一种乳清蛋白的纯化方法.pdf

《一种乳清蛋白的纯化方法.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《一种乳清蛋白的纯化方法.pdf（12页完整版）》请在专利查询网上搜索。

1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201310452798.9 (22)申请日 2013.09.27 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 104513305 A (43)申请公布日 2015.04.15 (73)专利权人 北京济普霖生物技术有限公司 地址 100193 北京市海淀区马连洼北路158 号众鼎大厦306室 专利权人 无锡科捷诺生物科技有限责任公 司 (72)发明人 赵建敏王建武付明波汤波 李宁 (74)专利代理机构 北京路浩知识产权代理有限 公司 11002 代理人 王文君 (51)Int。

2、.Cl. C07K 14/76(2006.01) C07K 14/47(2006.01) C07K 1/20(2006.01) (56)对比文件 CN 102321150 A,2012.01.18, CN 102311498 A,2012.01.11, CN 101104635 A,2008.01.16, 李由等.乳腺生物反应器表达的重组人乳清 白蛋白的高效分离纯化. 中国生物工程杂志 .2011,第31卷(第8期), L. C. Chaplin.Hydrophobic interaction fast protein liquid chromatography of milk protein。

3、s. Journal of Chromatography .1986,第363卷(第2期), L. C. Chaplin.Hydrophobic interaction fast protein liquid chromatography of milk proteins. Journal of Chromatography .1986,第363卷(第2期), 审查员 毕晴 (54)发明名称 一种乳清蛋白的纯化方法 (57)摘要 本发明提供了一种乳清蛋白的纯化方法， 以 哺乳动物乳汁为原料， 经预处理得到乳清， 进行 疏水层析分离， 得到纯化的-乳清白蛋白和- 乳球蛋白。 还提供了一种当乳清蛋。

4、白含有重组人 -乳清白蛋白时， 在进行疏水层析分离之前， 先 通过阴离子交换层析， 使重组人-乳清白蛋白 与内源的-乳清白蛋白以及-乳球蛋白分离 开， 再进行疏水层析分离， 得到纯化的重组人- 乳清白蛋白及动物内源的-乳清白蛋白和- 乳球蛋白的方法。 权利要求书1页 说明书6页 附图4页 CN 104513305 B 2017.11.21 CN 104513305 B 1.一种乳清蛋白的纯化方法， 其特征在于， 以含有重组人 -乳清白蛋白的哺乳动物乳 汁为原料， 经预处理得到乳清， 通过阴离子交换层析， 分离得到重组人 -乳清白蛋白纯品， 以及富含内源 -乳清白蛋白和 -乳球蛋白的分离溶液， 。

5、再通过膜分离或疏水层析进行精细 纯化， 得到内源 -乳清白蛋白纯品、 -乳球蛋白纯品和纯度更高的重组人 -乳清白蛋白纯 品； 所述预处理为通过高速离心脱脂， 采用0.8-1.4 m陶瓷膜微滤技术除菌， 并采用80nm- 0.2 m陶瓷膜去除脱脂乳中的酪蛋白， 得到澄清的乳清； 所述阴离子交换层析是将乳清上样到经30-60mM、 pH 6.5-7.5的Tris-Cl缓冲液平衡的 阴离子交换层析柱， 收集含有重组人 -乳清白蛋白的穿透液； 重组人 -乳清白蛋白精细纯化是通过对含有重组人 -乳清白蛋白的穿透液进行膜分 离， 得到重组人 -乳清白蛋白纯品； 或通过对含有重组人 -乳清白蛋白的穿透液通过。

6、疏水 层析分离去除杂蛋白， 将含有重组人 -乳清白蛋白的穿透液上样到用电导率为130-160ms/ cm的(NH)2SO4， 10-50mM、 pH6.5-7.5的磷酸盐缓冲液平衡的Butyl疏水互作层析柱； 上样完毕 用电导率为130-160ms/cm的(NH)2SO4， 10-50mM、 pH6.5-7.5的磷酸盐缓冲液冲洗层析柱待 280nm吸收信号至基线， 使用电导率为50-80ms/cm的(NH)2SO4， 10-50mM、 pH6.5-7.5的磷酸盐 缓冲液洗脱杂蛋白， 使用电导率为6ms/cm以下、 10-50mM， pH6.5-7.5的磷酸盐缓冲液洗脱重 组人 -乳清白蛋白， 。

7、得到重组人 -乳清白蛋白纯品； 所述的内源 -乳清白蛋白与 -乳球蛋白纯化方法是将乳清上样到30-60mM、 pH 6.5- 7.5的Tris-Cl缓冲液平衡的阴离子交换层析柱， 继续使用30-60mM、 pH6.5-7.5的Tris-Cl缓 冲液冲洗层析柱至基线， 用电导率为50-84ms/cm的NaCl， 50mM、 pH6.5-7.5的Tris-Cl缓冲液 洗脱层析柱， 收集得到富含内源 -乳清白蛋白与 -乳球蛋白的分离溶液； 内源 -乳清白蛋白与 -乳球蛋白精细纯化是将富含内源 -乳清白蛋白和 -乳球蛋白 的分离溶液上样到用电导率为130-160ms/cm的(NH)2SO4， 10-5。

8、0mM、 pH6.5-7.5的磷酸盐缓冲 液平衡的Butyl疏水互作层析柱， 流速为100-300cm/h， 上样过程中收集含有 -乳球蛋白的 穿透液， 得到 -乳球蛋白纯品； 上样完毕用电导率为130-160ms/cm的(NH)2SO4， 10-50mM、 pH6.5-7.5的磷酸盐缓冲液冲洗层析柱待280nm吸收信号至基线， 使用电导率为50-80ms/cm 的(NH)2SO4， 10-50mM、 pH6.5-7.5的磷酸盐缓冲液洗脱杂蛋白， 使用电导率为6ms/cm以下、 10-50mM、 pH6.5-7.5的磷酸盐缓冲液洗脱 -乳清白蛋白， 得到内源 -乳清白蛋白纯品。 2.根据权利要。

9、求1所述的纯化方法， 其特征在于， 重组人 -乳清白蛋白精细纯化是通过 对含有重组人 -乳清白蛋白的穿透液进行30-80kD的超滤膜分离， 得到重组人 -乳清白蛋 白纯品。 权利要求书 1/1 页 2 CN 104513305 B 2 一种乳清蛋白的纯化方法 技术领域 0001 本发明涉及生物技术领域， 具体地说， 涉及一种从转基因牛乳中纯化重组人 -乳 清白蛋白的方法， 同时也可纯化得到动物内源 -乳清白蛋白及 -乳球蛋白。 背景技术 0002 -乳清白蛋白 （ -lactalbumin， LA） 是大多数哺乳动物乳腺特异表达的重要功能 蛋白， 除了满足幼年动物生长发育所需的必需氨基酸之外，。

10、 还具有抑制肿瘤生长、 改善睡眠 等重要生理功能。 -乳清白蛋白的必需氨基酸含量较高， 尤其是色氨酸， 它参与神经系统的 活动例如情绪调控等。 另外， -乳清白蛋白能够刺激粘膜的新陈代谢并且有效地预防婴幼 儿的胃肠道感染。 有意义地是， -乳清白蛋白可以作用于肿瘤细胞， 导致肿瘤细胞的凋亡， 且有效地治疗因人乳头瘤病毒导致的皮肤瘤， 由于 -乳清白蛋白具有以上众多的生理特 性， 可以作为潜在的抗肿瘤药物、 功能食品添加剂等。 0003 -乳球蛋白 （ -lactoglobulin)是乳中蛋白质的一种， 约占乳中蛋白质的712%， 占乳清中50%。 根据相关研究， -乳球蛋白在pH值为5.27.。

11、5之间以二聚体形式存在， 而pH 值在3以下或8以上时以单体形式存在。 -乳球蛋白具有的抗微生物活性主要是基于它自身 的多肽片段， 而这些肽段仅对于革兰氏阳性菌有明显的效果， 并且 -乳球蛋白还具有抗病 毒、 抗癌活性， 同时它还是参与脂肪酸的新陈代谢与促进哺乳动物细胞生长的关键因子。 0004 与牛等其他哺乳动物相比， 人乳中含有的 -乳清白蛋白等功能性蛋白质具有含量 高、 更适合人体吸收、 生物活性更强等优势。 研究表明， 牛乳 -乳清白蛋白的含量为1-1.5g/ L， 而人乳 -乳清白蛋白的含量为2.440.64g/L， 明显高于牛乳中的蛋白浓度。 近年来， 人 们提出， 在保留牛乳或羊。

12、乳中对人体有益营养功能成分的同时， 通过转基因技术加入一些 人乳功能蛋白质， 将牛乳或羊乳等改造成更接近于人类母乳的产品， 显著提高了牛乳中的 -乳清白蛋白含量和总蛋白质含量， 达到了改善牛乳营养成分的目的； 同时通过将转基因 动物乳腺作为生物反应器， 可以大规模生产重组人 -乳清白蛋白， 从而开发以其为主要功 能成分的抗肿瘤药物等产品。 而动物内源 -乳清白蛋白与 -乳球蛋白作为哺乳动物内源蛋 白其本身表达量较高， 同时也具有相对重要的生物活性， 因此也可作为工业开发的对象。 0005 目前， 对于 -乳清白蛋白及 -乳球蛋白分离纯化的方法主要是运用层析分离的方 法、 膜分离的方法和盐类沉淀。

13、的方法,但由于膜分离的原理是根据蛋白质的分子量进行粗 分离， 因此导致人 -乳清白蛋白的纯度下降且回收率也相应降低； 而通过盐类沉淀蛋白会 导致蛋白质的变性及收率降低； 利用层析色谱的分离方法主要包括疏水互作色谱、 离子交 换色谱、 凝胶过滤色谱等。 其中离子交换色谱是最为常用的层析技术， 具有低成本、 耐酸碱、 上样体积大且较易放大进行工业化生产； 凝胶过滤色谱一般位于蛋白质纯化流程的精细纯 化阶段， 具有分辨率高、 蛋白纯度高等特点， 但由于此层析技术的成本较高， 因此不适合应 用于工业放大生产； 疏水互作色谱需要配置高浓度盐溶液来稀释蛋白溶液， 因此可能会产 生蛋白质沉淀现象而造成蛋白质。

14、的损失， 但由于不同蛋白质的理化性质不同， 耐受高浓度 盐溶液的能力也有所不同。 说明书 1/6 页 3 CN 104513305 B 3 0006 从乳中分离纯化 -乳清白蛋白及 -乳球蛋白且规模化制备的相关专利文献发现， 中国专利申请号201110191731.5描述了在加有保护剂0.050.4M氯化钙条件下将乳样加 热至60-95保温10min-60min后冷却的预处理得到富含 -乳球蛋白和 -乳清白蛋白的 清液， 再通过阴离子色谱分离得到人 -乳清白蛋白、 牛 -乳清白蛋白和牛 -乳球蛋白， 由于 此方法在前处理阶段加入无机化合物 （氯化钙） 并将乳样加热处理且时间较长， 易导致乳清 。

15、蛋白变性， 活性丢失， 因此很难适用于工业化生产。 中国专利申请号200910072780.X公开了 一种含有低 -乳球蛋白的乳清蛋白粉的制备方法， 此方法步骤繁琐、 收率较低， 很难应用于 大规模生产。 美国专利US4834994阐述了在酸性条件下 -乳球蛋白与阳离子交换介质结合 的方法进行分离。 美国专利US6312755说明了将乳清在酸性pH值下处理进行 -乳清白蛋白 的分离， 此方法不适用于规模化生产。 而美国专利US5008376则描述了利用不同孔径的膜分 离技术来分离 -乳清白蛋白， 先选用100kD大小孔径的超滤膜将富有 -乳清白蛋白的蛋白 溶液通过此膜， 再选用10kD小孔径的。

16、超滤膜将 -乳清白蛋白富集， 但此方法所得到的 -乳 清白蛋白的纯度较低。 0007 为了开发 -乳清白蛋白及 -乳球蛋白为主要功能成分的产品， 需要将重组人 -乳 清白蛋白、 动物内源 -乳清白蛋白及 -乳球蛋白分别从转基因动物乳汁中分离纯化出来， 但是由于牛等哺乳动物 -乳清白蛋白与人 -乳清白蛋白的分子特性非常相近， 如牛 -乳清 白蛋白具有76%的氨基酸序列同源性和88%的结构相似性， 分子量分别为14,078Da和14, 186Da， 等电点pI4.24.6， 而且牛乳中含有大量牛内源蛋白质， 导致从牛乳中纯化重组人 - 乳清白蛋白存在较高的难度， 而且根据以上方法都有一定的局限性，。

17、 产量低、 纯度低、 成本 高而不能形成大规模生产。 发明内容 0008 为了解决现有技术中存在的问题， 本发明的目的是提供一种从哺乳动物乳汁中高 效分离重组人 -乳清白蛋白、 动物源 -乳清白蛋白及 -乳球蛋白的方法， 得到的重组蛋白 与天然人 -乳清白蛋白具有天然的理化特性和生物活性， 同时动物内源的 -乳清白蛋白与 -乳球蛋白也具有较好的生物活性。 0009 为了实现本发明目的， 本发明首先提供一种乳清蛋白的纯化方法， 以哺乳动物乳 汁为原料， 经预处理得到乳清， 进行疏水层析分离， 得到 -乳清白蛋白和 -乳球蛋白纯品。 0010 进一步地， 所述预处理为将乳样通过高速离心脱脂， 采用。

18、0.8-1.4 m陶瓷膜微滤技 术除菌， 并采用80nm-0.2 m陶瓷膜去除脱脂乳中的酪蛋白， 得到澄清的乳清。 0011 进一步地， 所述疏水层析的具体步骤包括： 将乳清上样到用电导率为130-160ms/ cm的(NH)2SO4， 10-50mM、 pH6.5-7.5的磷酸盐缓冲液平衡的Butyl疏水互作层析柱， 此填料的 配基密度为25-50 mol/ml， 流速为100-300cm/h， 上样过程中收集含有 -乳球蛋白的穿透 液， 得到 -乳球蛋白纯品； 上样完毕用电导率为130-160ms/cm的(NH)2SO4， 10-50mM、 pH6.5- 7.5的磷酸盐缓冲液冲洗层析柱待2。

19、80nm吸收信号至基线， 使用电导率为50-80ms/cm的 (NH)2SO4， 10-50mM、 pH6.5-7.5的磷酸盐缓冲液洗脱杂蛋白， 使用电导率为6ms/cm以下、 10- 50mM、 pH6.5-7.5的磷酸盐缓冲液洗脱 -乳清白蛋白， 得到 -乳清白蛋白纯品。 0012 进一步地， 哺乳动物乳汁还可能含有重组人 -乳清白蛋白。 0013 当哺乳动物乳汁还含有重组人 -乳清白蛋白时， 上述纯化方法将以含有重组人 - 说明书 2/6 页 4 CN 104513305 B 4 乳清白蛋白的哺乳动物乳汁为原料， 经预处理得到乳清， 通过阴离子交换层析， 分离得到重 组人 -乳清白蛋白纯。

20、品， 以及富含内源 -乳清白蛋白和 -乳球蛋白的分离溶液， 再通过膜 分离或疏水层析进行精细纯化， 得到内源 -乳清白蛋白、 -乳球蛋白纯品和纯度更高的重 组人 -乳清白蛋白。 0014 进一步地， 所述的重组人 -乳清白蛋白纯化方法是将乳清上样到经30-60mM， pH6.5-7.5Tris-Cl缓冲液平衡的阴离子交换层析柱， 收集穿透液， 收集含有重组人 -乳清 白蛋白的穿透液。 0015 作为优选， 重组人 -乳清白蛋白精细纯化是通过对含有重组人 -乳清白蛋白的穿 透液进行膜分离， 优选30-80kD的超滤膜进行分离， 得到重组人 -乳清白蛋白纯品。 0016 作为优选， 所述重组人 -。

21、乳清白蛋白精细纯化是通过对含有重组人 -乳清白蛋白 的穿透液通过疏水层析分离去除杂蛋白， 将含有重组人 -乳清白蛋白的穿透液上样到用电 导率为130-160ms/cm的(NH)2SO4， 10-50mM、 pH6.5-7.5的磷酸盐缓冲液平衡的Butyl疏水互 作层析柱； 上样完毕用电导率为130-160ms/cm的(NH)2SO4， 10-50mM、 pH6.5-7.5的磷酸盐缓 冲液冲洗层析柱待280nm吸收信号至基线， 使用电导率为50-80ms/cm的(NH)2SO4， 10-50mM、 pH6.5-7.5的磷酸盐缓冲液洗脱杂蛋白， 使用电导率为6ms/cm以下、 10-50mM， p。

22、H6.5-7.5的 磷酸盐缓冲液洗脱重组人 -乳清白蛋白， 得到重组人 -乳清白蛋白纯品。 0017 进一步地， 所述的内源 -乳清白蛋白与 -乳球蛋白纯化方法是将乳清上样到30- 60mM、 pH6.5-7.5的Tris-Cl缓冲液平衡的阴离子交换层析柱， 继续使用30-60mM、 pH6.5-7.5 的Tris-Cl缓冲液冲洗层析柱至基线， 用电导率为50-84ms/cm的NaCl， 50mM、 pH6.5-7.5的 Tris-Cl缓冲液洗脱层析柱， 收集得到富含内源 -乳清白蛋白与 -乳球蛋白的分离溶液。 0018 作为优选， 所述的内源 -乳清白蛋白与 -乳球蛋白精细纯化是将富含内源 。

23、-乳清 白蛋白和 -乳球蛋白的分离溶液上样到用电导率为130-160ms/cm的(NH)2SO4， 10-50mM、 pH6.5-7.5的磷酸盐缓冲液平衡的Butyl疏水互作层析柱， 流速为100-300cm/h， 上样过程中 收集含有 -乳球蛋白的穿透液， 得到 -乳球蛋白纯品； 上样完毕用电导率为130-160ms/cm 的(NH)2SO4， 10-50mM、 pH6.5-7.5的磷酸盐缓冲液冲洗层析柱待280nm吸收信号至基线， 使用 电导率为50-80ms/cm的(NH)2SO4， 10-50mM、 pH6.5-7.5的磷酸盐缓冲液洗脱杂蛋白， 使用电 导率为6ms/cm以下、 10-。

24、50mM、 pH6.5-7.5的磷酸盐缓冲液洗脱 -乳清白蛋白， 得到内源 -乳 清白蛋白纯品。 0019 本发明的有益效果在于： 本发明提供了一种可以经济高效地从含重组人 -乳清白 蛋白的哺乳动物乳汁中分离纯化出重组人 -乳清白蛋白、 动物源 -乳清白蛋白及 -乳球蛋 白的方法， 并且可以快速、 低成本、 大规模生产重组蛋白及动物内源蛋白。 本发明以乳样为 原料， 经过预处理、 膜分离、 层析分离、 膜分离的纯化步骤可以有效地将普通乳汁中 -乳清 白蛋白、 -乳球蛋白分离纯化， 也可以将转基因动物乳腺表达的重组人 -乳清白蛋白、 内源 -乳清白蛋白以及内源 -乳球蛋白从乳中分离纯化。 002。

25、0 根据本发明所述方法分别得到的重组人 -乳清白蛋白的纯度99%、 牛 -乳清白 蛋白纯度95%及 -乳球蛋白纯度99%， 且重组人 -乳清白蛋白具有和天然人 -乳清白蛋 白相似的理化活性和生理功能。 因此本发明不仅能够将重组人 -乳清白蛋白与动物源 -乳 清白蛋白可以很好地且有效地分离， 而且可以同时获得高纯度的重组人 -乳清白蛋白纯 品、 动物源 -乳清白蛋白纯品及 -乳球蛋白纯品， 非常适用于规模化生产。 说明书 3/6 页 5 CN 104513305 B 5 附图说明 0021 图1为DEAE介质阴离子交换分离组分的12%Native-PAGE电泳结果， 方框内表示含 有重组人 -乳。

26、清白蛋白分离组分； Whey为前处理后乳清样品； FT为重组 -乳清白蛋白穿透 组分； P为100%NaCl梯度洗脱组分； N为普通全乳样品； H为人 -LA标准品； D为牛 -LA标准品。 0022 图2为Q介质阴离子交换分离组分的12%Native-PAGE电泳结果， 方框内表示含有重 组人 -乳清白蛋白分离组分； FT为重组 -乳清白蛋白穿透组分； P为100%NaCl梯度洗脱组 分； N为普通全乳样品； H为人 -LA标准品； D为牛 -LA标准品。 0023 图3为重组人 -乳清白蛋白膜分离的超滤图谱。 0024 图4为重组人 -乳清白蛋白疏水互作纯化色谱各分离组分的12%SDS-P。

27、AGE电泳结 果， 方框内表示含有重组人 -乳清白蛋白分离组分； Whey为前处理后乳清样品； FT为杂蛋白 穿透组分； P1为42%NaCl梯度洗脱组分； P2为100%NaCl梯度洗脱重组人 -乳清白蛋白组分； N 为普通全乳样品； H为人 -LA标准品； D为牛 -LA标准品。 0025 图5为 -乳球蛋白与牛 -乳清白蛋白疏水互作纯化色谱各分离组分的12%SDS- PAGE电泳结果， 方框内分别表示 -乳球蛋白与牛 -乳清白蛋白分离组分； FT为 -乳球蛋白 组分； P1为杂蛋白组分； P2为100%NaCl梯度洗脱牛 -乳清白蛋白组分。 0026 图6为凝胶过滤鉴定经疏水互作色谱后的。

28、 -乳球蛋白的纯度色谱图， -乳球蛋白 纯度99%。 0027 图7为凝胶过滤鉴定经疏水互作色谱后的重组人 -乳清白蛋白的纯度色谱图， 重 组人 -乳清白蛋白纯度95%。 0028 图8为凝胶过滤鉴定经疏水互作色谱后的牛 -乳清白蛋白的纯度色谱图， 牛 -乳 清白蛋白纯度95%。 0029 图9为凝胶过滤鉴定膜分离后重组人 -乳清白蛋白的纯度色谱图， 重组人 -乳清 白蛋白纯度99%。 具体实施方式 0030 以下实施例用于说明本发明， 但不用来限制本发明的范围。 0031 实施例中所用的主要试验仪器与试剂如下： 0032 AKTA explorer100快速蛋白液相层析系统、 XK50/20。

29、层析柱、 DEAE Sepharose Fast flow填料、 Q Sepharose Fast flow填料、 Butyl Sepharose Fast flow填料、 凝胶过 滤色谱柱Superdex2005/150GL层析柱购自GE Healthcare； 陶瓷膜冷除菌及超滤凭介装置 （型号TOP/CMM-1/3/3T） 、 1.4um与80nm陶瓷膜购自陶普森公司； Cogent M1TFF system （型号 2143） 、 Pellicon XL Filter PXBO30A5030KD、 PXBO50A5050KD购自Millipore； 高速冷冻离 心机购自Beckman公。

30、司； 超滤浓缩管Ultra-15， 购自Millipore。 0033 实施例1 0034 收集含有重组人 -乳清白蛋白 （含量为0.1-5克/升） 的哺乳动物奶样， 包括含重组 人 -乳清白蛋白的转基因动物奶样， 也可以是混有重组人 -乳清白蛋白的非转基因动物奶 样， 其中奶样以新鲜液态奶样为宜， 也可以是冷冻样品解冻后或奶粉复溶后获得的液态奶 样， 哺乳动物奶样包括牛奶、 羊奶、 兔奶等， 以牛奶为优选。 将上述奶样通过蝶式离心机进行 说明书 4/6 页 6 CN 104513305 B 6 脱脂， 利用0.8-1.4 m陶瓷膜微滤技术进行牛乳中细菌的去除， 操作温度为035， 进口压 为。

31、0.38MPa， 而后打开透过阀门， 将操作压设置为0.15MPa， 流速为5.8m/s， 通量为350Lm2/ h （LMH） 。 再通过80nm-1.4 m陶瓷膜去除脱脂乳中的酪蛋白， 将操作压设置为0.05-0.2MPa， 流速为5-8m/s， 通量为60-100LMH， 便可得到澄清的乳清。 0035 实施例2 0036 实施例1制备得到的乳清上样到用60mM， pH6 .5Tris-Cl缓冲液平衡的DEAE Sepharose Fast flow阴离子交换层析柱， 流速为10-100ml/min， 收集含有重组人 -乳清白 蛋白的穿透液， 得到的重组人 -乳清白蛋白纯度85%， 收率。

32、90%； 使用60mM、 pH6.5的 Tris-Cl缓冲液冲洗层析柱至基线， 用电导率为50-84ms/cm的NaCl， 60mM、 pH6.5的Tris-Cl 缓冲液将含有牛 -乳清白蛋白与 -乳球蛋白的组分洗脱下来收集。 DEAE介质阴离子交换色 谱分离组分的12%Native-PAGE电泳结果见图1。 可见通过阴离子交换层析将牛内源 -乳清 白蛋白与重组人 -乳清白蛋白有效的分离开， 且牛 -乳清白蛋白与 -乳球蛋白全部洗脱下 来。 0037 实施例3 0038 实施例1制备得到的乳清上样到用50mM， pH7.0Tris-Cl缓冲液平衡的Q Sepharose Fast flow阴离。

33、子交换层析柱， 流速为10-100ml/min， 收集含有重组人 -乳清白蛋白的穿透 液， 得到蛋白纯度80%， 回收率90%， 使用50mM、 pH7.0Tris-Cl缓冲液冲洗层析柱至基线， 用电导率为50-84ms/cm的NaCl， 50mM、 pH7.0的Tris-Cl缓冲液将含有牛 -乳清白蛋白与 - 乳球蛋白的杂蛋白洗脱下来收集。 Q介质阴离子交换色谱分离组分的12%Native-PAGE电泳 结果见图2。 由此可知通过阴离子交换层析可将牛内源 -乳清白蛋白与重组人 -乳清白蛋 白分离。 0039 实施例4 0040 实施例2或实施例3得到的含有重组人-乳清白蛋白的蛋白溶液装入Co。

34、gent M1TFF system的储液罐中， 使用30-80kD的超滤膜装置， 设置流速为40ml/min， 转膜压 （TMP） 为1-2bar开始进行膜分离， 去除大分子杂蛋白， 得到重组人 -乳清白蛋白纯度99%， 回收 率为75%。 见图3为重组人 -乳清白蛋白膜分离的超滤图谱， 根据色谱图可知有大量的重组 人 -乳清白蛋白穿透超滤膜， 收集穿透液， 通过凝胶过滤色谱对其进行蛋白纯度分析。 0041 实施例5 0042 实施例2或实施例3得到的含有重组人 -乳清白蛋白的分离溶液还可通过疏水层 析分离去除杂蛋白， 将含有重组人 -乳清白蛋白的分离溶液上样到用电导率为130-160ms/ 。

35、cm的(NH)2SO4， 10-50mM、 pH6.5-7.5的磷酸盐缓冲液平衡的Butyl Sepharose Fast flow疏 水互作层析柱； 上样完毕用电导率为130-160ms/cm的(NH)2SO4， 10-50mM、 pH6.5-7.5的磷酸 盐缓冲液冲洗层析柱待280nm吸收信号至基线， 使用电导率为50-80ms/cm的(NH)2SO4， 10- 50mM、 pH6.5-7.5的磷酸盐缓冲液洗脱杂蛋白， 使用电导率为6ms/cm以下、 10-50mM、 pH6.5- 7.5的磷酸盐缓冲液洗脱重组人 -乳清白蛋白， 得到重组人 -乳清白蛋白纯度均95%， 回 收率60%。 重。

36、组人 -乳清白蛋白疏水互作色谱分离组分的12%SDS-PAGE电泳结果见图4， 由 图4可知通过疏水互作色谱可纯化得到纯度更高的重组人 -乳清白蛋白纯品。 0043 实施例6 0044 实施例2或实施例3得到的富含牛 -乳清白蛋白与 -乳球蛋白的洗脱液分别上样 说明书 5/6 页 7 CN 104513305 B 7 到用电导率为130-160ms/cm的(NH)2SO4， 20mM、 pH6.5-7.5的磷酸盐缓冲液平衡的Butyl Sepharose Fast flow疏水互作层析柱， 流速为40ml/min， 上样过程中收集含有 -乳球蛋白 的穿透液， -乳球蛋白纯度99%、 回收率92。

37、%； 上样完毕用电导率为130-160ms/cm的 (NH)2SO4， 20mM、 pH6.5-7.5的磷酸盐缓冲液冲洗层析柱待280nm吸收信号至基线， 使用电导 率为50-80ms/cm的(NH)2SO4， 20mM、 pH7.0的磷酸盐缓冲液洗脱杂蛋白， 使用电导率为6ms/cm 以下、 20mM、 pH7.0的磷酸盐缓冲液洗脱牛 -乳清白蛋白， 得到牛内源 -乳清白蛋白纯度 95%， 回收率60%。 -乳球蛋白与牛 -乳清白蛋白疏水互作纯化色谱分离组分的12%SDS- PAGE电泳结果见图5， 由图5可知通过疏水互作色谱可以很好地将 -乳球蛋白与牛 -乳清白 蛋白分离， 并得到高纯度的。

38、 -乳球蛋白与牛内源 -乳清白蛋白纯品。 0045 实施例7 0046 将疏水互作色谱纯化得到的蛋白样品与膜分离得到的蛋白样品通过凝胶过滤色 谱的分析纯度： 缓冲液为pH7.0的50mM磷酸盐、 0.15M NaCl的水溶液， 流速设置为1ml/min以 下进行等度洗脱。 图6为凝胶过滤鉴定经疏水互作色谱后的 -乳球蛋白的纯度色谱图， -乳 球蛋白纯度99%； 图7为凝胶过滤鉴定经疏水互作色谱后的重组人 -乳清白蛋白的纯度色 谱图， 重组人 -乳清白蛋白纯度95%； 图8为凝胶过滤鉴定经疏水互作色谱后的牛 -乳清 白蛋白的纯度色谱图， 牛 -乳清白蛋白纯度95%； 图9为凝胶过滤鉴定膜分离后重。

39、组人 - 乳清白蛋白的纯度色谱图， 重组人 -乳清白蛋白纯度99%。 0047 实施例8 0048 对于不含人 -乳清白蛋白的普通动物乳样， 则可通过对上述方法进行简化后分离 纯化动物内源的 -乳清白蛋白和 -乳球蛋白， 即将乳样按实施例1的方法经高速离心脱脂， 采用0.8-1.4 m陶瓷膜微滤技术除菌， 并采用80nm-0.2 m陶瓷膜去除脱脂乳中的酪蛋白， 得 到澄清的乳清， 对乳清进行疏水互作层析色谱， 具体步骤包括： 将乳清上样到用电导率为 130-160ms/cm的(NH)2SO4， 10-50mM、 pH6.5-7.5的磷酸盐缓冲液平衡的Butyl疏水互作层析 柱， 此填料的配基密。

40、度为25-50 mol/ml， 流速为100-300cm/h， 上样过程中收集含有 -乳球 蛋白的穿透液， 得到 -乳球蛋白纯品， -乳球蛋白纯度99%、 回收率92%； 上样完毕用电 导率为130-160ms/cm的(NH)2SO4， 10-50mM、 pH6.5-7.5的磷酸盐缓冲液冲洗层析柱待280nm 吸收信号至基线， 使用电导率为50-80ms/cm的(NH)2SO4， 10-50mM、 pH6.5-7.5的磷酸盐缓冲 液洗脱杂蛋白， 使用电导率为6ms/cm以下、 10-50mM、 pH6.5-7.5的磷酸盐缓冲液洗脱 -乳清 白蛋白， 得到 -乳清白蛋白纯品， 牛源 -乳清白蛋白。

41、纯度95%， 回收率60%。 0049 虽然， 上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述， 但在 本发明基础上， 可以对之作一些修改或改进， 这对本领域技术人员而言是显而易见的。 因 此， 在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进， 均属于本发明要求保护的范围。 说明书 6/6 页 8 CN 104513305 B 8 图1 图2 图3 说明书附图 1/4 页 9 CN 104513305 B 9 图4 图5 图6 说明书附图 2/4 页 10 CN 104513305 B 10 图7 图8 说明书附图 3/4 页 11 CN 104513305 B 11 图9 说明书附图 4/4 页 12 CN 104513305 B 12 。