相关申请
该申请要求享有对2012年8月30日提交的美国临时申请号61/695,116的优先权。该申请的内容在此通过引用以其整体并入本文。
序列表的并入
于2013年8月30日创建并且大小为1 KB、命名为“41432-508001WO_ST25.txt”的文本文件的内容，在此通过引用以其整体并入本文。
发明领域
本发明涉及通过在分离或提取方法的不同步骤中使用对照颗粒从微泡（microvesicle ）分离微泡级分和核酸的试剂盒和方法。
背景
将通过细胞释放的膜结合小泡描述为“微泡”。微泡可以包括外来体、外来体样颗粒、前列腺小体、外泌体（dexosomes）、肿瘤细胞胞外体（texosomes）、核外颗粒体、核内体（oncosomes）、凋亡小体、逆转录样颗粒和人内源性逆转录病毒（HERV）颗粒。研究已经显示处于正常和病理状况的多种不同细胞类型释放微泡（Thery 等, 2002）。重要地，已经显示微泡含有DNA、RNA和蛋白质。最近的研究已经显示微泡的内容物的分析已经揭示生物标记物或疾病相关基因可以被检测，因此，证明了微泡分析用于帮助对疾病或其它内科疾病的诊断、预后、监测或治疗选择上的价值。
使用了多种分子诊断测定，以检测疾病相关生物标记物，并且为患者、医生、临床医师和研究者提供了有价值的信息。用于诊断目的的从微泡提取的核酸的分析由于其非侵入的性质（微泡可以容易地收集到其中）而具有广范的影响。微泡分析的使用替代侵入性活组织检查（invasive tissue biopsy）会积极影响患者福利，改善进行纵向疾病监测的能力，并且改善获得表达概况的能力，即使在当组织细胞不容易得到时（例如，在卵巢癌和脑癌患者中）。因此，需要开发额外的工具以确保在临床领域使用的诊断性微泡分析的一致性、可靠性和适用性。没有适当的内部对照，核酸分析结果可能是不一致的并且因此对临床诊断不实用。为解决在微泡诊断领域内的该需求，本发明提供了使用对照颗粒作为用于分离微泡和/或从微泡提取核酸方法的内部对照的方法和试剂盒。
发明概述
本发明涉及使用对照颗粒作为内部对照，用于分离微泡和/或从微泡提取核酸的方法，和可用于该方法的对照颗粒。特定地，本文中提供的方法对鉴别从分离的微泡中提取的高质量提取的核酸样品有用，其适合用于进一步诊断或预后分析。
本发明特征在于从生物样品分离微泡和/或从微泡提取核酸的方法，其通过：a）向生物样品添加含有对照核酸的已知量的对照颗粒，b）从生物样品分离级分，c）从级分提取核酸，d）计算从分离和核酸提取步骤回收的对照颗粒的量，并且e）确定对照颗粒回收的量（在（d）中计算）是在预定数值范围内，以鉴别微泡分离和/或核酸提取的质量。提取的核酸包括来自微泡的核酸和来自对照颗粒的对照核酸。计算步骤可以包括确定对照颗粒的对照核酸的表达水平或拷贝数量。在另一个实施方案中，对照颗粒可以在微泡级分分离后和核酸提取步骤之前添加至样品。
如果在步骤（d）中计算的对照颗粒的量在预定数值范围内，则微泡分离和/或核酸提取的质量是高的。如果在步骤（d）中计算的对照颗粒的量不在预定数值范围内（即，在范围之外），则微泡分离和/或核酸提取的质量是高的。
预定数值范围根据参考样品（即，患者组群（ patient cohort））的集合确定。例如，计算来自参考样品集合的全部回收的或检测的对照核酸的表达水平（即，Ct值）的平均值和标准偏差。预定数值范围可以是，例如，距离参考样品集合的回收的对照核酸的平均表达水平（即，Ct值）1个标准偏差、2个标准偏差、3个标准偏差、4个标准偏差或5个标准偏差。
本发明提供了用于分离微泡和从分离微泡提取核酸的方法的内部对照，以鉴别对于疾病相关生物标记物的准确的和可靠的进一步分析为高质量的提取的核酸样品。例如，对于与医疗状况或疾病相关的至少一种生物标记物的存在、不存在或水平的改变，对提取的核酸进一步分析，以诊断、预测或监测疾病或医疗状况。通过实时PCR（real-time PCR）执行对照核酸表达水平或至少一种生物标记物的存在、不存在或水平改变的分析。
对照颗粒是病毒颗粒，诸如RNA噬菌体。优选地，对照颗粒是Q-β噬菌体。对照核酸是编码Q-β外壳蛋白的基因或其片段。对照颗粒可以是天然生成的或重组的或工程改造的病毒颗粒。
生物样品是体液。体液可以是从主体身体的任何部位分离的流体，优选地外周位置，包括但不限于，例如，血液、血浆、血清、尿液、痰、脊髓液、脑脊液、胸膜液、乳头抽吸液、淋巴液、呼吸道，肠道和泌尿生殖道流体、泪液、唾液、乳汁、来自淋巴系统流体、精液、脑脊液、内脏系统流体、腹水、肿瘤囊肿液、羊水和其组合。例如，体液是尿液、血液、血清或脑脊液。
在任何前述方法中，核酸是DNA或RNA。RNA的实例包括信使RNA、转移RNA、核糖体RNA、小RNA（非蛋白质编码RNA、非信使RNA）、微小RNA、piRNA、exRNA、snRNA和snoRNA。
本发明提供了包含对照颗粒的用于从生物样品分离微泡级分和/或微泡核酸，用于与疾病或医疗状况相关的至少一种生物标记物的检测的试剂盒，其包括已知量的包含对照核酸的对照颗粒，用于对照核酸杂交和扩增的引物，和任选地，用于生成标准曲线的一组已知浓度的对照核酸，和任选地，在从生物样品分离微泡级分中使用上述试剂的说明书。
本发明同样提供了用于确定从微泡级分的核酸提取和/或核酸提取的质量的试剂盒，其包括已知量的包含对照核酸的对照颗粒，用于对照核酸杂交和扩增的引物，和任选地，用于生成标准曲线的一组已知浓度的对照核酸，和任选地，使用上述试剂用于确定从生物样品的微泡提取和/或核酸提取的质量的说明书。
本发明的多个方面和实施方案现在将详细描述。将会理解的是可以在不偏离本发明范围的情况下进行细节的修饰。进一步的，除非上下文中另有要求，单数术语应当包括复数并且复数术语应当包括单数。
确定的全部专利、专利申请和出版物，为描述和公开目的明确通过引用并入本文，例如，在这些出版物中描述的方法学可结合本发明使用。提供这些出版物仅由于它们在本申请提交日之前公开。在这点上没有任何情况应理解为承认发明人无权凭借在先发明或为了任何其它理由先于这样的公开。全部关于日期的声明或关于这些文件内容的表示是基于对于申请人可以得到的信息，并且不应构成对这些文件的日期和内容的正确性的任何承认。
附图简述
图1A是在血清样品中Q-β外壳蛋白基因的RT-PCR分析中的扩增曲线绘图。X轴代表PCR扩增循环的数量。Y轴代表标准化荧光，其指示了由给定的PCR条件集合产生的信号量级。
图1B是用于在RT-PCR分析中绘制在血清样品中Q-β外壳蛋白基因的Ct值的标准曲线。X轴代表每个反应拷贝数量的浓度。Y轴代表在RT-PCR分析中的Ct值。
图2A是在尿液样品中Q-β外壳蛋白基因的RT-PCR分析中的扩增曲线绘图。X轴代表PCR扩增循环的数量。Y轴代表标准化荧光，其指示了由给定的PCR条件集合产生的信号量级。
图2B是用于在RT-PCR分析中在尿液样品中绘制Q-β外壳蛋白基因的Ct值的标准曲线。X轴代表每个反应拷贝数量的浓度。Y轴代表在RT-PCR分析中Ct值。
图3A是在尿液样品中白蛋白基因和18s rRNA的RT-PCR分析中的扩增曲线绘图。X轴代表PCR扩增循环的数量。Y轴代表标准化荧光，其指示了由给定的PCR条件集合产生的信号量级。
图3B是在尿液样品中GAPDH 基因的RT-PCR分析的扩增曲线绘图。X轴代表PCR扩增循环的数量。Y轴代表标准化荧光，其指示了由给定的PCR条件集合产生的信号量级。
图4是通过连续去除具有高Q-β Ct的样品在样品中关联PCA3 AUC值的两幅图。在上图中，Y轴代表AUC值并且X轴代表通过减少Q-β至平均Q-β的距离（标准偏差）排除的样品。在下图中，Y轴代表用作截止值的Q-β至平均值的距离（标准偏差）并且X轴代表通过减少Q-β至平均Q-β的距离（标准偏差）排除的样品。
发明详述
本发明部分地基于下列发现：在用于从生物样品中分离微泡和提取微泡核酸的方法中可以使用Q-β噬菌体作为对照颗粒。在分离和/或提取过程期间通常使用内部对照以确定方法的效率，或所获得的分离或提取的质量。本方法使用与微泡大小相似的对照颗粒（诸如Q-β噬菌体）作为微泡分离和从分离的微泡提取的核酸的效率、质量或纯度的对照。
由细胞释放的直径< 0.8μm的全部囊泡在本文中共同地指的是微泡。这可以包括外来体、外来体样颗粒、前列腺小体、外泌体（dexosomes）、肿瘤细胞胞外体（texosomes）、核外颗粒体、核内体（oncosomes）、凋亡小体、逆转录样颗粒和人内源性逆转录病毒（HERV）颗粒。对来自多种细胞来源的微泡关于蛋白质和脂质含量已经进行了充分研究。
微泡在先前已经显示出是有价值的诊断和预后工具。初步研究证明成胶质细胞瘤来源的微泡可以从成胶质细胞瘤患者的血清中分离。重要地，这些微泡含有与肿瘤细胞相关的mRNA。这些微泡中的核酸可以用作有价值的生物标记物，用于肿瘤诊断、表征和预后。例如，通过分析随时间或随疗程是否获得了其它突变，可以使用微泡中的核酸监测随时间的肿瘤进展。此外，可以同样确定疾病相关基因的水平，并且编译为基因表达概况，其可以与参考概况相比较，以诊断或预测疾病或监测疾病或治疗方案的进程。
本发明基于如下发现：Q-β噬菌体颗粒可以在从生物样品进行的微泡纯化/分离和微泡核酸提取的多个步骤中添加至样品以充当内部对照。因此，本发明提供了在从生物样品的微泡中提取核酸期间添加对照颗粒的方法，其中对照颗粒充当用于分离微泡和从其中分离核酸的内部对照。在一个方面，在纯化微泡之前将对照颗粒添加至生物样品。在另一个方面，在核酸提取之前将对照颗粒添加至纯化的微泡级分。微泡级分或提取的微泡核酸的质量或纯度可以直接地影响用于疾病诊断、表征和预后的生物标记物测定的后续进程的效率和敏感性。考虑到在临床领域准确和敏感的诊断检验的重要性，使用在本文中描述的内部对照以评估微泡纯化和微泡核酸提取的质量，以增加基于微泡的测定和诊断的可靠性和敏感性。特别地，在本文中描述的方法和对照颗粒可以用于鉴定适合用于对诊断、预后和治疗应用的疾病相关的生物标记物的进一步分析的从微泡的核酸提取。相似地，在本文中描述的方法和对照颗粒可以用于鉴定不适合在诊断、预后和治疗应用中用于疾病相关生物标记物的进一步分析或会产生不准确结果的核酸提取。因此，本文中描述的方法可以鉴别高质量的微泡分离和核酸提取与低质量的微泡分离和核酸提取，使得高质量的微泡分离和核酸提取在后续分析步骤（即，生物标记物分析）中产生准确的结果。
对照颗粒
本发明特征在于对照颗粒作为分离微泡和/或从分离的微泡提取核酸的内部对照的用途。在一些方面中，对照颗粒的使用帮助微泡分离和/或从分离的微泡的核酸提取的效率和/或质量的评估。
如本文使用的，“对照颗粒”共同地指的是在微泡分离过程期间的一些时间点（例如，在微泡分离之前或核酸提取之前）添加的微泡大小范围的颗粒（例如，直径小于0.8 μm）。对照颗粒含有对照核酸，诸如DNA或RNA。特别地，对照核酸含有靶序列或基因，测定或测量所述靶序列或基因以确定在分离或提取过程后回收的对照颗粒的量以鉴别高质量的微泡分离或核酸提取。例如，对照颗粒是病毒颗粒或病毒体，诸如Q-β噬菌体（在本文中也称为Q-β颗粒）。
在一些实施方案中，对照颗粒是病毒颗粒。如本文所用的，病毒颗粒共同地指的是病毒、病毒体和病毒样颗粒。病毒颗粒可以是天然生成的、修饰的、重组的或工程改造的。
病毒是依赖于其感染的宿主细胞以进行繁殖的小的感染剂。病毒可以感染生物的全部类型，从动物和植物至细菌和古细菌。病毒颗粒包括：病毒基因组；称为衣壳的保护基因组的蛋白质外壳；和包围衣壳的称为病毒包膜的脂质膜。病毒具有DNA或RNA基因组，并且分别地称为DNA病毒或RNA病毒。病毒的绝大多数具有RNA基因组。病毒基因组可以是单链或双链的，和线性的或环形的。病毒基因组大小各不相同；最小的是2千碱基并且只编码两种蛋白质，而最大的病毒基因组超过1.2百万碱基并且编码超过1,000种蛋白质。通常，由于当复制时更高的错误率，RNA病毒具有比DNA病毒更小的基因组大小。RNA病毒还具有最大大小上限限制。病毒颗粒范围大小可以从0.005至0.3μm（或5-300 nm）。
在一个实施方案中，对照颗粒是DNA病毒。本发明的DNA病毒包括，但不限于，以下DNA病毒科的成员：腺病毒科、乳头瘤病毒科、细小病毒科、孢疹病毒科、痘病毒科、肝脱氧核糖核酸病毒科、多瘤病毒科和指环病毒科。
在另一个实施方案中，对照颗粒是RNA病毒。本发明的RNA病毒包括，但不限于，以下RNA病毒科的成员：微小核糖核酸病毒科、黄病毒科、丝状病毒科、正粘病毒科、副粘液病毒科、披膜病毒科、弹状病毒科和逆转录病毒科。例如，RNA病毒是脊髓灰质炎病毒、肠病毒、柯萨基病毒、埃可病毒、甲型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、脑心肌炎病毒(EMCV)、口蹄疫病毒(FMDV)、登革病毒、黄热病病毒、西尼罗病毒、牛病毒性腹泻病毒 (BVDV)、东方脑炎、西方脑炎、风疹病毒、人体免疫缺陷病毒、猴免疫缺陷病毒 (SIV)、猫免疫缺陷病毒、马尔堡病毒、埃博拉病毒、流感病毒、麻疹病毒和狂犬病病毒。
可以感染细菌的病毒称为细菌噬菌体，或噬菌体。估计至少在自然中存在几十万噬菌体物种。根据形态学（例如，有尾的、多面的、丝状的或多形的）和生理学（例如，线性的或环形的基因组、单链或双链基因组或无衣壳）将噬菌体分类。将噬菌体分为11个家族：有尾噬菌体目、肌尾噬菌体科、长尾噬菌体科、短尾噬菌体科、微小噬菌体科、覆盖噬菌体科、复层病毒科、光滑病毒科、囊状噬菌体科、丝状噬菌体科和芽生病毒科。两类RNA噬菌体是光滑病毒科和囊状噬菌体科。光滑病毒科的特征在于单链RNA基因组，并且囊状噬菌体科的特征在于双链RNA基因组。
在一个实施方案中，对照颗粒是DNA噬菌体，其基因组是DNA。例如，噬菌体是Ancholeplasma噬菌体、大肠杆菌噬菌体、ФX174、螺原体噬菌体或Mac-1噬菌体。
在优选的实施方案中，对照颗粒是RNA噬菌体。例如，对照颗粒选自Q-β、MS2、f2、R17、GA、SP和Ф6。
优选地，病毒颗粒是Q-β噬菌体。Q-β是光滑病毒科的成员，并且其特征在于线性的、单链RNA基因组。Q-β噬菌体基因组由3个基因组成，其编码4种病毒蛋白质：外壳蛋白、成熟蛋白、裂解蛋白和RNA复制酶。Q-β具有二十面体衣壳直径约26 nm。由于其与平均微泡的相似大小，Q-β可以使用本文中描述的用于分离微泡的相同纯化方法从生物样品容易地纯化。此外，Q-β病毒的单链基因结构的低复杂性对使用Q-β噬菌体基因作为在基于扩增的核酸测定中的对照是有利的。
在其它实施方案中，对照颗粒是工程改造的或重组的病毒颗粒，其中病毒颗粒的至少一种组分（例如，基因组的基因或其片段）是通过本领域已知的重组DNA或分子生物学技术修饰、合成或导入。在其它实施方案中，对照颗粒含有通过重组技术部分地或全部地修饰、合成或导入的基因组。例如，重组病毒颗粒含有包括与用于重组RNA基因组的特定序列的扩增的引物相对应的特异核苷酸序列的重组RNA基因组。用于扩增对照核酸和目的基因的相同引物组的使用消除了对照病毒颗粒引物的任何干扰的风险和/或减少对照病毒颗粒引物的背景信号以及减少由对照病毒颗粒引物的错误引发。产生重组病毒颗粒的方法是本领域已知的。修饰Q-β噬菌体的方法可以同样在Villanova等(Villanova 等, 2007)中发现。
在其它实施方案中，对照颗粒是含有通过重组DNA方法产生的对照核酸的工程改造的微颗粒。对照颗粒是由培养的细胞生产的微泡。
对照颗粒在微泡分析中的用途
在微泡分离和/或核酸提取后回收的对照颗粒的检测和定量对鉴别高质量的微泡制备物和/或核酸制备物与低质量的微泡制备物和/或核酸制备物是有用的。如本文所用的，“微泡制备物”指的是在分离过程后包含微泡的级分。如本文所用的，“核酸制备物”指的是从分离的微泡中提取的核酸。
在一些实施方案中，对照颗粒具有目的微泡大小相似的大小。可以基于分析的微泡大小范围选择对照颗粒用作对照，使得对照颗粒具有微泡相似的大小。例如，对照颗粒比分离的微泡大不到2%、5%、10%、15%、20%或50%。例如，对照颗粒比分离的微泡小不到2%、5%、10%、15%、20%或50%。考虑到与微泡的大小相似性，如果在微泡提纯步骤前添加至生物样品，对照颗粒可以与微泡共同纯化。
本发明的对照颗粒含有至少一种被检测的对照核酸。对照核酸可以是RNA或DNA。对照核酸可以是双链或单链。优选地，对照核酸具有低复杂性。将低复杂性区域定义为只由数个元件（即，编码区、非编码区和重复序列）构成的区域。具有低复杂性对照核酸的对照颗粒是优选的，因为低复杂性减少了在扩增分析步骤中在靶微泡中目的基因的潜在的错误引发。
本发明的对照核酸包含对照靶基因或对照靶序列或是对照靶基因或对照靶序列，所述对照靶基因或对照靶序列被检测和/或定量以在微泡分离和核酸提取过程后确定样品中回收的对照颗粒的量。在一个方面中，对照颗粒是Q-β噬菌体并且对照靶基因是Q-β外壳蛋白基因。对照靶基因通过核酸扩增技术测量，使用了识别对照靶基因的特异引物。在一些方面中，使用探针以检测扩增的对照靶基因。在一些方面中，对照核酸或对照靶基因通过RT-PCR分析测量。
在微泡分离之前将已知量或数量的对照颗粒添加至生物样品。在添加至样品前将对照颗粒定量。对照颗粒的已知量或拷贝数量可以通过本领域已知方法确定，包括但不限于，组织培养感染剂量、噬斑形成单位、集落形成单位、基于流式细胞术方法和ELISA测定。对照颗粒或Q-β颗粒的已知量可以是25、50、75、100、150、200、300、350、400、450、500、1,000或5,000个拷贝。优选地将Q-β颗粒的50、100、200或500个拷贝添加至生物样品。最优选地，将Q-β颗粒的100个拷贝添加至生物样品。向生物样品添加的Q-β颗粒的拷贝数量可以基于Q-β颗粒感染靶细胞的能力进行计算。因此，Q-β颗粒的拷贝数量与使用的Q-β颗粒的集落形成单位有关。
可以将对照颗粒在微泡级分分离前添加至生物样品的微泡样品，诸如尿液或血清。在该情况中，对照颗粒在微泡分离和核酸提取步骤期间存在。因为微泡和对照颗粒大小相似，微泡分离程序会同样成功地分离对照颗粒。因此，对照颗粒的回收指示了微泡的回收，并且因此，对照颗粒的高回收指示了获得的微泡制备物的高质量。
对照颗粒可以在微泡分离步骤后，和在核酸提取步骤前添加至微泡级分，从而产生了包含从生物样品分离的微泡和对照颗粒的混合物。来自对照颗粒和微泡的核酸在提取步骤提取。因此，来自对照颗粒的对照核酸的回收和/或质量指示了来自微泡的核酸的回收和/或质量，并且因此，对照核酸的高质量指示了产生的包括微泡核酸的核酸制备物的高质量。在其它实施方案中，对照颗粒可以在微泡分析期间的其它步骤添加。
如本文所用的，回收的对照颗粒的计算，指的是在微泡分离和/或核酸提取后对照核酸的定量或测量。对照核酸的表达水平可以使用多种领域内认可的任何技术测量，包括但不限于，实时定量PCR。例如，RT-PCR分析为每个反应确定Ct（循环阈值）值。在RT-PCR中，阳性反应通过荧光信号的积累检测。Ct值定义为越过阈值的荧光信号需要的循环数量（即，超过背景水平）。Ct水平与样品中靶核酸或对照核酸的量成反比（即，Ct水平越低，样品中对照核酸的量越大）。
在另一个实施方案中，对照核酸的拷贝数量可以使用多种领域内认可的任何技术测量，包括但不限于，RT-PCR。对照核酸的拷贝数量可以使用本领域已知方法确定，诸如通过生成或使用校准或标准曲线。
标准曲线可以在后续的定量分析中（例如，RT-PCR）使用标准核酸的已知浓度和拷贝数量生成。标准核酸与对照颗粒的对照核酸相似或同一（例如，相似或同一的序列）。如本文公开的，使用相同的方法定量标准靶基因，以定量对照靶基因。
例如，使用标准核酸的10倍稀释生成标准曲线。在一些方面中，通过使用标准核酸的至少2、3或4个已知浓度/拷贝数量生成标准曲线。标准核酸的稀释样品通过本文使用的方法，例如RT-PCR或定量PCR分析进行定量。优选地，稀释系列在与对于微泡分离和/或核酸提取方法的质量被分析的样品相同的板上分析。使用相对于已知浓度的来自每个稀释的RT-PCR分析的计算的Ct或拷贝数，生成标准曲线。可以使用标准曲线的外推以在对照颗粒定量后计算对照颗粒的拷贝数量。通过比较对于分离和/或提取的质量被分析的样品的Ct值和校准曲线的Ct值，可以确定在受分析样品中回收的对照颗粒的精确拷贝数量。
拷贝数量可以通过拟合以下公式的曲线
Ct = b + a*log10(校准_拷贝)
到在板上的稀释系列的已知校准点以获得“校准曲线”进行计算。样品的拷贝数量随后通过以下公式计算
样品_拷贝 = 10((Ct_样品–b)/a)
该拷贝数量计算对每个样品独立地完成。
计算的对照核酸的拷贝数量或表达水平（即，Ct值）是从微泡分离和/或核酸提取过程回收的对照颗粒或Q-β颗粒的量或数量。
微泡分离和/或核酸提取的质量随后通过比较回收的对照颗粒（或对照核酸）的量或计算的拷贝数量与预定截止值确定。如果对照颗粒的计算的量比预定截止值更高，则微泡分离和/或核酸提取的质量高。如果对照颗粒计算的量比预定截止值低，则微泡分离和/或核酸提取的质量低。在另一个方面中，如果对照颗粒计算的量在微泡分离或核酸提取前首先添加至生物样品中的对照颗粒的已知量的1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45% 或 50%以内，则分离和/或提取的质量高。
在一些实施方案中，预定的截止值是来自定量分析的测量值，例如，对于RT-PCR分析，预定的截止值是Ct值。例如，如果Ct值低于25、低于26、低于27、低于28、低于29或低于30，则微泡分离或核酸提取的质量高。如果Ct值高于27、高于28、高于29或高于30，则微泡分离或核酸提取的质量低。
在一个方面中，预定数值范围指示生物样品已经成功地处理。在一个方面中，预定数值范围指示已经将微泡级分成功地分离。在一个方面中，预定数值范围指示已经将核酸成功地处理。预定数值范围在微泡分离或核酸提取步骤前向样品添加的对照颗粒的数量的50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%内。优选地，预定数值范围大于向样品添加的对照颗粒的数量的80%。优选地，预定数值范围大于向样品添加的对照颗粒的数量的85%。更优选地，预定数值范围大于向样品添加的对照颗粒的数量的90%。最优选地，预定数值范围大于向样品添加的对照颗粒的数量的95%。在一些实施方案中，预定数值范围通过从定量分析测量的值指示，例如，对于RT-PCR分析，预定数值范围是Ct值，在25-30、20-30、15-30或10-30之间。
在其它实施方案中，将回收的对照颗粒的量（即，对照核酸检测的表达水平，或Ct值）与预定数值范围比较。预定数值范围从参考样品的集合（即，患者组群）确定。参考样品的集合已经使用本文公开的微泡和核酸提取方法处理。在微泡分离之前或在核酸提取之前将对照颗粒添加至样品。计算来自参考样品集合的回收的或检测的对照核酸的表达水平的平均值（即，Ct值）。同样计算来自参考样品集合的全部回收的或检测的对照核酸的平均值的标准偏差。预定数值范围可以是，例如，距离参考样品集合的回收的对照核酸的平均表达水平（即，Ct值）1标准偏差、2标准偏差、3标准偏差、4标准偏差或5标准偏差。优选地，值的预定是距离参考样品集合的回收的对照核酸的平均Ct值的3标准偏差。例如，如果来自生物样品的回收的对照核酸的Ct值在参考样品的集合的回收对照核酸的平均Ct值的3标准偏差内，则提取的核酸（或核酸制备物）是高质量的并且足以用于进一步的生物标记物分析。如果从生物样品回收的对照核酸的Ct值不在参考样品集合的回收的对照核酸的平均Ct值的3标准偏差内，或在3标准偏差之外，则提取的核酸（或核酸制备物）是低质量的并且不足以用于进一步的生物标记物分析。低质量的核酸制备物在用于对患者的诊断、预后或治疗选择的生物标记物分析中不会产生准确的或可靠的结果。
将未检测到对照核酸的样品（即，无qPCR或RT-PCR信号）同样视为低质量并且不适合用于进一步的生物标记物分析。
参考样品的集合可以包括没有诊断出疾病，例如癌症的健康个体。参考样品的集合可以包括已经诊断出疾病（例如癌症），或具有阳性活组织检查状态的个体。癌症可以是任何类型的癌症或癌前状况。这包括，不限于，上皮细胞癌症，诸如肺癌、卵巢癌、宫颈癌、子宫内膜癌、乳腺癌、脑癌、结肠癌、前列腺癌。同样包括胃肠癌、头颈癌、非细小细胞肺癌、神经系统癌症、视网膜癌症、皮肤癌、肝癌、胰腺癌、生殖器癌和膀胱癌、黑素瘤和白血病。
本发明中公开的方法可以用于确定微泡制备物和/或核酸制备物是否具有足够的质量用于对诊断、预后和治疗应用的至少一种疾病相关生物标记物的进一步分析。例如，如果使用本文公开的方法确定的微泡分离或核酸提取的质量是高的，则可以使用提取的核酸（或核酸制备物）用于进一步分析，以帮助对疾病或医疗状况的诊断、预后或治疗选择。相反地，如果使用本文公开的方法确定微泡分离或核酸提取的治疗是低的，则提取的核酸不应当用于进一步的分析，因为来自分离和/或提取方法的低质量或效率指示任何进一步的分析可能是不准确的。
本发明同样提供了使用多种对照颗粒用于独立地确定相同样品的多个步骤（诸如微泡分离和核酸提取）的质量或效率的方法。例如，以该方式，微泡纯化和核酸提取的质量可以在用于单一分析的单一样品中评估。例如，可以将Q-β噬菌体对照颗粒在微泡分离步骤前添加并且可以将MS2噬菌体对照颗粒在RNA提取步骤前添加。在提取的RNA（其将会含有来自微泡、Q-β噬菌体和MS2噬菌体的RNA）反转录后，可以使用实时PCR和Q-β和MS2特异性探针定量RNA水平。多个、不同的对照颗粒的使用将允许对每个样品的微泡纯化和RNA提取的质量的同时分析。
作为诊断和预后工具的微泡
本发明是基于如下发现：在微泡分析期间的多个步骤Q-β颗粒对样品的添加充当对获得的提取的核酸具有高回收率和产率的高质量微泡分离和/或核酸提取的对照。微泡的质量或纯度可以直接地影响测定生物标记物用于疾病或医疗状况的诊断、表征和预后的后续过程的效率和敏感性。
例如，首先处理生物样品以移除细胞和其它大的污染物。该第一预处理步骤可以通过使用0.8μm过滤器完成，以将细胞和其它细胞碎片从微泡分离。任选地，可以使用离心（即，缓慢的离心）以进一步将污染物从微泡分离。对照颗粒以已知量添加至预处理后的样品。执行额外的处理以分离含有微泡和对照颗粒的级分。合适的额外的处理步骤包括过滤浓缩器和差速离心。至少一次洗涤含有微泡和对照颗粒的级分以移除额外的污染物。该级分可以使用生理缓冲液，诸如磷酸盐缓冲盐水洗涤一次、两次、三次、四次或五次。将RNA酶抑制剂添加至级分中，优选地添加至位于过滤浓缩器上层室（upper chamber）的级分中。微泡和对照颗粒的裂解可以任选地在过滤浓缩器的上层室中执行。
从生物样品分离微泡和从分离的微泡提取核酸的方法可以通过多种方法实现。一些这样的方法在公开的WO 2009/100029和WO 2011/009104中描述，其两者均以其整体通过引用并入本文。在一个实施方案中，方法包括以下步骤：通过低速离心和/或通过0.8 μm过滤器过滤从体液移除细胞；在约4℃以约120,000 xg离心上清液/过滤液约0.5小时；使用预裂解溶液（例如，足够量的RNA酶抑制剂和/或pH缓冲溶液和/或蛋白酶）处理团块；并且裂解团块用于核酸提取。团块中微泡的裂解和核酸的提取可以使用本领域已知的多种方法实现（例如，使用商业上可以得到的试剂盒（例如，Qiagen）或根据本领域已知的标准程序和技术的苯酚-氯仿提取）。至少，可以在微泡分离步骤之前或RNA提取步骤之前添加对照颗粒。
从生物样品分离微泡的额外的方法是本领域已知的。例如，由Raposo 等 (Raposo 等, 1996)描述的差速离心的方法。在美国专利号6,899,863和6,812,023中描述的阴离子色谱和/或凝胶渗透色谱的方法。在美国专利号7,198,923中描述的蔗糖密度梯度或细胞器电泳的方法。在(Taylor和Gercel-Taylor, 2008)中描述的磁激活细胞分选（MACS, Miltenyi）的方法。在(Cheruvanky 等, 2007)中描述的纳米膜超滤浓缩器的方法。优选地，微泡可以通过新发展的微芯片技术（microchip technology）从主体的体液鉴定并分离，所述技术使用独特的微流体平台以有效地和有选择地将肿瘤来源的微泡分开。如在Nagrath等（Nagrath等，2007）的文章中描述的，该技术可以如文章教导的适用于使用相似的捕获和分离原理鉴定和分离微泡。对于其这些方法的教导，前述的每个参考文献通过引用并入本文。
在一个实施方案中，富集了那些来源于特定细胞类型的从体液分离的微泡，例如，肺细胞、胰腺细胞、胃细胞、肠细胞、膀胱细胞、肾细胞、卵巢细胞、睾丸细胞、皮肤细胞、结肠细胞、乳腺细胞、前列腺细胞、脑细胞、食道细胞、肝细胞、胚盘细胞、胎儿细胞。因为微泡通常携带表面分子，诸如来自它们供体细胞的抗原，可以使用表面分子以鉴定、分离和/或富集来自特定供体细胞类型的微泡(Al-Nedawi 等, 2008; Taylor和Gercel-Taylor, 2008)。这样，可以分析来源于不同的细胞群体的微泡的RNA含量。例如，肿瘤（恶性的和非恶性的）微泡携带肿瘤相关表面抗原并且可以通过这些特异的肿瘤相关表面抗原被检测、分离和/或富集。在一个实例中，表面抗原是上皮细胞粘附分子（EpCAM），其对来自肺、结肠、乳腺、胰腺、头颈和肝来源的，但是不是血液细胞来源的癌的微泡是特异的（Balzar 等, 1999; Went 等, 2004）。在另一个实例中，表面抗原是CD24，其是对尿液微泡特异的糖蛋白（Keller 等, 2007）。在还另一个实例中，表面抗原选自分子CD70、癌胚抗原（CAE）、EGFR、EGFRvIII和其它变体、Fas配体、TRAIL、转铁蛋白受体、p38.5、p97和HSP72。此外，肿瘤特异微泡可以由表面标记物诸如CD80和CD86的缺失表征。
来自特定细胞类型的微泡的分离可以例如，通过使用对期望的表面抗原特异的抗体、适配子、适配子类似物或分子印迹聚合物完成。在一个实施方案中，表面抗原是对癌症类型特异的。在另一个实施方案中，表面抗原是对细胞类型特异的，所述细胞类型不需要是癌的。基于细胞表面抗原的微泡分离的方法的一个实例在美国专利号7,198,923中提供。如在例如美国专利号5,840,867和5,582,981、WO2003/050290和由Johnson 等的出版物(Johnson 等, 2008)中描述的，适配子和它们的类似物特异地结合表面分子并且可以用作搜索细胞类型特异微泡的分离工具。如在例如美国专利号6,525,154、7,332,553和7,384,589和由Bossi 等的出版物 (Bossi 等, 2007)中描述的，分子印迹聚合物同样特异地识别表面分子，并且是用于搜索和分离细胞类型特异微泡的工具。对于其这些方法的教导，前述的每个参考文献通过引用并入本文。
在一些实施方案中，可以有利的或以其它方式期望的在分析微泡的核酸之前扩增微泡的核酸。核酸扩增的方法是本领域通常使用并且普遍已知的，在本文中描述了很多实例。如果期望，可以执行扩增，使得其是定量的。定量扩增将允许多种核酸的相对量的定量确定，以生成基因或表达概况。
在一个实施方案中，从微泡提取的核酸是DNA。在一个实施方案中，从微泡提取的核酸是RNA。RNA可以包括信使RNA、转移RNA、核糖体RNA、小RNA（非蛋白质编码RNA、非信使RNA）、微小RNA、piRNA、exRNA、snRNA和snoRNA。
在一些方面中，RNA优选地在进一步的扩增前反转录为互补DNA（cDNA）。随后RNA优选地在进一步的扩增前反转录成互补DNA。这样的反转录可以单独的或与扩增步骤组合执行。组合反转录和扩增步骤的方法的一个实例是反转录聚合酶链反应（RT-PCR），其可以进一步修饰为定量的，例如在美国专利号5,639,606中描述的定量RT-PCR，对于此教导，其通过引用并入本文。可以通过核酸扩增分析提取的核酸或互补DNA用于诊断目的。
核酸扩增方法包括，但不限于，聚合酶链反应（PCR）（美国专利号 5,219,727）和它的变体诸如原位聚合酶链反应（美国专利号5,538,871）、定量聚合酶链反应（美国专利号5,219,727）、巢式聚合酶链反应（美国专利号5,556,773）、自持序列复制和它的变体（Guatelli 等, 1990）、转录扩增系统和它的变体（(Kwoh 等, 1989）、Qb复制酶和它的变体（Miele 等, 1983）、冷式PCR（Li 等, 2008)）、BEAMing (Li 等, 2006)或任何其它核酸扩增方法，然后是使用本领域技术人员熟知技术对扩增分子的检测。特别地有用的是那些设计用于检测核酸分子（如果这样的分子以非常低的数量存在）的检测方案。关于它们的这些方法的教导，将前述的参考文献并入本文。在其它实施方案中，核酸扩增的步骤没有执行。反而，直接地分析了提取的核酸（例如，通过下一代测序）。
在分离的颗粒中存在的核酸的分析是定量的和/或定性的。对于定量分析，使用本领域已知方法测量在分离的颗粒中的特定目的核酸的，相对的或绝对的量或表达水平。对于定性分析，使用本领域已知方法鉴定在分离的颗粒中的特定目的核酸的种类，是否是野生型或变体。
本发明同样包括在对照颗粒存在下分析微泡核酸的方法，用于（i）帮助主体的诊断、（ii）监测在主体中疾病或其它医疗状况的进程或复发、或（iii）帮助对正在经历或考虑治疗疾病或其它医疗状况的主体的疗效的评估；其中确定从方法获得的核酸提取中的一种或多种生物标记物的存在或不存在，并且一种或多种生物标记物分别地与疾病或其它医疗状况的诊断、进程或复发或疗效有关。
一种或多种生物标记物可以是遗传畸变的一种或集合，其在本文中用于指在含有核酸的颗粒中的核酸量以及核酸变体。特别地，遗传畸变包括，不限于，基因（例如，致癌基因）或一组基因的过表达、基因（例如，诸如p53或RB的肿瘤抑制基因）或一组基因的低表达、基因或一组基因的剪接变体的选择性产生、基因拷贝数变体（CNV）（例如，DNA双微小体）（Hahn, 1993）、核酸修饰（例如，甲基化、乙酰化和磷酸化）、单核苷酸多态性（SNP）、染色体重排（例如，倒位、缺失和重复）和基因或一组基因的突变（插入、缺失、重复、错义、无义、同义或任何其它核苷酸变化，其突变，在很多情况下，最终影响基因产物的活性和功能，导致选择性转录剪接变体和/或基因表达水平变化），或上述任何的组合。
这样的遗传畸变的确定可以通过技术人员已知的多种技术执行。例如，核酸的表达水平、选择性剪接变体、染色体重排和基因拷贝数可以通过微阵列分析（见，例如，美国专利号6,913,879、7,364,848、7,378,245、6,893,837和6,004,755）和定量PCR确定。特别地，可以使用Illumina Infinium II全基因组基因型分型测定或Agilent Human Genome CGH 微阵列 (Steemers 等, 2006)检测拷贝数量的变化。可以通过在例如，美国专利号No. 7,186,512和专利公开WO2003/023065中描述的方法测定核酸修饰。特别地，可以通过Illumina DNA Methylation OMA003 Cancer Panel确定甲基化概况。SNP和突变可以通过与等位基因特异探针杂交、酶突变检测、错配的异源双链的化学切割（Cotton 等, 1988）、错配碱基的核糖核酸酶切割（Myers 等, 1985）、质谱分析（美国专利号 6,994,960、7,074,563和7,198,893）、核酸测序、单链构象多态性分析（SSCP）（Orita 等, 1989）、变性梯度凝胶电泳（DGGE）（Fischer和Lerman, 1979a; Fischer和Lerman, 1979b）、温度梯度凝胶电泳（TGGE）（Fischer和Lerman, 1979a; Fischer和Lerman, 1979b）、限制性片段长度多态性（RFLP）（Kan和Dozy, 1978a; Kan和Dozy, 1978b）、寡核苷酸连接测定（OLA）、等位基因特异PCR（ASPCR）（美国专利号 No. 5,639,611）、连接酶链反应（LCR）和其变体（Abravaya 等, 1995; Landegren 等, 1988; Nakazawa 等, 1994）、流式细胞异源双链分析（WO/2006/113590）和其组合/修饰进行检测。特别是，基因表达水平可以通过基因表达系列分析（SAGE）技术（Velculescu 等, 1995）确定。通常地，用于分析遗传畸变的方法在大量出版物中报导，不限于本文中引用的那些，并且是技术人员可以得到的。分析的合适方法将取决于分析的特定目的、患者的状况/病史和待检测、监测或治疗的特定的一种或多种癌症、疾病或其它医疗状况。对于它们的这些方法的教导，将前述的参考文献并入本文。
很多生物标记物可以与在主体中的疾病或其它医疗状况的存在或不存在有关。因此，根据本文中公开的方法，对从分离的颗粒提取的核酸中的生物标记物的存在或不存在的检测可以帮助在主体中的疾病或其它医疗状况的诊断。例如，如在WO 2009/100029中描述的，对从患者血清样品中分离的微泡提取的核酸中的EGFRvIII 突变的存在或不存在的检测可以帮助对患者的成胶质细胞瘤的诊断和/或监测。这是因为EGFRvIII突变的表达是对一些肿瘤特异的并且限定了临床不同的神经胶质瘤亚型(Pelloski 等, 2007)。对于另一个实例，如在WO 2009/100029中描述的，从患者尿液样品分离的微泡提取的核酸中的TMPRSS2-ERG融合基因和/或PCA-3的存在或不存在的检测可以帮助患者的前列腺癌的诊断。对于另一个实例，在体液中ERG和AMACR组合的存在或不存在的检测可以帮助患者的癌症的诊断。
进一步的，很多生物标记物可以帮助在主体中监测疾病或医疗状态。因此，根据本文公开的方法，在从分离的颗粒提取的核酸中这样的生物标记物的存在或不存在的检测可以帮助对主体中疾病或其它医疗状况的进程或复发的监测。例如，如在WO 2009/100029中描述的，从器官移植患者分离的微泡提取的核酸中的基质金属蛋白酶（MMP）水平的确定可以帮助监测移植后状态，因为在肾移植后MMP-2的表达水平的显著增加可以指示移植后并发症的发生和/或恶化。相似地，在肺移植后MMP-9的显著地提高的水平表明闭塞性细支气管炎综合征的发生和/或恶化。
还发现很多生物标记物在特定的患者中影响治疗的效果。因此，根据本文公开的方法，从分离的颗粒提取的核酸中这些生物标记物的存在或不存在的检测可以帮助评估在给出的患者中给出的治疗的效力。例如，如在由Furnari 等 (Furnari 等, 2007)的出版物中在表1中公开的，生物标记物，例如，多种基因中的突变，影响了用于脑瘤治疗的化学治疗中特定的药物的效果。从来自患者的生物样品的分离的颗粒的提取的核酸中的这些生物标记物的鉴定可以指导对患者治疗的选择。
在本发明前述方面的某些实施方案中，疾病或其它医疗状况是肿瘤疾病或状况（例如，癌症或细胞增生性疾病）、代谢性疾病或状况（例如，糖尿病、炎症、围产期并发症或与铁代谢有关的疾病或状况）、神经疾病或状况、免疫病症或状况、移植后状况、胎儿状况或病原感染或与感染有关的疾病或状况。
如在本文使用的，术语“生物样品”指的是含有生物材料，诸如DNA、RNA和/或蛋白质的样品。在一些实施方案中，生物样品可以合适地包括来自主体的体液。体液可以是从主体身体的任何部位分离的流体，优选地是外周位置，包括但不限于，例如，血液、血浆、血清、尿液、痰、脊髓液、脑脊液、胸膜液、乳头抽吸液、淋巴液、呼吸道，肠道和泌尿生殖道流体、泪液、唾液、乳汁、来自淋巴系统流体、精液、脑脊液、内脏系统流体、腹水、肿瘤囊肿液、羊水和其组合。在一些实施方案中，作为生物样品使用的优选的体液是尿液。在其它实施方案中，优选的体液是血清。在还其它实施方案中，优选的体液是脑脊液。
合适地可以使用约0.1 ml至约30 ml流体的生物样品体积。流体的体积可以取决于数个因素，例如，使用的流体的类型。例如，血清样品的体积可以是约0.1ml至约2ml，优选地约1ml。尿液样品的体积可以是约10ml至约30ml，优选地约20ml。
术语“主体”意图包括显示或预期具有含有核酸颗粒的全部动物。在特定的实施方案中，主体是哺乳动物，人或非人灵长类动物、犬、猫、马、牛或其它家畜，或啮齿动物（例如，小鼠、大鼠、豚鼠等）。人主体可以是不具有可观察到的异常（例如疾病）的正常人。人主体可以是具有可观察到的异常（例如疾病）的人。可观察到的异常可以被人自身或通过医疗技术人员观察到。术语“主体”、“患者”和“个体”在本文中可互换地使用。
用于病毒对照颗粒使用的试剂盒：
本发明特征还在于试剂盒，其用于从生物样品分离微泡和微泡来源的核酸并鉴别用于与疾病或医疗状况有关的至少一种生物标记物的后续分析或检测的微泡分离或核酸提取的质量。试剂盒包括以下组件：包含对照核酸的已知量的对照颗粒、对照核酸特异性引物和任选地对照核酸特异性探针，任选地，用于生成标准曲线的一组对照核酸的已知浓度稀释液，和任选地，用于从生物样品分离微泡级分的前述试剂使用的说明书。
任选地，试剂盒可以同样包括裂解缓冲液、过滤浓缩器、DNA酶或RNA酶抑制剂，以增加核酸提取的质量或纯度。对照颗粒帮助评价分离或纯化方法中每个步骤的准确定、可靠性和效率。裂解缓冲液破坏微泡以释放它们的核酸内容物。RNA酶抑制剂和DNA酶的使用提高了提取的核酸的质量。使用过滤浓缩器以从生物样品分离和浓缩颗粒。其它本领域已知方法，诸如离心同样可以使用以从生物样品分离颗粒。过滤浓缩器和离心步骤也可以顺序执行，用于微泡和对照颗粒的分离。试剂盒也可以包括适当地详细描述步骤用于使用与从分离的颗粒提取核酸有关的试剂盒组件的说明书。
应当理解的是该发明不限于本文描述的特定的方法学、程序和试剂，其可以是多样的。本文使用的术语学只用于描述特定实施方案的目的，并且不是意图限制本发明的范围，所述范围通过权利要求单独地限定。
公开的主题的实施例在下文描述。公开的主题的其它特征、目的和优点将根据发明详述、附图、实施例和权利要求而显而易见。与本文描述的那些基本相似或等同的方法和材料可以在本公开主题的实践或检验中使用。
实施例
实施例1：Q-β噬菌体作为用于血清RNA分析的内部对照
在该实施例中，使用Q-β噬菌体作为用于来自人血清样品的微泡和RNA提取的内部对照。从正常、健康的人志愿者获得血清样品，并且等分试样至四个1 ml样品（标记为A、B、C和D）。每个等分试样通过0.8 μm 过滤器 (Millipore)过滤并且随后将滤液在-80℃贮存24小时。在样品解冻后，将8 μl SuperaseIn RNA酶抑制剂添加至每个样品并且孵育5分钟。将5 μl Q-β噬菌体（Attostar 登记号BAC200）添加至样品A和C。接下来，将2.5ml PBS添加至全部四个样品并且在120,000 x g在4℃离心60分钟以获得微泡颗粒团块。使用PBS洗涤颗粒并且通过离心获得团块。此时，将5 μl Q-β噬菌体添加至样品B和D。全部四个样品随后使用RNA抑制剂和DNA酶的混合物在室温处理20分钟。
DNA酶和SuperaseIn RNA酶抑制剂混合物按照以下制备并且添加至每个样品：
DNA酶 1和DNA酶缓冲液是来自Ambion的TURBO DNA-freeTM 试剂盒。SuperaseIn 以20单位/μL的浓度使用。
通过氯仿提取法从微泡和颗粒混合物提取RNA。使用700 μl Qiazol裂解缓冲液裂解微泡，并且在每个样品中使用140 μl氯仿提取RNA。在氯仿提取后，将水溶液转移至新的收集管并且添加1.5 X体积的100%乙醇以沉淀RNA。沉淀后，在RNeasy Micro离心柱（Qiagen）中使用700 μl RWT缓冲液将RNA洗涤一次并且随后使用500 μl RPE缓冲液（Qiagen）洗涤两次。在16 μl无核酸酶H2O中洗脱柱上的RNA。
在该实施例中将Q-β外壳蛋白基因作为对照靶基因使用。通过实时PCR (RT-PCR)分析Q-β外壳蛋白基因表达的定量。简单地说，使用VILOTM 试剂盒 (Invitrogen)将来自每个提取的RNA样品的12 μl 反转录为cDNA。反转录反应混合物根据以下方案（表1）制备。
表1.反转录反应混合物方案
(μl) × 1 反应 × 4.4 5X VILO? 反应混合物 4 17.6 10X SuperScript? 酶混合物 2 8.8 RNA (最多达2.5 μg) 12 - 无核酸酶水 2 8.8 总体积 20
反转录在Veriti Thermal Cycler (Applied Biosystems)中在以下条件下执行：25℃ 10分钟，42℃ 70分钟，85℃ 5分钟，并且在将反应贮存在-20℃前维持在4℃。
在每个样品中Q-β外壳蛋白RNA的量通过实时PCR定量。用于Q-β外壳蛋白基因的引物探针来自Attostar 目录号PP250。Q-β外壳蛋白基因正向引物如下：5’-AACGGTTCTTGTGACCCATC -3’ (SEQ ID NO: 1)。Q-β外壳蛋白基因反向引物如下：5’- CGAACAAAAGCTCGTTCCTC -3’ (SEQ ID NO: 2)。Q-β外壳蛋白基因探针如下： 5’ - CGCCAGGCATATGCTGACGTG -3’ (SEQ ID NO: 3)。实时PCR预混液为LightCycler? FastStart DNA Master HybProbe (Roche)。实时PCR混合物根据表2中的方案制备。每个实时PCR样品含有5μl 制备的cDNA，总反应体积为20μl 。实时PCR在以下条件下执行：95℃ 10分钟；95℃ 10秒、55℃ 15秒和72℃20秒的40个循环。
表2.反转录反应混合物方案。
组分 体积 (μl)/反应 H2O 7.8 25mM MgCl2 3.2 10X QB Primers-probe Quasar670-BHQ2 2 10X LightCycler? FastStart DNA Master HybProbe 2 cDNA 样品 5 终反应体积 20
。
为了标准化的目的，将含有Q-β外壳蛋白基因的Q-β质粒DNA（Attostar目录号PLAS200）作为模板在实时PCR中使用。将Q-β质粒DNA以10倍连续稀释在水中，以生成：200 pg/ml、20 pg/ml、2 pg/ml、0.2 pg/ml和0.02 pg/ml的Q-β质粒浓度。0.02 pg/ml质粒溶液在1 μl中含有12个Q-β质粒拷贝。使用在20 pg/ml (60,000 个拷贝/rxn)、2 pg/ml (6,000 个拷贝/rxn)、0.2 pg/ml (600 个拷贝/rxn)和0.02 pg/ml (60 个拷贝/rxn)的5 μl稀释的Q-β质粒作为通过实时PCR分析生成的标准曲线的模板。
样品按照表3中显示的顺序安排。四个等分试样血清样品在毛细管位置1-4。对于样品A和B，在120,000 x g的离心步骤前 (Q-β 之前, QB-B)将Q-β噬菌体添加。对于样品C和D，在120,000 x g 的离心步骤后(Q-β 之后, QB-A)将Q-β噬菌体添加。
表3.实时PCR样品安排
毛细管位置 样品 1 A (QB-B) 2 B (QB-A) 3 C (QB-B) 4 D(QB-A) 5 QB 质粒60000 个拷贝 6 QB 质粒6000 个拷贝 7 QB 质粒600 个拷贝 8 QB 质粒60 个拷贝
全部样品的扩增曲线在图1A中显示。使用Ct值和拷贝数量以生成对实时PCR的标准曲线。如在图1B中显示的，标准曲线的外推给出了在四个血清样品中Q-β外壳蛋白基因的拷贝数量的估计。来自实时PCR的Q-β外壳蛋白基因的Ct值和计算的拷贝数量在表4中显示。在QB-B样品A和B中，Ct值分别地为15.71和12.64。在QB-A 样品 C和D中，Ct值分别地为9.99 和9.61。在120,000 x g的离心步骤期间Q-β外壳蛋白基因拷贝似乎有一些丢失，因为对QB-B 样品的Ct值比对QB-A样品 的Ct值更大（计算的拷贝/反应更小）。
在实时PCR测定中的低Ct值指示了使用微泡RNA提取方法的Q-β噬菌体外壳基因的优异的回收和扩增（特别地当在微泡分离步骤后添加对照颗粒时）。因此，Q-β噬菌体可以作为对血清微泡RNA提取和分析的内部对照使用。
表4.在血清样品中的实时PCR结果
No. 样品 类型 Ct 给定浓度 (拷贝/反应) 计算浓度(拷贝/反应) % 变化 1 A (QB-B) 未知 15.71 1,023,595 2 B (QB-A) 未知 9.99 149,139,538 3 C (QB-B) 未知 12.64 14,814,516 4 D (QB-A) 未知 9.61 208,057,863 5 QB 质粒 60000 个拷贝 标准 18.96 60,000 60,409 0.7% 6 QB 质粒6000 个拷贝 标准 21.75 6,000 5,290 11.8% 7 QB 质粒600 个拷贝 标准 23.99 600 756 26.0% 8 QB 质粒60 个拷贝 标准 27.02 60 54 10.6%
实施例2：Q-β噬菌体作为尿液RNA分析的内部对照
在该实施例中，使用Q-β噬菌体作为用于尿液样品中微泡和RNA提取的内部对照。从正常、健康的人志愿者获得尿液样品并且分为四个20 ml样品（样品1、2、3和4）。每个样品通过添加至过滤浓缩器上层室通过0.8 μm过滤器（Millipore）过滤。
稀释Q-β噬菌体（Attostar 登记号BAC200），使得噬菌体的500个和50个拷贝添加至作为对照的尿液样品。将Q-β噬菌体的500个拷贝添加至样品1和2中。将Q-β噬菌体的50个拷贝添加至样品3和4中。
随后将含有微泡和Q-β颗粒的浓缩的样品在过滤器上通过添加15 ml PBS洗涤三次，并且在约4,500 x g在室温离心过滤器5分钟，随后将每个过滤器膜上保留的颗粒转移至含有50 μl PBS的新管。使用RNeasy Plus Micro 试剂盒(Qiagen)从颗粒提取RNA。首先，将 350 μl裂解缓冲液RLT+10 μl/ml β-巯基乙醇添加至每个样品。随后将裂解产物转移至在2 ml收集管中的DNA Eliminator离心柱（Qiagen）以获得滤液。通过乙醇沉淀法将RNA沉淀。产生的RNA在RNeasy Micro离心柱（Qiagen）中使用700 μl RWT缓冲液洗涤一次并且随后使用 500 μl RPE 缓冲液 (Qiagen)洗涤两次。在16 μl 无核酸酶 H2O中洗脱RNA。
在样品中Q-β外壳蛋白基因表达水平的表达通过RT-PCR分析。为了该目的，通过反转录从提取的RNA生成cDNA。特别地，提取的12 μlRNA使用VILOTM 试剂盒 (Invitrogen)反转录。根据以下方案（表5）制备反转录反应混合物。
表5.反转录反应混合物方案
(μl) × 1 反应 × 4.4 5X VILO? 反应混合物 4 17.6 10X SuperScript? 酶混合物 2 8.8 RNA (至多达2.5 μg) 12 - 无核酸酶水 2 8.8 总体积 20
在Veriti Thermal Cycler (Applied Biosystems)中在以下条件下执行反转录：25℃ 10 分钟、42℃ 70 分钟、85℃ 5分钟并且在将反应贮存于-20℃前维持在4℃。
使用多重实时PCR（multiplex real-time PCR）分析Q-β外壳蛋白连同GAPDH、白蛋白和18s rRNA的水平。每个PCR样品含有2 μl cDNA。用于Q-β外壳蛋白的引物-探针来自 QB Primers-probe Quasar670-BHQ2 (Attostar目录号PP201)。用于GAPDH、白蛋白和18s rRNA的引物来自Life Technologies。实时PCR预混液是来自Life Technologies的Taqman? 基因表达预混物。实时PCR混合物根据表6中方案制造。每个反应的反应总体积为 20 μl。实时PCR在以下条件下执行：95℃ 10 分钟；95℃ 10 秒、55℃ 15 秒和72℃ 20 秒的40个循环。
表6.反转录反应混合物方案。
组分 体积 (μL)/反应 H2O 5 10X QB Primers-probe Quasar670-BHQ2 2 20X Taqman? 基因表达测定 1 2X Taqman? 基因表达预混物 10 cDNA 样品体积 2 终反应体积 20
。
为了标准化的目的，将Q-β质粒DNA（Attostar目录号PLAS200）添加至每个实时PCR样品中。将Q-β质粒DNA以10倍连续稀释在水中使得Q-β质粒浓度为200 pg/ml、20 pg/ml、2 pg/ml、0.2 pg/ml和0.02 pg/ml。0.02 pg/ml质粒溶液在2 μl中含有12个Q-β质粒拷贝。在实时PCR中我们使用200 pg/ml (115,000拷贝/rxn)、20pg/ml (11,500拷贝/rxn)、2 pg/ml (1,150 拷贝/rxn)和0.2 pg/ml (115 拷贝/rxn)的2 μl稀释的Q-β质粒作为模板，作为用于实时PCR的标准品。
样品以在表7中的顺序安排。四个尿液样品以样品ID“F1 500-1”、 “F1 500-2”、 “F1 50-1”和 “F1 50-2” 在毛细管位置2-5、 8-11和14-17分析。对于样品F1 500-1和F1 500-2，将Q-β噬菌体的500个拷贝添加至尿液样品。对于样品F1 50-1和F1 50-2，将Q-β噬菌体的50个拷贝添加至尿液样品。多重PCR ID指的是与 Q-β 外壳蛋白基因引物复合使用（multiplexed）的那些基因（GAPDH = G、白蛋白 = A或18s rRNA = 18s）。例如，G-Q-β 500-1指包含用于样品ID F1 500-1中GAPDH和Q-β两者的引物和探针的多重PCR反应。相似地，A-Q-β 500-1指的是包含用于样品 ID F1 500-1中白蛋白和Q-β两者的引物和探针的多重PCR反应。相似地，18s-Q-β 500-1指的是包含用于样品 ID F1 500-1中18s rRNA和Q-β两者的引物和探针的多重PCR反应。
表7.实时PCR样品安排
毛细管位置 样品 ID 多重 PCR ID 1 阴性 RT 阴性 RT 2 F1 500-1 G-Q-β 500-1 3 F1 500-2 G-Q-β 500-2 4 F1 50-1 G-Q-β 50-1 5 F1 50-2 G-Q-β 50-2 6 NT NT 7 阴性 RT 阴性 RT 8 F1 500-1 A-Q-β 500-1 9 F1 500-2 A-Q-β 500-2 10 F1 50-1 A-Q-β 50-1 11 F1 50-2 A-Q-β 50-2 12 NT NT 13 阴性 RT 阴性 RT 14 F1 500-1 18s-Q-β 500-1 15 F1 500-2 18s-Q-β 500-2 16 F1 50-1 18s-Q-β 50-1 17 F1 50-2 18s-Q-β 50-2 18 NT NT 19 QB 质粒 115000 QB 质粒115000 20 QB 质粒11500 QB 质粒11500 21 QB 质粒1150 QB 质粒1150 22 QB 质粒115 QB 质粒115 23 QB 质粒12 QB 质粒12
全部样品的Q-β外壳蛋白基因扩增曲线在图2A中显示。使用Q-β质粒标准品的Ct值和拷贝数量以生成实时PCR的标准曲线。如在图1B中显示的，标准曲线的外推可以给出在四个样品中Q-β外壳蛋白基因的拷贝数量的估计。来自实时PCR的Q-β外壳蛋白基因的Ct值和计算的拷贝数量在表8中显示。在添加了Q-β噬菌体500个拷贝的尿液样品中，Ct值为约29.03-30.46，具有计算拷贝数约145-345。在添加了Q-β噬菌体50个拷贝的样品中，Ct值在33.03-36.73的范围内，具有在2-23个拷贝范围内的计算拷贝数量。计算拷贝数量接近添加的拷贝数量，表明噬菌体RNA被充分回收并且因此可以用做确定微泡纯化过程质量的对照。
表8.对尿液样品中Q-β外壳蛋白基因的实时PCR结果
毛细管位置 样品 ID 类型 Ct 给定浓度 (拷贝/μl) 计算浓度 (拷贝/μl) %变化 1 阴性 RT 未知 2 F1 500-1 未知 29.71 217.4 3 F1 500-2 未知 30.29 146.7 4 F1 50-1 未知 33.03 22.8 5 F1 50-2 未知 34.50 8.4 6 NT 未知 7 阴性 RT 未知 8 F1 500-1 未知 29.84 199.1 9 F1 500-2 未知 30.46 130.5 10 F1 50-1 未知 36.73 1.8 11 F1 50-2 未知 34.14 10.7 12 NT 未知 13 阴性 RT 未知 14 F1 500-1 未知 29.03 344.6 15 F1 500-2 未知 29.65 226.2 16 F1 50-1 未知 33.30 19.0 17 F1 50-2 未知 34.08 11.2 18 NT 未知 19 QB 质粒 标准 20.53 115,000.0 111,716.1 2.9% 20 QB 质粒 标准 23.77 11,500.0 12,333.9 7.3% 21 QB 质粒 标准 27.34 1,150.0 1,089.1 5.3% 22 QB 质粒 标准 30.63 115.0 116.7 1.5% 23 QB 质粒 标准 34.04 11.5 11.5 0.1%
对四个尿液样品的GAPDH 基因扩增曲线在图3A中显示。对四个尿液样品的白蛋白和18S rRNA的扩增曲线在图3B中显示。标准曲线的外推给出了如上文详述的Q-β外壳蛋白基因的拷贝数量的估计。类似的外推允许GAPDH、白蛋白和18S rRNA的估计的拷贝数量的计算。来自实时PCR分析的GAPDH、白蛋白和18S rRNA的计算的拷贝数量和Ct值在表9中显示。
这些数据表明在对三种测试的基因的每一种的双重实时PCR反应中，对Q-β外壳蛋白基因没有来自引物和探针的明显干扰。首先，GAPDH、白蛋白和18S rRNA的Ct数量全部在对尿液微泡预期的Ct范围内。此外，对三种基因每一种的Ct值在重复样品（噬菌体的500个拷贝和噬菌体的50个拷贝）间是可重复的。例如，对于GAPDH 的Ct值范围是28.60-29.39。
因此，在尿液微泡分离方法中，Q-β噬菌体RNA可以充分地回收并且可以有信心地作为内部对照使用。进一步的，Q-β噬菌体外壳蛋白基因的引物和探针在双重检验中没有表现出对基因扩增的干扰。连同实施例1中显示的数据，该公开证明Q-β噬菌体可以在尿液和血清样品的微泡RNA分析中作为内部对照使用。
表9.尿液样品中GAPDH、白蛋白和18S rRNA的实时PCR结果
毛细管位置 多重 PCR ID Ct 1 阴性 RT 2 G-Q-β 500-1 28.60 3 G-Q-β 500-2 29.27 4 G-Q-β 50-1 28.97 5 G-Q-β 50-2 29.39 6 NT 7 阴性 RT 8 A-Q-β 500-1 32.76 9 A-Q-β 500-2 37.32 10 A-Q-β 50-1 33.79 11 A-Q-β 50-2 33.36 12 NT 13 阴性 RT 27.51 14 18S-Q-β 500-1 14.73 15 18S-Q-β 500-2 14.99 16 18S-Q-β 50-1 14.84 17 18S-Q-β 50-2 15.93 18 NT
实施例3：在患者样品评价中使用Q-β对照颗粒
使用来自患者组群的尿液样品以鉴定对从尿液来源微泡提取的核酸检测前列腺癌有用的生物标记物。收集尿液样品并且通过0.8 um过滤器过滤以从微泡分离细胞和其它细胞碎片。Q-β对照颗粒以对尿液样品的已知量（例如，100个拷贝）添加至样品。随后微泡级分进行额外地处理，例如，通过过滤浓缩器。洗涤保留物至少一次（例如，两次），并且在过滤浓缩器中再次离心。将RNA酶抑制剂添加至位于过滤浓缩器上层室中的保留物，并且在室温孵育2-3分钟。将裂解缓冲液直接地添加至样品并且在室温孵育1分钟。随后将裂解产物转移至另一个容器以继续使用本领域熟知的方法和适合产生高质量RNA的条件进行核酸提取。例如，使用从裂解产物分离并保留核酸（特别地RNA）的柱执行核酸提取。从柱上洗脱提取的RNA。提取的RNA含有来自尿液来源的微泡的以及 Q-β颗粒的RNA，并且反转录成cDNA用于 Q-β外壳蛋白基因、生物标记物（诸如PCA3）和参考基因（诸如KLK3）的定量实时PCR分析。
对每个样品计算回收的Q-β颗粒的量（Ct值）。计算对整个组群的回收的Q-β颗粒的平均Ct值。还计算了对整个组群回收的Q-β颗粒的Ct值的标准偏差。图4显示了实验结果并且证明了在其中对回收的Q-β颗粒的定量的样品的连续移除导致了高Ct值。将没有收获qPCR信号（或Ct值）的样品，或偏离全部Ct值的平均值的标准偏差超过3倍的样品视为离群值并且从进一步的分析中排除。如图4显示的，当移除离群值后，生物标记物PCA3的诊断准确性增加，如通过在AUC（曲线下面积）值中增加所显示的。
虽然本发明已经关于某些实施方案进行了公开，但是对描述的实施方案进行大量的修饰、替代和变化是可能的，而不偏离本发明全部范围（如在附加的说明和权利要求中所述）。
序列表
<110> Exosome Diagnostics, Inc.
Noerholm, Mikkel
Belzer, Susan
Romain, Charlotte
Skog, Johan K.
Russo, Leileata
Comper, Wayne
<120> 用于核酸测定的对照
<130> 41432-508001WO
<150> US 61/695,116
<151> 2012-08-30
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 化学合成引物
<400> 1
aacggttctt gtgacccatc 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 化学合成引物
<400> 2
cgaacaaaag ctcgttcctc 20
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 化学合成探针
<400> 3
cgccaggcat atgctgacgt g 21