白质成分。尽管参照图3可以 用作连续或半连续过程，本发明的乙醇发酵过程还可以以分批的方式进行。
作为另外的说明，二溴次氮基丙酰胺(例如，2,2-二溴-3-次氮基丙酰胺) 或其它二卤代次氮基丙酰胺可以用作用于乙醇发酵过程中细菌控制的抗生 素备选物，诸如如图1、2和3所示的那些，尽管不仅限于此。2,2-二溴-3- 次氮基丙酰胺(DBNPA)的商业来源包括例如：20，其可以商购自 Buckman Laboratories International,Inc.,Memphis TN。在发酵过程中，可以 在罐中稀释DBNPA(搅拌的)，其中发酵在约90-95°F发生约24~48小时。 DBNPA的处理率为约50ppm~约500ppm、或约100ppm~约200ppm(如产物基 于活性成分)，或其它范围，可以控制发酵过程中的乳杆菌，而不会影响酵母 (一种或多种)，使得抗生物活性不会在DDGS中结束。该发酵过程可以涉及 例如，每一生产批次约600,000~约一百万加仑的过程材料。然后将发酵物泵 送至“发酵池”约2~3小时，该时间可以长至约20小时，在发酵池中，约105°F 条件，然后对其进行蒸馏。优选将DBNPA添加至第一发酵罐(如果使用多个 罐)，并且使该活性成分反应，然后花费约24~48小时分解。DBNPA可以被 直接引入第一发酵罐，或通过示出的循环的生产用水，或其它方法引入。可 以利用DBNPA处理发酵池中的经发酵的醪液和/或与经发酵的醪液接触的发 酵池的部分(例如，内罐壁)。在发酵池中用于处理经发酵的醪液的DBNPA的 浓度可以与所示出的在发酵罐中使用的水平相似。
基于实验室工作，在发酵罐中的添加下，期待DBNPA保持完整约1~2 小时。对蒸馏的釜馏物(即发酵的未蒸发产品)(“发酵罐”后)进行离心、并干燥 (例如，在约250-300°F约1小时)，然后，将该混合物泵送至最终的罐中，在 其中该混合物被称作DDGS。DDGS占初始玉米原料的约1/3质量。不期望 DBNPA的化学性质可以持续并保持到成为具有可溶物质的干酒糟(DDGS) 阶段之前的离心和干燥加热。在玉米-至-乙醇过程中，例如，期望DBNPA被 降解为二氧化塘和水蒸气，这样对于环境的影响较小。基于实验结果，DBNPA 杀灭细菌(乳杆菌)，但是不杀灭涉及发酵的酵母，相信DBNPA也不会被带入 DDGS。DBNPA的应用避免使用抗生素(其可以在整个过程中保持稳定)。 DBNPA的使用使得不必须使用抗生素。使用DBNPA是更为经济划算的，因 为抗生素(作为唯一被广泛使用的处理)的成本是相对较高的，并且导致发酵成 本升高。另外，DBNPA能够提高乙醇产率，与未处理染菌的经发酵的醪液相 比，例如提高约0.5重量%~约5重量%、或约1重量%~约4重量%、或约1 重量%~约3.5重量%、或约1.25重量%~约2.5重量%、或约2重量%~约3 重量%，或其它增加，上述提高对于处理程序而言是显著的效果。
本发明可以提供例如，不使用抗生素的从生物质到燃料级醇的转变，该 醇可以与无铅汽油混合以生产“含酒精汽油”燃料或其它燃烧燃料。本发明 的方法还可以用于生产食物级乙醇。如本文所述，使用标准的实验室技术确 认了如本文所示的在发酵过程中的非抗生素杀生物剂意想不到的活性。
本发明包括以任何顺序的下述方面/实施方式/特征和/或它们任何组合：
1.本发明涉及通过发酵生产乙醇的方法，包括：
a)在容器中存在至少一种非氧化型杀生物剂和酵母的情况下，发酵可经 发酵的醪液以生产乙醇和固体成分，其中在醪液中所述非氧化型杀生物剂控 制细菌的生长而不会减少酵母种群；以及
b)蒸馏经发酵的醪液以从所述固体成分中分离至少部分乙醇。
2.根据任何上述或下述实施方式/特征/方面的方法，还包括：
从含有小于约100ppm的非氧化型杀生物剂的所述固体成分中获得干酒 糟产品。
3.根据任何上述或下述实施方式/特征/方面的方法，其中步骤(b)中的 经发酵的醪液含有10ppm以下的抗生素。
4.根据任何上述或下述实施方式/特征/方面的方法，其中在蒸馏之后， 步骤b)中的所述经发酵的醪液中存在小于约10ppm的非氧化型杀生物剂。
5.根据任何上述或下述实施方式/特征/方面的方法，其中在蒸馏之后， 步骤b)中的所述经发酵的醪液中存在小于约1的非氧化型杀生物剂。
6.根据任何上述或下述实施方式/特征/方面的方法，其中，细菌为乳杆 菌属细菌(Lactobacillus sp.)、醋杆菌属细菌(Acetobacter sp.)或它们的组合。
7.根据任何上述或下述实施方式/特征/方面的方法，其中，细菌为专性 厌氧菌。
8.根据任何上述或下述实施方式/特征/方面的方法，其中，步骤(a)中的 经发酵的醪液与在不存在非氧化型杀生物剂的条件下发酵的相同经发酵的 醪液相比，具有至少约5-倍小的乳酸，以重量%计。
9.根据任何上述或下述实施方式/特征/方面的方法，其中，步骤(a)中的 经发酵的醪液与在不存在非氧化型杀生物剂的条件下发酵的相同经发酵的 醪液相比，具有至少约5-倍小的乙酸，以重量%计。
10.根据任何上述或下述实施方式/特征/方面的方法，其中，非氧化型 杀生物剂为2,2-二溴-3-次氮基丙酰胺、二硫氰酸亚甲基酯、2-(硫氰基甲基- 硫代)苯并噻唑、氰基亚胺基二硫代甲酸盐、N-甲基二硫代氨基甲酸盐、聚[氧 亚乙基(二甲基亚氨基)-亚乙基(二甲基亚氨基)亚乙基二盐酸盐、四羟甲基硫 酸鏻、1,1,1-三(羟甲基)硝基甲烷、戊二醛、1,5-戊二醛、烷基苄基氯化铵、 2-溴-2-硝基-丙烷-1,3-二醇、二癸基二甲基氯化铵、二甲基二硫代氨基甲酸 盐、盐酸十二烷基胍、1,2-苯并异噻唑啉-3-酮、5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3- 酮、2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮、正辛基异噻唑啉酮、二氯-正辛基异噻唑啉酮、 溴硝基苯乙烯或四氢-3,5-二甲基-2H-1,3,5-噻二嗪-2-硫酮、或它们的任意组 合。
11.根据任何上述或下述实施方式/特征/方面的方法，其中非氧化型杀 生物剂是二卤代次氮基丙酰胺。
12.根据任何上述或下述实施方式/特征/方面的方法，其中非氧化型杀 生物剂是2,2-二溴-3-次氮基丙酰胺。
13.利用发酵生产乙醇的方法，包括：
a)在容器中存在至少一种稳定的氧化剂和酵母的情况下，发酵可经发酵 的醪液以生产乙醇和固体成分，其中在培养中所述稳定的氧化剂控制细菌的 生长而不会减小酵母种群；以及
b)蒸馏经发酵的醪液以从经发酵的醪液的固体成分中分离至少部分乙 醇。
14.根据任何上述或下述实施方式/特征/方面的方法，还包括：
从含有小于约100ppm的稳定的氧化剂的所述固体成分中获得干酒糟产 品。
15.根据任何上述或下述实施方式/特征/方面的方法，其中稳定的氧化 剂是稳定的次氯酸、稳定的次氯酸盐、稳定的氯胺、稳定的次溴酸(例如溴 氨基甲酸盐)、稳定的二氧化氯、稳定的过氧乙酸、碘、稳定的碘产品、缓 释氯三酮三氯均三嗪三酮钠、缓释二氯均三嗪三酮钠、缓释氯三酮、缓释三 氯均三嗪三酮钠、稳定的氯乙内酰胺、稳定的溴乙内酰胺或稳定改性的乙内 酰胺、或它们的任意组合。
16.根据任何上述或下述实施方式/特征/方面的方法，其中步骤(b)中的 经发酵的醪液含有10ppm以下的抗生素。
17.根据任何上述或下述实施方式/特征/方面的方法，其中步骤b)中的 所述经发酵的醪液在蒸馏之后含有约10ppm的稳定的氧化剂。
18.根据任何上述或下述实施方式/特征/方面的方法，其中步骤b)中的 所述经发酵的醪液在蒸馏之后含有约1ppm稳定的氧化剂。
19.根据任何上述或下述实施方式/特征/方面的方法，其中细菌为乳杆 菌属细菌(Lactobacillus sp.)、醋杆菌属细菌(Acetobacter sp.)、或它们的任意 组合。
20.根据任何上述或下述实施方式/特征/方面的方法，其中细菌为专性 厌氧菌。
21.根据任何上述或下述实施方式/特征/方面的方法，其中步骤(a)中的 经发酵的醪液与在不存在稳定的氧化剂的条件下发酵的相同经发酵的醪液 相比，具有至少约5-倍小的酸，以重量%计，其中酸为乳酸或乙酸。
22.利用发酵生产乙醇的方法，包括：
a)在如下条件下在容器中提供可经发酵的醪液、至少一种非抗生素杀生 物剂和至少一种酵母作为混合物，在该所述条件下发酵醪液产生乙醇，以及 在醪液中至少一种非抗生素杀生物剂控制细菌的生长而不会杀灭酵母，其中 非抗生素杀生物剂是非氧化型杀生物剂、稳定的氧化剂、或其组合；
b)蒸馏经发酵的醪液以从经发酵的醪液的固体成分中分离至少部分乙 醇。
23.利用发酵生产乙醇的方法，包括：
a)在容器中存在至少一种酵母的情况下，发酵可经发酵的醪液以生产乙 醇和固体成分；
b)在存在至少一种非氧化型杀生物剂的至少一个发酵池中储存至少部 分经发酵的醪液，其中在至少一个发酵池中非氧化型杀生物剂控制细菌的生 长；以及
c)从至少一个发酵池向至少一个蒸馏单元进料储存的醪液；
d)在至少一个蒸馏单元中蒸馏经发酵的醪液以从固体成分中分离至少 部分乙醇。
24.生产乙醇的方法，包括：
a)在发酵罐容器中存在酵母和循环的生产用水的情况下，发酵可经发酵 的醪液以生产包括乙醇和固体成分的经发酵的醪液；
b)任选利用含水溶液洗涤来自发酵罐容器的气体释放，并向发酵罐容器 中循环至少部分洗涤器出口溶液；
c)任选在至少一个发酵池中储存至少部分经发酵的醪液；
d)向蒸馏单元中进料经发酵的醪液；
e)在蒸馏单元中蒸馏经发酵的醪液以从釜馏物中分离至少部分乙醇；
f)将釜馏物分成含液体部分和含固体部分；
g)任选向发酵罐容器中循环至少部分f)的含液体部分；
h)回收f)的含固体部分至少部分作为湿酒糟产品和/或干燥至少部分含 固体部分以生产干酒糟产品和蒸发的蒸气；
i)任选冷凝h)的蒸发的蒸气并且向发酵罐容器中循环至少部分经冷凝的 蒸气，以及
其中，在向发酵罐容器中循环水源之前，非氧化型杀生物剂和/或稳定 的氧化剂被添加至或其存在于b)的洗涤器出口溶液的经循环的水、来自f) 的釜馏物分离的含液体部分、来自i)的酒糟干燥的经冷凝的蒸气、或它们的 任意组合中的至少一种来源中。
25.生产乙醇生产的干酒糟副产品的方法，包括：
a)在发酵罐容器中存在酵母的情况下，发酵可经发酵的醪液以生产包括 乙醇和固体成分的经发酵的醪液；
b)任选利用含水溶液洗涤来自发酵罐容器的气体释放，并向发酵罐容器 中循环至少部分洗涤器出口溶液；
c)任选在至少一个发酵池中储存至少部分经发酵的醪液；
d)向蒸馏单元中进料经发酵的醪液；
e)在蒸馏单元中蒸馏经发酵的醪液以从釜馏物中分离至少部分乙醇；
f)将釜馏物分成含液体部分和含固体部分；
g)任选向发酵罐容器中循环至少部分f)的含液体部分；
h)干燥至少部分含固体部分回收f)的含固体部分以生产干酒糟产品和 蒸发的蒸气；
i)任选冷凝h)的蒸发的蒸气并且向发酵罐容器中循环至少部分经冷凝的 蒸气，以及
其中用于在发酵容器中控制细菌的非氧化型杀生物剂和/或稳定的氧化 剂被添加至或存在于发酵罐容器、发酵池和循环的水源、或它们的任意组合 中的至少一种中。
26.根据任何上述或下述实施方式/特征/方面的方法，还包括获得含有 小于约100ppm非氧化型杀生物剂和/或稳定的氧化剂的干酒糟产品。
27.根据任何上述或下述实施方式/特征/方面的方法，其中所述发酵还 在存在至少一种抗菌肽的情况下发生。
28.根据任何上述或下述实施方式/特征/方面的方法，其中所述发酵还 在存在至少一种多环抗菌肽的情况下发生。
29.根据任何上述或下述实施方式/特征/方面的方法，其中在发酵生产 乙醇的过程中和/或发酵生产乙醇之后，所述非氧化杀生物剂和所述多环抗 菌肽在至少一种细菌的杀生控制方面是协同作用的。
30.一种组合物，包括至少一种非氧化杀生物剂和至少一种多环抗菌 肽。
31.根据任何上述或下述实施方式/特征/方面的组合物，其中在发酵生 产乙醇的过程中，所述非氧化杀生物剂和所述多环抗菌肽以在控制至少一种 细菌方面协同作用的量存在。
32.根据任何上述或下述实施方式/特征/方面的组合物，其中所述非氧 化杀生物剂是2-溴-2-硝基丙烷-1,3二醇或2,2-二溴-3-次氮基丙酰胺或其卤化 物类似物。
本发明可以包括这些在文字和/或附图中描述的上述和/或下述多个特征 或实施方式的任何组合。本文所描述的特征的任何组合被认为是本发明的一 部分并且不意在限定为该组合特征。
下面的实施例意在说明，而不意在限制本发明。在下述实施例中，除非 另有说明，所有份是指重量份。
实施例
实施例1
进行实施例以评估非氧化型杀生物剂作为控制乙醇发酵中乳杆菌属细 菌染菌的抗微生物试剂的效应。非氧化型杀生物剂为20(20%2,2- 二溴-3-次氮基丙酰胺)。乳杆菌为植物乳杆菌。酵母为酿酒酵母。使用了含 有约30%(w/w)干固体的玉米醪液。
实验步骤
为了浆料制备，通过测量由于干燥导致的质量损失，来利用湿分平衡测 定磨碎的玉米的湿分的重量。对于每个重复，确认了用于制备160g玉米浆 料(总干固体浓度为30%(w/w))所需要的玉米、去离子(DI)水、和酶的量。对 于每种处理，如下制备了三个独立的重复的浆料：向标记的Labomat烧杯中 称量所需量的DI水，然后添加所需质量的玉米粉末。稀释α-淀粉酶 (Liquozyme SC DS,Novozymes)以保证向每个烧瓶中传递更为精确量的酶。 使用了0.13-g/ml的α-淀粉酶工作溶液，并且以基于玉米的湿重的0.02%(w/w) 的剂量添加。在所有成分均处于Labomat烧杯内之后，手动旋转该浆料。密 封该烧杯并附着在垂直安装在Labomat(Model BFL12 805,Mathis, Switzerland)中的轮上，其在温育过程中以50rpm旋转。设置该轮每50秒反 转方向以提高混合效率。通过在83°C温育90分钟来液化该样品，然后在 Labomat中将该样品冷却至40°C。
为了发酵，将醪液冷却，并将每个Labomat烧杯中的全部成分(约160g) 转移至无菌的250-ml Erlenmeyer烧瓶中。记录醪液和烧瓶的质量，并计算 出转移至发酵烧瓶的醪液的质量。通过添加150μl的10N硫酸将醪液的pH 调剂至<5.2。然后在培养箱/摇床(Sartorius,Certomat BS-1)中，在32°C以 170rpm的速度旋转烧瓶，直到完成所有醪液的制备。
添加到发酵烧瓶中的所有的酶、营养成分、和其它添加物质均在使用前 新鲜制备。制备0.2-g/ml溶液的酵母营养成分(AYF1177;Ethanol Technology, Milwaukee,WI)，使用1500ppm(w/w，基于玉米的湿重)的剂量。添加尿素(以 无菌的0.2-g/ml溶液的形式)使得氮的终浓度为500ppm(w/w，基于醪液的总 质量)。制备0.25-g/ml溶液的葡糖淀粉酶(Spirizyme Fuel,Novozymes)，并以 0.015%(w/w，基于玉米的湿重)的剂量添加。
通过在100-ml MRS醪液中生长整天来制备用于接种的植物乳杆菌培养 物。通过在MRS醪液中的植物乳杆菌的生长曲线数据，来确定在玉米醪液 中使初始浓度为107CFU/ml所需的培养物的量。如下来确定细菌的初始浓 度：通过在含放线菌酮的MRS琼脂上平板培养逐级稀释的培养物，且在对 菌落进行计数前，在32°C温育2天。向发酵烧瓶中接种0.5ml该植物乳杆 菌培养物，该植物乳杆菌培养物的细菌细胞浓度为2x109CFU/ml。这使得 初始浓度为6x106CFU/ml，该浓度稍低于目标浓度，但是对于本研究的目 的而言是足够的。
在接种细菌之后，利用经灭菌的发酵网(trap)填充发酵烧瓶，并且在 170rpm的摇动速度下在32°C温育1小时。该过程模拟了通常在发酵罐填充 开始和在实际大小的燃料乙醇工厂用酵母接种之间的通常的时间。
在无菌的250ml烧瓶中制备0.2-g/ml的酵母悬浮液(酿酒酵母；Ethanol Red；Fermentis,Marcq-en-Baroeul,France)。在接种到发酵烧瓶之前，在40°C 温育并混合该混合液20分钟。用160μl酵母悬浮液接种每个发酵烧瓶以使 得初始浓度为107个酵母细胞/ml。在利用细菌的初始1小时温育后，利用酵 母接种烧瓶并投入20。在本研究中使用的处理(细菌和 20投加)是用于研究20控制在如表1所示的燃料乙醇 发酵中由乳酸细菌引起的染菌的效应。
表1
在进行所有添加之后，记录每个烧瓶的质量，并将无菌的发酵网重新填 充到每个烧瓶中。还记录了放置有网的每个烧瓶的质量。该烧瓶在32°C， 并在170rpm的摇动速度的培养箱/摇床(Sartorius,Certomat BS-1)中温育61 小时。在整个发酵过程中，定期测量放置有网的每个烧瓶的质量，以评估发 酵的速率(当由于鼓泡二氧化碳从发酵网中损失时，发酵烧瓶的质量下降)。
在温育61小时之后，称量移出网之前和之后的每个烧瓶的质量。一边 手动摇动，一边从每个样品中抽吸1.0ml的醪液，并转移到含有9.0ml 0.05M 磷酸缓冲液的试管中。然后将这些样品连续地稀释以获得105~107的稀释因 子。将100微升最高三个稀释液的每一个平铺在MRS琼脂上以评估每个烧 瓶中的植物乳杆菌的最终浓度。在试图对菌落进行计数之前，将平板在32°C 温育2天。
利用上方的搅拌器混合每个烧瓶，并且收集样品用于下述测量：酵母细 胞计数、基质的终浓度(葡萄糖、DP2、DP3、和DP4+，其中“DPx”表示具有 “x”个亚单元的葡萄糖寡聚物)、发酵产物(乙醇、甘油、乳酸和乙酸)、总干 固体、以及溶解的干固体和发酵物液相密度。使用标准操作步骤进行所有的 测量。通过在去离子水中以100稀释因子稀释以制备用于酵母细胞计数的样 品，并且利用亚甲蓝染色以评估活性，然后使用血细胞计数器来进行显微计 数。通过HPLC来确定底物和发酵产物的终浓度。通过离心(8,000xg，3分 钟)来除去大的固体并随后利用0.45μm注射器式过滤器过滤以制备用于 HPLC的样品，利用硫酸酸化至0.01N的终浓度。基于在105°C干燥3小时 过程中的质量损失，来通过重量测定总固体和溶解的固体的浓度。通过离心 并随后利用0.45μm注射器式过滤器过滤上清液以制备用于测量溶解固体和 液相密度的样品。利用Anton-Parr光密度计测定发酵物液相密度。
图4示出了所有处理的发酵速率。其中一个明显的区别在于染菌对照 (IC)，与其它处理相比，其显示出较少的总质量损失。这完全由于一个发酵 烧瓶，但是其影响通过IC处理相对与其它处理较大的误差棒所表示。因此， 最终质量损失上的不同不能认为是统计上显著的。还可以观察到在约16小 时之后，对于两个最高的20剂量，质量损失似乎稍有降低。尽 管这些差异是可以再现的并且是统计上显著的，但其似乎不太重要，因为在 24小时(其仅为工业标准温育时间的约一半)之后，这两个处理的质量损失与 无染菌对照(IFC)是相同的。
每个处理的乳酸终浓度和乙醇产率如图5和6所示。变量分析(ANOVA) 显示在两个端点处理之间存在显著差异。包括比较处理所有可能的处理对， 使用针对成对比较的Tukey’s检验来鉴定显著性差异，且该差异通过在每个 图中的每个柱上的符号标记来显示。标记有相同字母的任何处理表示彼此之 间无显著差异。
如图5所示，在最终乳酸浓度方面观察到了明显差异。在IFC中观察到 最低乳酸浓度以及在IC中出现最高值。例如，如染菌对照(IC)利用植物乳杆 菌感染玉米醪液并且无非氧化型杀生物剂的情况，与无染菌对照(IFC)相比， 乳酸的终浓度提高近14倍。在所有剂量均产生20减少乳酸的量， 并且明显具有剂量-响应关系。最低乳酸浓度在利用20的 200-ppmv剂量处理染菌的玉米醪液的情况下观察到，该浓度仅稍高于在无 染菌对照(IFC)中观察到的浓度(0.11±0.01g/100ml比IFC的0.06±0.003 g/100ml)。在“Bronam-200”和IFC处理中终乳酸浓度的差异是统计上显著的： P=0.012(其中P是两个浓度相同的概率)。即使在最高剂量20 也无法完全消除乳酸终浓度的升高可能是由于在接种乳酸细菌和添加抗微 生物化合物之间的1小时温育期所导致的。
在乙醇产率方面观察到的差异被认为是统计上显著的，并且其方式与图 5示出的趋势是一致的。IC的乙醇产率明显低于所有其它处理的乙醇产率， 除了“Bronam-50”处理之外。相对于无染菌对照(IFC)，在染菌对照(IC)中利 用植物乳杆菌感染，降低了乙醇产率约2%。相对于染菌对照(IC)，在所有 测试的剂量水平上20的添加降低了细菌感染的影响，并且在至 少为100ppmv的浓度，相对于染菌对照(IC)，细菌感染的影响被完全消除。 利用“Bronam-20”，例如相对于染菌对照(IC)，发现乙醇产率提高了2.6%。
本研究的结果显示20能够在对于用于燃料乙醇工业的发酵 是通常的发酵条件下控制植物乳杆菌感染。当含有30%(w/w)玉米干固体的 醪液被植物乳杆菌感染时，乳酸浓度提高超过10-倍(由0.06%升高至0.76%， w/v)以及乙醇产率降低2%。在至少100ppm的浓度，利用20处 理完全消除了细菌感染对于乙醇产率的影响，并且相对于染菌对照(IC)，降 低乳酸终浓度80%或更高。
基于本研究的结果，显示非氧化型杀生物剂，诸如20可以 控制在玉米发酵过程中的细菌染菌，而不会杀灭对于燃料乙醇生产中的发酵 是非常重要的酵母。进一步考虑这些结果，相信针对在燃料乙醇发酵中控制 细菌感染方面，非氧化型杀生物剂，诸如20提供了抗生素的有 价值的备选物。
实施例2
制备了乳杆菌MRS醪液(25%强度)并且向试管中分装10ml的量，并在 121°C高压灭菌20分钟。向试管中添加期望浓度的杀生物剂，然后向每个 试管中添加100微升的Lactobacillus fermentans的过夜醪液，并且在37°C温 育24小时。
在该实施例中，使用上述方法，通过检测在一系列检测中的乳酸链球菌 肽(命名为成分A)与2-溴-2-硝基丙烷-1,3-二醇(命名为成分B)的组合(改变比 率和相对于细菌Lactobacillus fermentans的浓度范围)显示了协同效应。结果 如下所示。
通过Kull,E.C.,Eisman,P.C.,Sylwestrwicz,H.D.和Mayer,R.L.1961, Applied Microbiology,9:538-541所描述的方法来表征协同，其中：
QA/Qa+QB/Qb小于1。
Qa=以ppm表示的化合物A的浓度，单独作用，其产生端点；
Qb=以ppm表示的化合物B的浓度，单独作用，其产生端点；
QA=以ppm表示的化合物A的浓度，在混合物中，其产生端点；
QB=以ppm表示的化合物B的浓度，在混合物中，其产生端点；
当QA/Qa和QB/Qb的和大于1时，表示拮抗作用，当和为1时，表示加 和作用。当该值的和小于1时，出现协同。
在上表中，可以看出，针对不同的组合，乳酸链球菌肽和2-溴-2-硝基 丙烷-1,3-二醇的组合提供了协同结果。该效应对于在生产乙醇的发酵之前或 发酵过程中控制细菌是非常有用的。
实施例3
在该实施例中，使用上述方法，通过检测在一系列检测中的乳酸链球菌 肽(命名为成分A)与2,2-二溴-3-次氮基丙酰胺(命名为成分B)的组合(改变比 率和相对于细菌Lactobacillus fermentans的浓度范围)显示了协同效应。结果 如下所示。
在上表中，可以看出，针对不同的组合，乳酸链球菌肽和2,2-二溴-3- 次氮基丙酰胺的组合提供了协同结果。该效应对于在生产乙醇的发酵之前或 发酵过程中控制细菌是非常有用的。
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