一种藻蓝蛋白降血糖多肽.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710544835.7 (22)申请日 2017.07.06 (71)申请人 浦江县欧立生物技术有限公司 地址 322200 浙江省金华市浦江县太白路 23号一楼朝北 (72)发明人 李冰 (74)专利代理机构 北京华仲龙腾专利代理事务 所(普通合伙) 11548 代理人 李静 (51)Int.Cl. C07K 14/795(2006.01) C07K 1/34(2006.01) C07K 1/30(2006.01) C07K 1/14(2006.01) C12N 1/06。

2、(2006.01) A61P 3/10(2006.01) A61P 3/06(2006.01) A61P 9/14(2006.01) A23L 33/18(2016.01) (54)发明名称 一种藻蓝蛋白降血糖多肽 (57)摘要 本发明公开一种藻蓝蛋白降血糖多肽， 1） 细 胞破碎： 藻液中加入功能蛋白肽， 选用磷酸钠盐 缓冲液作为提取溶剂， 反复冻融， 离心， 上清液即 为蛋白粗提液； 2） 盐析： 向蛋白粗提液中加入 (NH4)2SO4溶液， 3-5下静置11-13h， 离心， 即得 盐析沉淀物； 3） 双水相萃取： 将乙二醇和无机盐 配成pH为5.8-6.5， 加入盐析沉淀物， 磁力搅拌。

3、， 然后转移至分液漏斗中分层， 上相即为蛋白溶 液； 4） 超滤： 将蛋白溶液置于超滤离心管中， 离 心， 冷冻干燥， 即为藻蓝蛋白降血糖多肽。 本发明 的藻蓝蛋白降血糖多肽具有降低血压、 降低血 脂、 活化血管功能， 在制备过程中通过细胞破壁 显著提高多肽得率， 多肽得率高， 可应用于食品 或饮料中。 权利要求书1页 说明书4页 序列表1页 CN 107312085 A 2017.11.03 CN 107312085 A 1.一种藻蓝蛋白降血糖多肽， 其特征在于： 所述的降血糖多肽制备步骤为： 1） 细胞破碎： 藻液中加入功能蛋白肽， 选用磷酸钠盐缓冲液作为提取溶剂， 反复冻融， 离心， 上。

4、清液即为蛋白粗提液； 2） 盐析： 向蛋白粗提液中加入 (NH4)2SO4溶液至75-84%饱和度， 3-5下静置11-13h， 离 心， 即得盐析沉淀物； 3） 双水相萃取： 将乙二醇和无机盐配成pH为5.8-6.5， 聚乙二醇浓度为15%-17%， 无机盐 浓度为11%-13%， 加入盐析沉淀物， 磁力搅拌， 然后转移至分液漏斗中分层， 上相即为蛋白溶 液； 4） 超滤： 将蛋白溶液置于超滤离心管中， 离心， 冷冻干燥， 即为藻蓝蛋白降血糖多肽。 2.根据权利要求1所述一种藻蓝蛋白降血糖多肽， 其特征在于： 所述细胞破碎步骤中藻 液中的螺旋藻干粉与水的固液比为1:50， 磷酸钠盐缓冲液的p。

5、H值为7.0。 3.根据权利要求1所述一种藻蓝蛋白降血糖多肽， 其特征在于： 所述功能蛋白肽的添加 量 为 螺 旋 藻 干 粉 重 量 的 0 .0 5 % - 0 .1 5 % ， 所 述 功 能 蛋 白 肽 的 氨 基 酸 序 列 为 MKGLSFVLLVLLLMMPDGEGDPEMQYWTGRGLCRRFCYEYFVGHHCPRRYRCCAIRA。 4.根据权利要求1所述一种藻蓝蛋白降血糖多肽， 其特征在于： 所述细胞破碎步骤中的 反复冻融是在-20和37， 反复冻融4-5次， 每次 4h。 5.根据权利要求1所述一种藻蓝蛋白降血糖多肽， 其特征在于： 所述双水相萃取步骤中 的无机盐为磷。

6、酸钾盐、 磷酸钠盐、 硫酸钠、 硫酸钾、 酒石酸钾钠中的一种或几种混合。 6.根据权利要求1所述一种藻蓝蛋白降血糖多肽， 其特征在于： 所述超滤步骤中超滤离 心管的截留分子量为6000-10000Da。 7.根据权利要求1所述的一种藻蓝蛋白降血糖多肽， 其特征在于： 所述降血糖多肽可应 用于具有降血糖的食品或饮料。 权利要求书 1/1 页 2 CN 107312085 A 2 一种藻蓝蛋白降血糖多肽 技术领域 0001 本发明属于天然产物蛋白提取技术领域， 特别是涉及一种藻蓝蛋白降血糖多肽。 背景技术 0002 根据国际糖尿病联(IDE) 2006年的 Diabetes Atlas 中报告， 。

7、糖尿病已经在全球 蔓延。 目前糖尿病侵袭全球2. 46亿人， 占全球人口的5. 9%， 而患者总人数中接近80%是在 发展中国家， 其中印度4090万， 中国3980万。 报告中预测， 未来二十年内如不采取任何措施， 患糖尿病的患者将增加到3. 8亿人口。 全世界糖尿病的流行及治疗糖尿病新药的飞速发 展， 将使糖尿病药物的市场每年增长16%， 达到2006年的200亿美元。 糖尿病患者主要分为胰 岛素依赖型糖尿病(I型糖尿病)和非胰岛素依赖型糖尿病(II型糖尿病)两种， 其中II型糖 尿病占糖尿病总数的90%以上。 II型糖尿病的防治是糖尿病研究的一个重点。 由于糖尿病的 发病机制仍不十分明确。

8、， 目前主要通过长期用药以降低血糖， 控制并发症。 世界上治疗II型 糖尿病以磺酞脉类药物为主， 辅以双肌类、 。 一糖普酶抑制剂等药物。 但是， 由于磺酞脉类药 物的副作用大， 长期使用会因为胰岛素过度分泌而导致胰岛日细胞衰竭， 服用此类药物的 糖尿病人中， 每年有10%的病人会因治疗失效而改用胰岛素等其他类药物。 自1984年美国波 士顿总医院发现人的肠道内存在一类促进胰岛素分泌的多肤(统称GLP-1)以来， 多肤就成 了新一代治疗II型糖尿病药物的开发热点。 0003 螺旋藻是至今为止发现的营养最丰富、 最全面的绿色食品， 尤其蛋白质含量较高， 氨基酸平衡， 还含有丰富的必需脂肪酸 ( 。

9、如r一亚麻酸等 )， 螺旋藻本身也具有一定的降 血糖的功效， 但效果并不理想。 0004 现有技术如， 中国发明授权专利文献， 授权公告号CN 102613384 B， 一种用活体螺 旋藻制备螺旋藻多肽粉的方法。 现有制备螺旋藻多肽通常是使用螺旋藻干粉加水配制成悬 浊液， 再用生物酶工程技术水解螺旋藻蛋白制备螺旋藻多肽， 但螺旋藻干粉活性成份已大 量损失， 使最终产品活性不足， 提取率低， 不能消除螺旋藻的腥味。 该发明采用活体螺旋藻 为原料， 通过碱性蛋白酶、 风味蛋白酶、 红曲霉三步酶解法制备螺旋藻多肽粉， 该发明具有 提取率高， 能有效的保持螺旋藻多肽产品的活性成分， 制备的螺旋藻多肽无。

10、腥味， 口味较好 的优点， 但是上述的活性多肽得率不高， 在如何提高多肽得率方面还具有提升空间。 发明内容 0005 本发明的目的在于提供一种藻蓝蛋白降血糖多肽， 具有降低血压、 降低血脂、 活化 血管功能， 在制备过程中通过细胞破壁显著提高多肽得率， 多肽的制备步骤简单， 得率高， 可应用于具有降血糖的食品或饮料。 0006 本发明为实现上述目的所采取的技术方案为： 一种藻蓝蛋白降血糖多肽， 降血糖 多肽制备步骤为： 1） 细胞破碎： 配置藻液， 螺旋藻干粉与水的固液比为1:50， 在藻液中加入螺旋藻干粉重 量的0.05%-0.15%的功能蛋白肽， 选用磷酸钠盐缓冲液作为提取溶剂， 磷酸钠盐。

11、缓冲液的pH 说明书 1/4 页 3 CN 107312085 A 3 值为7.0， 在-20和37， 反复冻融4-5次， 每次 4h， 于5000rpm下离心30min， 收集上清液得 到藻蓝蛋白的 粗提液 ， 置于4 冰箱中 储藏备 用 ； 功能蛋白 肽的 氨基酸序列为 MKGLSFVLLVLLLMMPDGEGDPEMQYWTGRGLCRRFCYEYFVGHHCPRRYRCCAIRA。 该活性肽具有亲水性 和亲脂性， 亲水性使其溶于蒸馏水中， 亲脂性使其与螺旋藻细胞膜结合， 使细胞膜下形成小 孔， 致使细胞内的物质泄漏， 提高粗蛋白提取的工作效率， 也提高活性蛋白的得率， 利用活 性肽结合。

12、冻融法进行细胞破碎， 大大缩短了提取时间， 提取效果好， 粗蛋白液中蛋白含量 高， 避免了破碎处理过程中需因升温及机械力引起的蛋白质变性， 进而提高了最后的多肽 得率和多肽的活性； 2） 盐析： 向蛋白粗提液中加入 (NH4)2SO4溶液至75-84%饱和度， 3-5下静置11-13h， 离 心， 即得盐析沉淀物； 该步骤中加入大量的硫酸铵， 使蛋白质得溶解度降低而沉淀析出， 该 方法优点在于硫酸铵浓度变化具有连续性， 盐析效果好， 节约能耗； 3） 双水相萃取： 将乙二醇和无机盐配成pH为5.8-6.5， 聚乙二醇浓度为15%-17%， 无机盐 浓度为11%-13%， 加入盐析沉淀物， 磁力。

13、搅拌， 然后转移至分液漏斗中分层， 上相即为蛋白溶 液； 双水相萃取技术是一种新型的萃取分配技术， 其反应条件温和， 容易工艺放大， 分相时 间短， 效果好， 其中聚乙二醇相为上相， 无机盐相为下相， 藻蓝蛋白主要分布在聚乙二醇相 中； 无机盐为磷酸钾盐、 磷酸钠盐、 硫酸钠、 硫酸钾、 酒石酸钾钠中的一种或几种混合； 4） 超滤： 将蛋白溶液置于截留分子量为6000-10000Da超滤离心管中， 离心， 冷冻干燥， 即为藻蓝蛋白降血糖多肽。 该步骤可以在不破坏活性多肽的前提下， 能有效去除多肽溶液 中的聚乙二醇， 提高了多肽的浓度并且保证多肽的纯度不会减小甚至有所增加， 该多肽具 有降低血压。

14、、 降低血脂、 活化血管功能， 其提取成本低， 功能明确， 分子量小， 易吸收， 特异性 强， 副作用小。 0007 作为优选， 降血糖多肽可应用于具有降血糖的食品或饮料， 降血糖多肽的分子量 小， 易吸收， 通过添加在食品中或饮料中便于人体吸收， 起到降血糖、 降血脂和活化血管的 作用， 还提高了添加的食品或饮料的经济价值。 0008 与现有技术相比， 本发明的有益效果为： 1） 本发明提取的藻蓝蛋白降血糖多肽具 有降低血压、 降低血脂、 活化血管功能， 其提取成本低， 功能明确， 分子量小， 易吸收， 特异性 强， 副作用小； 2） 利用活性肽结合冻融法进行细胞破碎， 大大缩短了提取时间，。

15、 提取效果好， 粗蛋白液中蛋白含量高， 避免了破碎处理过程中需因升温及机械力引起的蛋白质变性， 提 高了最后的多肽得率和多肽的活性； 3） 本发明藻蓝蛋白降血糖多肽的制备步骤简单， 多肽 得率高， 可应用于具有降血糖的食品或饮料。 具体实施方式 0009 以下结合实施例对本发明的技术方案作进一步详细描述： 实施例1： 一种藻蓝蛋白降血糖多肽， 降血糖多肽制备步骤为： 1） 细胞破碎： 配置藻液， 螺旋藻干粉与水的固液比为1:50， 在藻液中加入螺旋藻干粉重 量的0.07%的功能蛋白肽， 选用磷酸钠盐缓冲液作为提取溶剂， 磷酸钠盐缓冲液的pH值为 7.0， 在-20和37， 反复冻融5次， 每次。

16、 4h， 于5000rpm下离心30min， 收集上清液得到藻蓝 蛋 白 的 粗 提 液 ， 置 于 4 冰 箱 中 储 藏 备 用 ； 功 能 蛋 白 肽 的 氨 基 酸 序 列 为 说明书 2/4 页 4 CN 107312085 A 4 MKGLSFVLLVLLLMMPDGEGDPEMQYWTGRGLCRRFCYEYFVGHHCPRRYRCCAIRA； 2） 盐析： 向蛋白粗提液中加入 (NH4)2SO4溶液至80%饱和度， 4下静置12h， 6000rpm下 离心15min， 即得盐析沉淀物； 3） 双水相萃取： 将乙二醇和无机盐配成pH为6.2， 聚乙二醇浓度为16%， 无机盐浓度为。

17、 11%， 无机盐为磷酸钾盐、 磷酸钠盐的混合物， 加入盐析沉淀物， 磁力搅拌， 然后转移至分液 漏斗中分层， 上相即为蛋白溶液； 4） 超滤： 将蛋白溶液置于截留分子量为8000Da超滤离心管中， 离心， 冷冻干燥， 即为藻 蓝蛋白降血糖多肽。 0010 降血糖多肽可应用于具有降血糖的食品或饮料， 降血糖多肽的分子量小， 易吸收， 通过添加在食品中或饮料中便于人体吸收， 起到降血糖、 降血脂和活化血管的作用， 还提高 了添加的食品或饮料的经济价值。 0011 本实施例中的常规技术为本领域技术人员所知晓的现有技术， 例如离心、 双水相 萃取操作步骤、 超滤操作步骤、 冷冻干燥等现有技术， 故在。

18、此不再详细赘述。 0012 实施例2： 一种藻蓝蛋白降血糖多肽， 降血糖多肽制备步骤为： 1） 细胞破碎： 配置藻液， 螺旋藻干粉与水的固液比为1:50， 在藻液中加入螺旋藻干粉重 量的0.08%的功能蛋白肽， 选用磷酸钠盐缓冲液作为提取溶剂， 磷酸钠盐缓冲液的pH值为 7.0， 在-20和37， 反复冻融5次， 每次 4h， 于5000rpm下离心30min， 收集上清液得到藻蓝 蛋 白 的 粗 提 液 ， 置 于 4 冰 箱 中 储 藏 备 用 ； 功 能 蛋 白 肽 的 氨 基 酸 序 列 为 MKGLSFVLLVLLLMMPDGEGDPEMQYWTGRGLCRRFCYEYFVGHHCP。

19、RRYRCCAIRA。 该活性肽具有亲水性 和亲脂性， 亲水性使其溶于蒸馏水中， 亲脂性使其与螺旋藻细胞膜结合， 使细胞膜下形成小 孔， 致使细胞内的物质泄漏， 提高粗蛋白提取的工作效率， 也提高活性蛋白的得率， 利用活 性肽结合冻融法进行细胞破碎， 大大缩短了提取时间， 提取效果好， 粗蛋白液中蛋白含量 高， 避免了破碎处理过程中需因升温及机械力引起的蛋白质变性， 进而提高了最后的多肽 得率和多肽的活性； 2） 盐析： 向蛋白粗提液中加入 (NH4)2SO4溶液至82%饱和度， 3下静置12h， 6500rmp下 离心10min， 即得盐析沉淀物； 该步骤中加入大量的硫酸铵， 使蛋白质得溶解。

20、度降低而沉淀 析出， 该方法优点在于硫酸铵浓度变化具有连续性， 盐析效果好， 节约能耗； 3） 双水相萃取： 将乙二醇和无机盐配成pH为5.9， 聚乙二醇浓度为16%， 无机盐浓度为 11%， 机盐为磷酸钠盐、 酒石酸钾钠混合物， 加入盐析沉淀物， 磁力搅拌， 然后转移至分液漏 斗中分层， 上相即为蛋白溶液； 双水相萃取技术是一种新型的萃取分配技术， 其反应条件温 和， 容易工艺放大， 分相时间短， 效果好， 其中聚乙二醇相为上相， 无机盐相为下相， 藻蓝蛋 白主要分布在聚乙二醇相中； 无机盐为磷酸钾盐、 磷酸钠盐、 硫酸钠、 硫酸钾、 酒石酸钾钠中 的一种或几种混合； 4） 超滤： 将蛋白溶。

21、液置于截留分子量为7500Da超滤离心管中， 离心， 冷冻干燥， 即为藻 蓝蛋白降血糖多肽。 该步骤可以在不破坏活性多肽的前提下， 能有效去除多肽溶液中的聚 乙二醇， 提高了多肽的浓度并且保证多肽的纯度不会减小甚至有所增加， 该多肽具有降低 血压、 降低血脂、 活化血管功能， 其提取成本低， 功能明确， 分子量小， 易吸收， 特异性强， 副 作用小。 说明书 3/4 页 5 CN 107312085 A 5 0013 降血糖多肽可应用于具有降血糖的食品或饮料， 降血糖多肽的分子量小， 易吸收， 通过添加在食品中或饮料中便于人体吸收， 起到降血糖、 降血脂和活化血管的作用， 还提高 了添加的食品。

22、或饮料的经济价值。 0014 本实施例中的常规技术为本领域技术人员所知晓的现有技术， 例如离心、 双水相 萃取操作步骤、 超滤操作步骤、 冷冻干燥等现有技术， 故在此不再详细赘述。 0015 以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明， 应理解的是以上所述仅 为本发明的具体实施例， 并不用于限制本发明， 凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、 补充或类似方式替代等， 均应包含在本发明的保护范围之内。 说明书 4/4 页 6 CN 107312085 A 6 SEQUENCE LISTING 浦江县欧立生物技术有限公司 一种藻蓝蛋白降血糖多肽 1 1 PatentIn version 3.。

23、5 1 57 PRT 人工合成 1 Met Lys Gly Leu Ser Phe Val Leu Leu Val Leu Leu Leu Met Met Pro 1 5 10 15 Asp Gly Glu Gly Asp Pro Glu Met Gln Tyr Trp Thr Gly Arg Gly Leu 20 25 30 Cys Arg Arg Phe Cys Tyr Glu Tyr Phe Val Gly His His Cys Pro Arg 35 40 45 Arg Tyr Arg Cys Cys Ala Ile Arg Ala 50 55 序列表 1/1 页 7 CN 107312085 A 7 。