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1、(10)申请公布号 CN 102585275 A (43)申请公布日 2012.07.18 CN 102585275 A *CN102585275A* (21)申请号 201210101517.0 (22)申请日 2012.03.31 C08J 9/26(2006.01) C08J 9/36(2006.01) C08L 5/08(2006.01) C12M 3/00(2006.01) (71)申请人 上海理工大学 地址 200093 上海市杨浦区军工路 516 号 (72)发明人 李琳 刘宝林 韩宝三 李维杰 (74)专利代理机构 上海新天专利代理有限公司 31213 代理人 王敏杰 (54)。
2、 发明名称 一种多孔壳聚糖支架的制备方法 (57) 摘要 本发明揭示了一种多孔壳聚糖支架的制备方 法， 所述方法包括 ： 先配制溶有设定量氯化铵的 壳聚糖酸溶液， 将该溶液注入模具中进行第一次 冷冻干燥， 再将冻干后的支架浸泡在氢氧化钠溶 液中设定时间， 用蒸馏水清洗支架， 再将支架进行 第二次冷冻干燥， 即可得到多孔壳聚糖支架。 本发 明多孔壳聚糖支架的制备方法， 可增大壳聚糖支 架的孔隙率和孔与孔之间的连通性。 (51)Int.Cl. 权利要求书 2 页 说明书 4 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 2 页 说明书 4 页 附图 1 。
3、页 1/2 页 2 1. 一种多孔壳聚糖支架的制备方法， 其特征在于， 所述方法包括 ： 先配制溶有设定量 氯化铵的壳聚糖酸溶液， 将该溶液注入模具中进行第一次冷冻干燥， 再将冻干后的支架浸 泡在氢氧化钠溶液中设定时间， 用蒸馏水清洗支架， 再将支架进行第二次冷冻干燥， 即可得 到多孔壳聚糖支架。 2. 根据权利要求 1 所述的多孔壳聚糖支架的制备方法， 其特征在于 ： 所述方法具体包括如下步骤 ： 步骤 S1、 溶液的配制步骤 ； 包括配制溶有设定量氯化铵的壳聚糖酸溶液、 配制 V/V 为 0.2-4的戊二醛溶液、 配制 2-15的硼氢化钠溶液、 配制 V/V 为 2-20的氢氧化钠溶液 ；。
4、 步骤 S2、 第一次冷冻干燥步骤 ； 量取步骤 S1 中所得的戊二醛溶液， 并加入到步骤 S1 中的溶有设定量氯化铵的壳聚糖 酸溶液中搅拌， 将搅拌后的溶液涂抹到模具上， 静置设定时间 ； 然后进行冷冻干燥 ； 步骤 S3、 第二次冷冻干燥步骤 ； 将步骤 S2 中的壳聚糖支架浸泡到所述氢氧化钠溶液中浸泡， 用去离子水清洗支架， 用 所述硼氢化钠除去游离的戊二醛， 再用大量的去离子水洗涤后， 再对壳聚糖支架进行冷冻 干燥， 最终得到多孔壳聚糖支架。 3. 根据权利要求 2 所述的多孔壳聚糖支架的制备方法， 其特征在于 ： 所述方法具体包括如下步骤 ： 步骤 S1、 溶液的配制步骤 ； 、 配。
5、制溶有设定量氯化铵的壳聚糖酸溶液 ； 先量取1ml醋酸加入100ml的容量瓶中定容， 制得V/V为1的醋酸溶液， 称取0.2g氯 化铵， 加入 V/V 为 1的醋酸溶液中搅拌均匀后， 再称取 3.0g 壳聚糖， 加入溶有氯化铵的 V/ V 为 1的醋酸溶液中即可 ； 、 配制 V/V 为 1的戊二醛溶液 量取 1ml 纯戊二醛并加蒸馏水定容至 100ml， 4保存备用 ； 、 配制 5的硼氢化钠溶液 称取 5.0g 的硼氢化钠加入 100ml 的容量瓶中定容， 制得 5的硼氢化钠溶液 ； 、 配制 V/V 为 10的氢氧化钠溶液 称取 10.0g 氢氧化钠， 加入 100ml 的蒸馏水中 ； 。
6、步骤 S2、 第一次冷冻干燥步骤 ； 量取0.4ml步骤S1中所得的V/V为1的戊二醛溶液， 并加入到步骤S1中的溶有一定 量氯化铵的壳聚糖酸溶液中， 搅拌 5min 后， 将搅拌后的溶液涂抹到模具上， 静置过夜 ； 然后 进行冷冻干燥 ； 上述的冷冻干燥过程控制参数为 ： 预冻温度为 -75， 预冻时间为 30min ； 一次干燥的隔板温度为 -25， 时间为 24h， 得到壳聚糖支架 ； 步骤 S3、 第二次冷冻干燥步骤 ； 将步骤 S2 中的壳聚糖支架浸泡到 W/V 为 10的氢氧化钠溶液中， 浸泡 20min 后， 用去 离子水反复清洗支架 3 次， 用 5的硼氢化钠除去游离的戊二醛，。
7、 再用大量的去离子水洗涤 权 利 要 求 书 CN 102585275 A 2 2/2 页 3 后， 再对壳聚糖支架进行冷冻干燥， 最终得到多孔壳聚糖支架 ； 上述的冷冻干燥过程控制参数为 ： 预冻温度为 -60， 预冻时间为 35min ； 上述第二次冷冻干燥包括两次干燥 ： 一次干燥的隔板温度为 -20， 时间为 17h ； 二次 干燥的隔板温度为 10， 时间为 1.5-2h。 4. 根据权利要求 3 所述的多孔壳聚糖支架的制备方法， 其特征在于 ： 所述方法用到的壳聚糖脱乙酰度为 80-91。 5. 根据权利要求 3 所述的多孔壳聚糖支架的制备方法， 其特征在于 ： 先对壳聚糖支架进行。
8、冻干， 然后将含有氯化铵的壳聚糖支架浸泡在 NaOH 溶液中， 使氯 化铵与 NaOH 反应生成氨气来制孔， 并可除去支架中多余的醋酸， 然后再对支架进行第二次 冷冻干燥， 以增大壳聚糖支架的孔隙率和孔与孔之间的连通性。 6. 根据权利要求 3 所述的多孔壳聚糖支架的制备方法， 其特征在于 ： 所述方法得到的 支架孔径为 20-60m， 孔隙率为 90。 权 利 要 求 书 CN 102585275 A 3 1/4 页 4 一种多孔壳聚糖支架的制备方法 技术领域 0001 本发明属于多孔材料制备技术领域， 涉及一种多孔壳聚糖支架， 尤其涉及一种多 孔壳聚糖支架的制备方法。 背景技术 0002 。
9、目前， 无论是实验室还是工业生产上， 所使用的细胞培养微载体主要是实心 Cytodex 系列的载体， 且属于单层单层培养方式。而在体内， 组织和细胞的生长发育过程是 在三维立体的内环境条件下进行的， 细胞和细胞基质以及细胞之间的相互信号传递对于调 解细胞的增殖、 分化有着重要影响， 常规的体外单层培养方法不能提供组织正常生长发育 所需的三维环境条件， 因而制备三维多孔支架就具有十分重要的意义。 0003 近年来， 在贴壁性细胞悬浮培养的研究领域， 壳聚糖支架材料的研究非常广泛。 然 而， 其制备方法往往仅限于常用的冷冻干燥法。传统的冷冻干燥法制备出的壳聚糖支架在 可塑性能、 微观结构及孔与孔之。
10、间的连通性均难以满足细胞培养的技术研究领域的要求。 0004 因此本领域迫切需要提供一种微观结构均匀、 易成型、 孔与孔之间连通性较好的 多孔壳聚糖支架材料。 发明内容 0005 本发明所要解决的技术问题是 ： 提供一种多孔壳聚糖支架的制备方法， 可增大壳 聚糖支架的孔隙率和孔与孔之间的连通性。 0006 为解决上述技术问题， 本发明采用如下技术方案 ： 0007 一种多孔壳聚糖支架的制备方法， 所述方法包括 ： 先配制溶有设定量氯化铵的壳 聚糖酸溶液， 将该溶液注入模具中进行第一次冷冻干燥， 再将冻干后的支架浸泡在氢氧化 钠溶液中设定时间， 用蒸馏水清洗支架， 再将支架进行第二次冷冻干燥， 。
11、即可得到多孔壳聚 糖支架。 0008 作为本发明的一种优选方案， 所述方法具体包括如下步骤 ： 0009 步骤 S1、 溶液的配制步骤 ； 0010 包括配制溶有设定量氯化铵的壳聚糖酸溶液、 配制 V/V 为 0.2-4的戊二醛溶液、 配制 2-15的硼氢化钠溶液、 配制 V/V 为 2-20的氢氧化钠溶液 ； 0011 步骤 S2、 第一次冷冻干燥步骤 ； 0012 量取步骤 S1 中所得的戊二醛溶液， 并加入到步骤 S1 中的溶有设定量氯化铵的壳 聚糖酸溶液中搅拌， 将搅拌后的溶液涂抹到模具上， 静置设定时间 ； 然后进行冷冻干燥 ； 0013 步骤 S3、 第二次冷冻干燥步骤 ； 001。
12、4 将步骤 S2 中的壳聚糖支架浸泡到所述氢氧化钠溶液中浸泡， 用去离子水清洗支 架， 用所述硼氢化钠除去游离的戊二醛， 再用大量的去离子水洗涤后， 再对壳聚糖支架进行 冷冻干燥， 最终得到多孔壳聚糖支架。 0015 作为本发明的一种优选方案， 所述方法具体包括如下步骤 ： 说 明 书 CN 102585275 A 4 2/4 页 5 0016 步骤 S1、 溶液的配制步骤 ； 0017 、 配制溶有设定量氯化铵的壳聚糖酸溶液 ； 0018 先量取 1ml 醋酸加入 100ml 的容量瓶中定容， 制得 V/V 为 1的醋酸溶液， 称取 0.2g 氯化铵， 加入 V/V 为 1的醋酸溶液中搅拌均。
13、匀后， 再称取 3.0g 壳聚糖， 加入溶有氯化 铵的 V/V 为 1的醋酸溶液中即可 ； 0019 、 配制 V/V 为 1的戊二醛溶液 0020 量取 1ml 纯戊二醛并加蒸馏水定容至 100ml， 4保存备用 ； 0021 、 配制 5的硼氢化钠溶液 0022 称取 5.0g 的硼氢化钠加入 100ml 的容量瓶中定容， 制得 5的硼氢化钠溶液 ； 0023 、 配制 V/V 为 10的氢氧化钠溶液 0024 称取 10.0g 氢氧化钠， 加入 100ml 的蒸馏水中 ； 0025 步骤 S2、 第一次冷冻干燥步骤 ； 0026 量取0.4ml步骤S1中所得的V/V为1的戊二醛溶液， 并。
14、加入到步骤S1中的溶有 一定量氯化铵的壳聚糖酸溶液中， 搅拌 5min 后， 将搅拌后的溶液涂抹到模具上， 静置过夜 ； 然后进行冷冻干燥 ； 0027 上述的冷冻干燥过程控制参数为 ： 预冻温度为 -75， 预冻时间为 30min ； 0028 一次干燥的隔板温度为 -25， 时间为 24h， 得到壳聚糖支架 ； 0029 步骤 S3、 第二次冷冻干燥步骤 ； 0030 将步骤 S2 中的壳聚糖支架浸泡到 W/V 为 10的氢氧化钠溶液中， 浸泡 20min 后， 用去离子水反复清洗支架 3 次， 用 5的硼氢化钠除去游离的戊二醛， 再用大量的去离子水 洗涤后， 再对壳聚糖支架进行冷冻干燥，。
15、 最终得到多孔壳聚糖支架 ； 0031 上述的冷冻干燥过程控制参数为 ： 预冻温度为 -60， 预冻时间为 35min ； 上述第 二次冷冻干燥包括两次干燥 ： 一次干燥的隔板温度为 -20， 时间为 17h ； 二次干燥的隔板 温度为 10， 时间为 1.5-2h。 0032 作为本发明的一种优选方案， 所述方法用到的壳聚糖脱乙酰度为 80-91。 0033 作为本发明的一种优选方案， 先对壳聚糖支架进行冻干， 然后将含有氯化铵的壳 聚糖支架浸泡在NaOH溶液中， 使氯化铵与NaOH反应生成氨气来制孔， 并可除去支架中多余 的醋酸， 然后再对支架进行第二次冷冻干燥， 以增大壳聚糖支架的孔隙率。
16、和孔与孔之间的 连通性。 0034 作为本发明的一种优选方案， 所述方法得到的支架孔径为 20-60m， 孔隙率为 90。 0035 上述所得的多孔壳聚糖支架的孔径为 20-60m， 孔隙率为 90， 且孔与孔之间的 连通性好。 0036 本发明的有益效果在于 ： 本发明提出的多孔壳聚糖支架的制备方法， 采用冷冻干 燥法和氯化铵致孔剂相结合的方法， 先配置溶有氯化铵的壳聚糖酸溶液， 形成均相溶液， 进 行缓慢冻干， 同时由冰晶升华来制孔， 然后将含有氯化铵的壳聚糖支架浸泡在 NaOH 溶液 中， 使氯化铵与 NaOH 反应生成氨气来制孔， 并且还可以除去支架中多余的醋酸， 然后再对 支架进行第。
17、二次冷冻干燥， 以增大壳聚糖支架的孔隙率和孔与孔之间的连通性。克服传统 制备壳聚糖支架孔隙率低， 连通性查的缺点， 并分别进行两次完整的冷冻干燥， 来调整孔隙 说 明 书 CN 102585275 A 5 3/4 页 6 结构， 得到孔隙率高， 连通性好的支架。 0037 本发明与现有技术相比较有以下突出优点 ： 0038 (1) 采用酸性致孔剂氯化铵来制备壳聚糖多孔支架， 且所得的支架易于成型， 孔隙 率高， 孔与孔之间的联通性好。并可用于细胞培养的技术研究。 0039 (2) 所得的支架孔径为 20-60m， 孔隙率为 90。 附图说明 0040 图 1 为本发明制备方法的流程图。 具体实。
18、施方式 0041 下面结合附图详细说明本发明的优选实施例。 0042 实施例一 0043 请参阅图 1， 本发明揭示了一种多孔壳聚糖支架的制备方法， 先配制溶有设定量氯 化铵的壳聚糖酸溶液， 将该溶液注入模具中进行第一次冷冻干燥， 再将冻干后的支架浸泡 在氢氧化钠溶液中设定时间， 用蒸馏水清洗支架， 再将支架进行第二次冷冻干燥， 即可得到 多孔壳聚糖支架。具体地， 所述制备方法包括如下步骤 ： 0044 (1)、 溶液的配制步骤 0045 、 配制溶有一定量氯化铵的壳聚糖酸溶液 0046 先量取 1ml 醋酸加入 100ml 的容量瓶中定容， 制得 1 (V/V， 体积比 ) 醋酸溶液， 称取。
19、0.2g氯化铵， 加入1(V/V)醋酸溶液中搅拌均匀后， 再称取3.0g壳聚糖， 加入溶有氯 化铵的 1 (V/V) 醋酸溶液中即可 ； 0047 、 配制 1 (V/V) 的戊二醛溶液 0048 量取 1ml 纯戊二醛并加蒸馏水定容至 100ml， 4保存备用 ； 0049 、 配制 5的硼氢化钠溶液 0050 称取 5.0g 的硼氢化钠加入 100ml 的容量瓶中定容， 制得 5的硼氢化钠溶液 ； 0051 、 配制 10 (W/V) 的氢氧化钠溶液 0052 称取 10.0g 氢氧化钠， 加入 100ml 的蒸馏水中即可 ； 0053 氯化铵的浓度会影响其与氢氧化钠反应时产生气体的量， 。
20、一般氯化铵的浓度越 高， 产生的氨气越多， 孔隙率就越高， 但是过多的气体含量， 会造成支架的机械强度降低， 因 而本发明中 0.2g 氯化铵的含量为最佳 ( 即氢氧化钠质量的约 2 )。在进行冻干时是以水 做致孔剂的， 因而壳聚糖溶液的浓度会影响支架中水的相对含量， 一般是水的相对含量越 高， 制得的孔就越多， 但水的相对含量越高， 则壳聚糖的相对含量就越低， 这会使支架的机 械强度降低， 因而本发明以 3g 壳聚糖的含量最佳。 0054 (2)、 第一次冷冻干燥步骤 0055 量取0.4ml步骤(1)中所得的1(V/V)戊二醛溶液， 并加入到步骤(1)中的溶有 一定量氯化铵的壳聚糖酸溶液中。
21、， 搅拌 5min 后， 将搅拌后的溶液涂抹到模具上， 静置过夜 ( 当然也可以在任意时间静置 8-20 小时 ) ； 0056 然后进行冷冻干燥 ； 0057 上述的冷冻干燥过程控制 ： 说 明 书 CN 102585275 A 6 4/4 页 7 0058 预冻温度为 -75， 预冻时间为 30min ； 0059 一次干燥的隔板温度为 -25， 时间为 24h， 得到壳聚糖支架 ； 0060 (3)、 第二次冷冻干燥步骤 0061 将步骤 (2) 中的壳聚糖支架浸泡到 10 (W/V， 质量体积比 ) 氢氧化钠溶液中， 浸 泡20min后， 用去离子水反复清洗支架3次， 用5的硼氢化钠除。
22、去游离的戊二醛， 再用大量 的去离子水洗涤后， 再对壳聚糖支架进行冷冻干燥， 最终得到一种多孔壳聚糖支架 ； 0062 上述的冷冻干燥过程控制参数为 ： 预冻温度为 -60， 预冻时间为 35min。上述第 二次冷冻干燥包括两次干燥 ： 一次干燥的隔板温度为 -20， 时间为 17h ； 二次干燥的隔板 温度为 10， 时间为 1.5-2h。 0063 上述所得的一种多孔壳聚糖支架经扫描电镜进行扫描， 可以看出支架的表面有许 多孔， 且孔径为 20-60m， 孔与孔之间的连通性较好， 测得的支架的孔隙率高达 90。 0064 本发明所用的所有试剂均为医药纯均来自上海国药集团。本发明所用的冻干机。
23、， 型号为 ES， 仪器名字为 AdVantage PLUS 冷冻型干燥机， 生产厂家为美国 Virtis 公司 ； 本发 明所用的扫描电镜的型号为 Quanta x50 系列扫描电子显微镜 ( 美国 FEI 公司 )。 0065 这里本发明的描述和应用是说明性的， 并非想将本发明的范围限制在上述实施例 中。这里所披露的实施例的变形和改变是可能的， 对于那些本领域的普通技术人员来说实 施例的替换和等效的各种部件是公知的。本领域技术人员应该清楚的是， 在不脱离本发明 的精神或本质特征的情况下， 本发明可以以其它形式、 结构、 布置、 比例， 以及用其它组件、 材料和部件来实现。在不脱离本发明范围和精神的情况下， 可以对这里所披露的实施例进 行其它变形和改变。 说 明 书 CN 102585275 A 7 1/1 页 8 图 1 说 明 书 附 图 CN 102585275 A 8 。