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氯化镁在提高枯草芽孢杆菌芽孢耐热性上的应用.pdf

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1、(10)授权公告号 CN 103146634 B (45)授权公告日 2015.01.21 CN 103146634 B (21)申请号 201310079071.0 (22)申请日 2013.03.13 C12N 1/38(2006.01) A01N 63/02(2006.01) C12R 1/125(2006.01) (73)专利权人河北省农林科学院植物保护研究所地址 071000 河北省保定市东关大街 437 号 (72)发明人马平李社增鹿秀云郭庆港张晓云 (74)专利代理机构北京修典盛世知识产权代理事务所 ( 特殊普通合伙 ) 11424 代理人胡长远 CN 10。

2、2586142 A,2012.07.18, 全文 . 张晓云 . 枯草芽孢杆菌菌株 CAB-1 抑菌物质的分离鉴定及活性分析 .中国优秀硕士学位论文全文数据库农业科技辑 .2011,D046-77. A.E. Cazemier et al.Effect of sporulation and recovery medium on the heat resistance and amount of injury of spores from spoilage bacilli.Journal of Applied Microbiology .2001,761-770. F. F. BUSTA e。

3、t al.Heat-induced requirements for sucrose or magnesium for expression of heat resistance in Bacillus cereus forespores.APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY .1976, 第 32 卷 ( 第 2 期 ),312-314. O. B. Williams.The heat resistance of Bacterial Spores. The Journal of Infectious Diseases .1929, 第 44 卷 ( 第。

4、 6 期 ),421-465. O. B. Williams.The heat resistance of Bacterial Spores. The Journal of Infectious Diseases .1929, 第 44 卷 ( 第 6 期 ),421-465. 姚露燕等 . 金属离子浓度对枯草芽孢杆菌芽孢率的影响 .现代食品科技 .2008, 第 24 卷 ( 第 8 期 ),770-772. (54) 发明名称氯化镁在提高枯草芽孢杆菌芽孢耐热性上的应用 (57) 摘要本发明公开了氯化镁在提高枯草芽孢杆菌芽孢耐热性上的应用，属于微生物农药领域。本发明还公开了利。

5、用氯化镁提高枯草芽孢杆菌芽孢耐热性的方法，以及一种芽孢耐热性强的枯草芽孢杆菌菌剂，主要是向枯草芽孢杆菌发酵培养前的发酵培养基或者发酵培养结束后的发酵液中添加 MgCl2，添加比例为每 100mL 发酵培养基或发酵液中添加 0.1g 0.3g MgCl2。本发明添加 MgCl2所得的枯草芽孢杆菌菌剂中，其芽孢耐热能力显著提高；其次，本发明枯草芽孢杆菌菌剂的货架期长。 (51)Int.Cl. (56)对比文件审查员孙永福权利要求书 1 页说明书 7 页附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利权利要求书1页说明书7页附图1页 (。

6、10)授权公告号 CN 103146634 B CN 103146634 B 1/1 页 2 1. 利用氯化镁提高枯草芽孢杆菌芽孢耐热性的方法，其特征在于向枯草芽孢杆菌发酵培养前的发酵培养基或者发酵培养结束后的发酵液中添加 MgCl2，搅拌均匀；按照每 100mL 发酵培养基中添加 0.1g 0.3g MgCl2的比例向发酵培养基中添加 MgCl2；其中所述的发酵培养基的组成成分及质量百分比为：葡萄糖 2 2.5，可溶性淀粉 3 5，蛋白胨 0.1 0.2， NaNO31 2， K2HPO40.2 0.4， MgSO47H2O0.1 0.2， CaCO30.05 0.1。

7、5，其余为水；其中所述的枯草芽孢杆菌是指 BAB-1，已于 2007 年 7 月 6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为： CGMCC No.2099 ；或按照每 100mL 发酵液中添加 0.1g 0.3g MgCl2的比例向发酵液中添加 MgCl2；所述的发酵液按照如下方法制备： (1)、将低温保存的枯草芽孢杆菌菌种在 LB 培养基固体平板上划线，然后在 28 32下培养 20 24 小时，得活化菌种；其中所述的枯草芽孢杆菌是指 BAB-1 ； (2)、按照将一接种环活化菌种接种于 100mL 种子液培养基的比例将活化菌种接种于种。

8、子液培养基中，在 30 32、 170 210r/min 条件下振荡培养 10 15h，得种子液； (3)、按照体积百分比为 3 5的比例将步骤 (2) 所得的种子液接种到发酵培养基中，在 30 32、 pH7.0 7.5、 170 210r/min 条件下振荡培养 40 50h，得发酵液。 2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于所述的LB培养基的组成成分及质量百分比为：酵母膏 0.5，胰蛋白胨 1，氯化钠 0.5，琼脂 1.2，其余为水；所述的种子液培养基的组成成分及质量百分比为：葡萄糖 0.5，酵母膏 0.5，蛋白胨 1，氯化钠 0.5，其。

9、余为水。 3. 一种芽孢耐热性强的枯草芽孢杆菌菌剂，其特征在于按照如下方法制备：向枯草芽孢杆菌发酵培养前的发酵培养基或者发酵培养结束后的发酵液中添加 MgCl2，搅拌均匀；按照每 100mL 发酵培养基中添加 0.1g 0.3g MgCl2的比例向发酵培养基中添加 MgCl2；其中所述的发酵培养基的组成成分及质量百分比为：葡萄糖 2 2.5，可溶性淀粉 3 5，蛋白胨 0.1 0.2， NaNO31 2， K2HPO40.2 0.4， MgSO47H2O0.1 0.2， CaCO30.05 0.15，其余为水；其中所述的枯草芽孢杆菌是指 BAB-1，已于。

10、2007 年 7 月 6 日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为： CGMCC No.2099 ；或按照每 100mL 发酵液中添加 0.1g 0.3g MgCl2的比例向发酵液中添加 MgCl2；所述的发酵液按照如下方法制备： (1)、将低温保存的枯草芽孢杆菌菌种在 LB 培养基固体平板中划线，然后在 28 32 下培养 20 24 小时，得活化菌种；其中所述的枯草芽孢杆菌是指 BAB-1 ；所述的 LB 培养基的组成成分及质量百分比为：酵母膏 0.5，胰蛋白胨 1，氯化钠 0.5，琼脂 1.2，其余为水； (2)、按照一接种。

11、环活化菌种接种于 100mL 种子液培养基的比例将活化菌种接种于种子液培养基中，在 30 32、 170 210r/min 条件下振荡培养 10 15h，得种子液；所述的种子液培养基的组成成分及质量百分比为：葡萄糖 0.5，酵母膏 0.5，蛋白胨 1，氯化钠 0.5，其余为水； (3)、按照体积百分比为 3 5的比例将步骤 (2) 所得的种子液接种到发酵培养基中，在 30 32、 pH7.0 7.5、 170 210r/min 条件下振荡培养 40 50h，得发酵液。权利要求书 CN 103146634 B 2 1/7 页 3 氯化镁在提高枯草芽孢。

12、杆菌芽孢耐热性上的应用技术领域 0001 本发明属于微生物农药领域，具体涉及氯化镁在提高枯草芽孢杆菌芽孢耐热性上的应用；以及利用氯化镁提高枯草芽孢杆菌芽孢耐热性的方法；此外还涉及一种芽孢耐热性强的枯草芽孢杆菌菌剂及其制备方法。背景技术 0002 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）是土壤中一类比较重要的生防微生物群体，能够防治多种植物病害（何礼远 . 生物防治通报 ,1985,1(3) ： 28-31 ； Yu G Y 等， Soil Biology and Biochemistry.2002,34:955-963）。芽孢是芽孢杆菌在发酵后期产生的一类。

13、抗逆性较强的休眠体（沈萍等，微生物学，高等教育出版社 .2006,55-60），常被作为有效成分制作成微生物农药，但是相对于化学农药，以芽孢为有效成分的微生物农药货架期相对较短，而芽孢的耐热能力是影响其货架期的主要因素之一。 0003 芽孢的耐热性能除了受相关基因的控制外，外界环境中金属离子、温度、酸碱度等均能影响芽孢的形成与性能，其中金属离子 Ca2+、 Mn2+、 Fe2+对芽孢的耐热性能有不同程度的提高效果（Granger A C 等 .Applied and Environmental Microbiology.2011,77(。

14、1):32-40）。因此，提高枯草芽孢杆菌芽孢的耐热性是延长相应的微生物农药货架期的有效途径之一。发明内容 0004 针对枯草芽孢杆菌微生物农药货架期短的问题，本发明目的在于提供氯化镁在提高枯草芽孢杆菌芽孢耐热性上的应用。 0005 本发明另一目的在于提供利用氯化镁提高枯草芽孢杆菌芽孢耐热性的方法。 0006 本发明第三目的在于提供一种芽孢耐热性强的枯草芽孢杆菌菌剂。 0007 本发明第四目的在于提供上述芽孢耐热性强的枯草芽孢杆菌菌剂的制备方法。 0008 本发明的目的通过以下的技术方案实现： 0009 氯化镁在提高枯草芽孢杆菌芽孢耐热性上的应用。 0010 本发明利用氯化镁提高。

15、枯草芽孢杆菌芽孢耐热性的方法，包括向枯草芽孢杆菌发酵培养前的发酵培养基或者发酵培养结束后的发酵液中添加 MgCl2，搅拌均匀。 0011 上述利用氯化镁提高枯草芽孢杆菌芽孢耐热性的方法，按照每 100mL 发酵培养基中添加 0.1g 0.3g MgCl2的比例向发酵培养基中添加 MgCl2；其中所述的发酵培养基的组成成分及质量百分比为：葡萄糖 2% 2.5%，可溶性淀粉 3% 5%，蛋白胨 0.1% 0.2%， NaNO31% 2%， K2HPO40.2% 0.4%， MgSO47H2O0.1% 0.2%， CaCO30.05% 0.15%，其余为水。 0012 上述。

16、利用氯化镁提高枯草芽孢杆菌芽孢耐热性的方法，按照每 100mL 发酵液中添加 0.1g 0.3g MgCl2的比例向发酵液中添加 MgCl2；其中所述的发酵液中枯草芽孢杆菌的总菌数为 1.0109 1.01010个 /mL，其中芽孢约占枯草芽孢杆菌总菌数的 90。说明书 CN 103146634 B 3 2/7 页 4 0013 所述的枯草芽孢杆菌是指以芽孢作为微生物农药有效成分的枯草芽孢杆菌；如 BAB-1 （2007 年 7 月 6 日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为： CGMCC No.2099）。 0014 上述利用氯化镁提高枯草。

17、芽孢杆菌芽孢耐热性的方法中，其所述的发酵液按照如下方法制备： 0015 （1）菌种活化 0016 将低温保存的枯草芽孢杆菌菌种在 LB 培养基固体平板上划线，然后在 28 32下培养 20 24 小时，得活化菌种； 0017 （2）种子液制备 0018 按照将一接种环活化菌种接种于 100mL 种子液培养基的比例将活化菌种接种于种子液培养基中，在 30 32、 170 210r/min 条件下振荡培养 10 15h，得种子液； 0019 （3）发酵液制备 0020 按照体积百分比为3%5%的比例将步骤（2）所得的种子液接种到发酵培养基中，在 30 32、 pH7。

18、.0 7.5、 170 210r/min 条件下振荡培养 40 50h，得发酵液。 0021 上述利用氯化镁提高枯草芽孢杆菌芽孢耐热性的方法中所述的 LB 培养基、种子液培养基、发酵培养基按照常规方法制备。 0022 上述利用氯化镁提高枯草芽孢杆菌芽孢耐热性的方法中所述的 LB 培养基的组成成分及质量百分比为：酵母膏 0.5%，胰蛋白胨 1%，氯化钠 0.5%，琼脂 1.2%，其余为水。 0023 上述利用氯化镁提高枯草芽孢杆菌芽孢耐热性的方法中所述的种子液培养基的组成成分及质量百分比为：葡萄糖 0.5%，酵母膏 0.5%，蛋白胨 1%，氯化钠 0.5%，其。

19、余为水。 0024 上述利用氯化镁提高枯草芽孢杆菌芽孢耐热性的方法中所述的发酵培养基的组成成分及质量百分比为：葡萄糖 2% 2.5%，可溶性淀粉 3% 5%，蛋白胨 0.1% 0.2%， NaNO31% 2%， K2HPO40.2% 0.4%， MgSO47H2O0.1% 0.2%， CaCO30.05% 0.15%，其余为水。 0025 本发明一种芽孢耐热性强的枯草芽孢杆菌菌剂，按照如下方法制备：向枯草芽孢杆菌发酵培养前的发酵培养基或者发酵培养结束后的发酵液中添加 MgCl2，搅拌均匀。 0026 上述枯草芽孢杆菌菌剂，按照每 100mL 发酵培养基中添加 0.1g。

20、 0.3gMgCl2的比例向发酵培养基中添加MgCl2；其中所述的发酵培养基的组成成分及质量百分比为：葡萄糖 2% 2.5%，可溶性淀粉 3% 5%，蛋白胨 0.1% 0.2%， NaNO31% 2%， K2HPO40.2% 0.4%， MgSO47H2O0.1% 0.2%， CaCO30.05% 0.15%，其余为水。 0027 上述枯草芽孢杆菌菌剂，按照每100mL发酵液中添加0.1g0.3g MgCl2的比例向发酵液中添加 MgCl2；其中所述的发酵液中枯草芽孢杆菌的总菌数为 1.0109 1.01010 个 /mL，其中芽孢约占枯草芽孢杆菌总菌数的 90。 002。

21、8 所述的枯草芽孢杆菌是指以芽孢作为微生物农药有效成分的枯草芽孢杆菌；如 BAB-1 （2007 年 7 月 6 日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为： CGMCC No.2099）。 0029 上述枯草芽孢杆菌菌剂中所述的发酵液，按照如下方法制备： 0030 （1）菌种活化 0031 将低温保存的枯草芽孢杆菌菌种在 LB 培养基固体平板中划线，然后在 28 32 说明书 CN 103146634 B 4 3/7 页 5 下培养 20 24 小时，得活化菌种； 0032 （2）种子液制备 0033 按照一接种环活化菌种接种于 100mL 。

22、种子液培养基的比例将活化菌种接种于种子液培养基中，在 30 32、 170 210r/min 条件下振荡培养 10 15h，得种子液； 0034 （3）发酵液制备 0035 按照体积百分比为3%5%的比例将步骤（2）所得的种子液接种到发酵培养基中，在 30 32、 pH7.0 7.5、 170 210r/min 条件下振荡培养 40 50h，得发酵液。 0036 所述的枯草芽孢杆菌可以是 BAB-1 （2007 年 7 月 6 日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为： CGMCC No.2099）。 0037 上述枯草芽孢杆菌菌剂中所述的 LB。

23、培养基、种子液培养基、发酵培养基按照常规方法制备。 0038 上述枯草芽孢杆菌菌剂中所述的 LB 培养基的组成成分及质量百分比为：酵母膏 0.5%，胰蛋白胨 1%，氯化钠 0.5%，琼脂 1.2%，其余为水。 0039 上述枯草芽孢杆菌菌剂中所述的种子液培养基的组成成分及质量百分比为：葡萄糖 0.5%，酵母膏 0.5%，蛋白胨 1%，氯化钠 0.5%，其余为水。 0040 上述枯草芽孢杆菌菌剂中所述的发酵培养基的组成成分及质量百分比为：葡萄糖 2% 2.5%，可溶性淀粉 3% 5%，蛋白胨 0.1% 0.2%， NaNO31% 2%， K2HPO40.。

24、2% 0.4%， MgSO47H2O0.1% 0.2%， CaCO30.05% 0.15%，其余为水。 0041 上述芽孢耐热性强的枯草芽孢杆菌菌剂的制备方法，包括向枯草芽孢杆菌发酵培养前的发酵培养基或者发酵培养结束后的发酵液中添加 MgCl2，搅拌均匀。 0042 上述芽孢耐热性强的枯草芽孢杆菌菌剂的制备方法，按照每 100mL 发酵培养基中添加 0.1g 0.3g MgCl2的比例向发酵培养基中添加 MgCl2；其中所述的发酵培养基的组成成分及质量百分比为：葡萄糖 2% 2.5%，可溶性淀粉 3 5%，蛋白胨 0.1% 0.2%， NaNO31% 2%， K2HPO。

25、40.2% 0.4%， MgSO47H2O0.1% 0.2%， CaCO30.05% 0.15%，其余为水。 0043 上述芽孢耐热性强的枯草芽孢杆菌菌剂的制备方法，按照每 100mL 发酵液中添加 0.1g 0.3g MgCl2的比例向发酵液中添加 MgCl2；其中所述的发酵液中枯草芽孢杆菌的总菌数为 1.0109 1.01010个 /mL，其中芽孢约占枯草芽孢杆菌总菌数的 90。 0044 上述制备方法中所述的枯草芽孢杆菌发酵液，按照如下方法制备： 0045 （1）菌种活化：将低温保存的枯草芽孢杆菌菌种在 LB 培养基固体平板中划线，然后在 28 32下培养 20。

26、 24 小时，得活化菌种； 0046 （2）种子液制备：按照将一接种环活化菌种接种于 100mL 种子液培养基的比例将活化的菌种接种于种子液培养基中，在3032、 170210r/min条件下振荡培养10 15h，得种子液； 0047 （3）发酵液制备：按照体积百分比为 3% 5% 的比例将步骤（2）所得的种子液接种到发酵培养基中，在 30 32、 pH7.0 7.5、 170 210r/min 条件下振荡培养 40 50h，得发酵液。 0048 上述制备方法中所述的 LB 培养基、种子液培养基、发酵培养基按照常规方法制备。说明书 CN 10314。

27、6634 B 5 4/7 页 6 0049 本发明芽孢耐热性强的枯草芽孢杆菌菌剂按照本领域技术人员熟知的方式可以制备成悬浮剂、可湿性粉剂、泡腾片剂、颗粒剂等农药剂型。 0050 本发明具有的优点和有益效果为：与现有的枯草芽孢杆菌菌剂相比，本发明通过向发酵培养液或发酵培养基中添加 MgCl2所得的枯草芽孢杆菌菌剂中，其芽孢耐热能力显著提高；本发明枯草芽孢杆菌菌剂货架期长。附图说明 0051 图 1. 发酵液中添加 MgCl2的枯草芽孢杆菌菌剂的货架期曲线图。 0052 图 2. 发酵培养基中添加 MgCl2的枯草芽孢杆菌菌剂的货架期曲线图。具体实施方式 0053 以下。

28、以具体实施例对本发明作进一步的说明，但是不以任何方式构成对本发明的限制。 0054 实施例 1 增强枯草芽孢杆菌芽孢耐热性的金属离子筛选试验 0055 （1）将保存在 -80冰箱的枯草芽孢杆菌 BAB-1 菌种（2007 年 7 月 6 日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为： CGMCCNo.2099）在 LB 培养基固体平板中划线，将平板置于 30培养箱中活化培养 24h，得活化菌种。 0056 （2）用接种环挑取一环活化菌种接种于 100mL 种子液培养基（种子液培养基的组成成分及其重量比为：葡萄糖5g，酵母膏5g，蛋白胨10g。

29、，氯化钠5g，水1000mL）中，在31、 180r/min 条件下振荡培养 12h，得到种子液。 0057 （3）按照体积百分比为 4% 的比例将种子液接种到发酵培养基（发酵培养基的组成成分及其重量比为：葡萄糖 20g，可溶性淀粉 40g，蛋白胨 1g， NaNO310g， K2HPO43g， MgSO47H2O1g， CaCO31g，水 1000mL）中，在 31、 180r/min 条件下振荡培养 48h，得发酵液。 0058 （4）取样 10mL，做革兰氏染色，在显微镜下观察芽孢形成情况，在芽孢形成率大于 90% 时，停止发酵； 0059 （5。

30、）取 5 份相同体积的发酵液，按照 0.2g/100mL 的比例向发酵液中分别添加金属离子： NaCl、 CaCl2、 MgCl2、 MnSO4、 FeSO4，以不添加任何金属离子的处理作为对照（CK）。 0060 （6）将各处理发酵液置于 54培养箱中静置 14d。 0061 （7）将各处理发酵液取出，分别取 1mL 样品，用无菌水以 10 倍浓度梯度稀释，将发酵液稀释至 10-n。将 LB 培养皿分为四个区，每区点 20L 稀释液。培养皿置于 35培养 8h，计数每区菌落，以 10-40 个菌落浓度为宜，并计算出每 mL 发酵液中芽孢的数量，比较不同金。

31、属离子处理的发酵液芽孢存活数量 0062 芽孢数量 =(A1+A2+A3+A4) 410n50（单位：个 /mL）。 0063 其中 A1、 A2、 A3、 A4 为培养皿各区的菌落数， n 为稀释倍数。 0064 （8）结果（见表 1） 54处理 7d 后对照的芽孢数量为 6.1109， NaCl、 CaCl2、 MnSO4 和FeSO4处理的芽孢数量分别为6.0109， 5.5109， 6.0109， 6.2109， 6.2109，而MgCl2 处理的芽孢数量为 8.4109，显著高于对照和其他金属离子处理的芽孢数量，说明 NaCl， CaCl2， MnSO4和 FeSO4。

32、对枯草芽孢杆菌芽孢耐热性基本没有影响，而 MgCl2能够显著提高枯草芽孢杆菌芽孢的耐热能力。说明书 CN 103146634 B 6 5/7 页 7 0065 表 1 不同金属离子对枯草芽孢杆菌芽孢耐热能力的影响的试验结果 0066 0067 实施例 2 本发明枯草芽孢杆菌菌剂的制备及芽孢耐热性对比试验 0068 具体包括如下步骤： 0069 （1）、将保存在 -80冰箱的枯草芽孢杆菌 BAB-1 菌种在 LB 培养基固体平板中划线，将平板置于 30培养箱中活化培养 24h。 0070 （2）、用接种环挑取一环活化菌种接种于种子液培养基（种子液培养基的组成成分及其重。

33、量比为：葡萄糖 5g，酵母膏 5g，蛋白胨 10g，氯化钠 5g，水 1000mL） 100ml 中，在 31、 180r/min 条件下振荡培养 12h，得到种子液。 0071 （3）、按照体积比为 4% 的比例将种子液接种到发酵培养基（发酵培养基的组成成分及其重量比为：葡萄糖 20g，可溶性淀粉 40g，蛋白胨 1g， NaNO310g， K2HPO43g， MgSO47H2O1g， CaCO31g，水 1000mL）中，在 31、 180r/min 条件下振荡培养 48h。 0072 （4）、取样 10mL，做革兰氏染色，在显微镜下观察芽孢形。

34、成情况，在芽孢形成率大于 90% 时停止发酵。 0073 （5）、将发酵液取出分成2份，其中一份中按照0.2g/100mL比例添加MgCl2，搅拌均匀，得本发明菌剂；另一份不做处理。 0074 （6）、将（5）中两份发酵液在 90和 100水浴处理 30 分钟，取出置于冷水中迅速降温至室温，用无菌水以 10 倍浓度梯度稀释，将发酵液稀释至 10-n。将 LB 培养皿分为四个区，每区点 20L 稀释液。培养皿置于 35培养 8h，计数每区菌落，以 10-40 个菌落浓度为宜，并计算出每 mL 发酵液中芽孢的数量，比较两份发酵液的芽孢存活数量 007。

35、5 芽孢数量 =(A1+A2+A3+A4) 410n50（单位：个 /mL）。 0076 注： A1、 A2、 A3、 A4 为培养皿各区的菌落数， n 为稀释倍数。 0077 结果（见表 2）， 90处理下， MgCl2处理芽孢耐热能力较对照有显著提高； 100处理下， MgCl2处理芽孢存活率为对照组的 7.5 倍。说明在发酵液中添加 MgCl2后，枯草芽孢说明书 CN 103146634 B 7 6/7 页 8 杆菌芽孢的耐热能力显著提高。 0078 表 2 MgCl2对枯草芽孢杆菌芽孢耐热能力的影响的对比试验结果 0079 0080 实施例 3 本发明枯草芽孢杆。

36、菌菌剂的制备及芽孢耐热性对比试验 0081 按照如下方法进行： 0082 （1）同实施例 2 步骤（1）。 0083 （2）同实施例 2 步骤（2）。 0084 （3）配制 2 份发酵培养基，其中一份不添加 MgCl2，其组成成分及其重量比为：葡萄糖 20g，可溶性淀粉 40g，蛋白胨 1g， NaNO310g， K2HPO43g， MgSO47H2O1g， CaCO31g，水 1000mL。另一份添加 MgCl2，即按照在上述相同组成发酵培养基的基础上添加 0.2% 的 MgCl2。 0085 将步骤（2）的种子液按照体积比为 4% 的比例分别接种到上。

37、述发酵培养基中，在 31、 180r/min 条件下振荡培养 48h。 0086 （4）取样 10mL，做革兰氏染色，在显微镜下观察芽孢形成情况，在芽孢形成率大于 90% 时停止发酵，得发酵液，其中发酵培养基中添加 MgCl2的所得发酵液即为本发明枯燥芽孢杆菌的悬浮液。 0087 （5）将两种发酵液分别在 90和 100水浴处理 30min，取出置于冷水中迅速降温至室温，使用无菌水以10倍浓度梯度稀释，将发酵液稀释至10-n。将LB培养皿分为四个区，每区点 20L 稀释液。培养皿置于 35培养 8h，计数每区菌落，以 10-40 个菌落浓度为宜，并计算出每。

38、mL 发酵液中芽孢的数量，比较两份发酵液的芽孢存活数量 0088 芽孢数量 =(A1+A2+A3+A4) 410n50（单位：个 /mL）。 0089 注： A1、 A2、 A3、 A4 为培养皿各区的菌落数， n 为稀释倍数。 0090 结果（见表 3）， 90和 100处理下，添加 MgCl2的发酵培养基中的芽孢存活率比未添加 MgCl2的处理均有显著提高，说明在发酵培养基中添加也能显著提高枯草芽孢杆菌芽孢的耐热性。 0091 表 3 MgCl2对枯草芽孢杆菌芽孢耐热能力的影响的对比试验结果 0092 0093 实施例 4 本发明枯草芽孢杆菌菌剂的货架期长短对比试验。

39、0094 按照如下方法进行：说明书 CN 103146634 B 8 7/7 页 9 0095 （1）按照实施例 2 和实施例 3 的方法，分别制备成在发酵培养基或发酵液中添加 0.2% 浓度 MgCl2的枯草芽孢杆菌菌剂，以未添加 MgCl2的枯草芽孢杆菌菌剂为对照。 0096 （2）将添 MgCl2的菌剂和未添加 MgCl2的对照菌剂置于同一个培养箱中 45放置，每隔一个月进行取样品 1mL。 0097 （3）将样品用无菌水以 10 倍浓度梯度稀释，将发酵液稀释至 10-n。将 LB 培养皿分为四个区，每区点 20L 稀释液。培养皿置于 35培养 8h，计数每区。

40、菌落，以 10-40 个菌落浓度为宜，并计算出每 mL 菌剂中芽孢的数量，比较两份菌剂的芽孢存活数量 0098 芽孢数量 =(A1+A2+A3+A4) 410n50（单位：个 /mL）。 0099 注： A1、 A2、 A3、 A4 为培养皿各区的菌落数， n 为稀释倍数。 0100 （4）对按照实施例 2 中制得发酵液中添加 MgCl2的菌剂进行 12 个月的检测，结果（见图 1），添加 MgCl2的枯草芽孢杆菌菌剂的芽孢含量在 12 个月的监测中逐渐降低，降低程度缓慢，最终在 12 个月时芽孢含量为 4.05109个 /mL，而未添加 MgCl2的处理中，。

41、芽孢含量迅速下降，在 12 个月时芽孢含量仅为 0.8108个 /mL。说明在发酵液中添加 MgCl2所得的枯草芽孢杆菌菌剂货架期长。 0101 （5）对按照实施例3中制得发酵培养基中添加MgCl2的菌剂进行12个月的检测，结果（见图 2）添加 MgCl2的枯草芽孢杆菌菌剂的芽孢含量在 12 个月的监测中逐渐降低，降低程度缓慢，最终在 12 个月时芽孢含量为 7.2108个 /mL，而未添加 MgCl2的处理中，芽孢含量迅速下降，在 12 个月时芽孢含量仅为 0.4108个 /mL。表明在发酵培养基中添加 MgCl2 所得的枯草芽孢杆菌菌剂货架期长。说明书 CN 103146634 B 9 1/1 页 10 图 1 图 2 说明书附图 CN 103146634 B 10 。

摘要
申请专利号：	CN201310079071.0	申请日：	20130313
公开号：	CN103146634B	公开日：	20150121
当前法律状态：		有效性：	有效
法律详情：
IPC分类号：	C12N1/38,A01N63/02,C12R1/125	主分类号：	C12N1/38,A01N63/02,C12R1/125
申请人：	河北省农林科学院植物保护研究所
发明人：	马平,李社增,鹿秀云,郭庆港,张晓云
地址：	071000 河北省保定市东关大街437号
优先权：	CN201310079071A
专利代理机构：	北京修典盛世知识产权代理事务所(特殊普通合伙)	代理人：	胡长远
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内容摘要

本发明公开了氯化镁在提高枯草芽孢杆菌芽孢耐热性上的应用，属于微生物农药领域。本发明还公开了利用氯化镁提高枯草芽孢杆菌芽孢耐热性的方法，以及一种芽孢耐热性强的枯草芽孢杆菌菌剂，主要是向枯草芽孢杆菌发酵培养前的发酵培养基或者发酵培养结束后的发酵液中添加MgCl2，添加比例为每100mL发酵培养基或发酵液中添加0.1g～0.3g?MgCl2。本发明添加MgCl2所得的枯草芽孢杆菌菌剂中，其芽孢耐热能力显著提高；其次，本发明枯草芽孢杆菌菌剂的货架期长。

权利要求书

1.利用氯化镁提高枯草芽孢杆菌芽孢耐热性的方法，其特征在于向枯草芽孢杆菌发酵培养前的发酵培养基或者发酵培养结束后的发酵液中添加MgCl，搅拌均匀；按照每100mL发酵培养基中添加0.1g～0.3g MgCl的比例向发酵培养基中添加MgCl；其中所述的发酵培养基的组成成分及质量百分比为：葡萄糖2％～2.5％，可溶性淀粉3％～5％，蛋白胨0.1％～0.2％，NaNO1％～2％，KHPO0.2％～0.4％，MgSO·7HO0.1％～0.2％，CaCO0.05％～0.15％，其余为水；其中所述的枯草芽孢杆菌是指BAB-1，已于2007年7月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.2099；或按照每100mL发酵液中添加0.1g～0.3g MgCl的比例向发酵液中添加MgCl；所述的发酵液按照如下方法制备：(1)、将低温保存的枯草芽孢杆菌菌种在LB培养基固体平板上划线，然后在28℃～32℃下培养20～24小时，得活化菌种；其中所述的枯草芽孢杆菌是指BAB-1；(2)、按照将一接种环活化菌种接种于100mL种子液培养基的比例将活化菌种接种于种子液培养基中，在30℃～32℃、170～210r/min条件下振荡培养10～15h，得种子液；(3)、按照体积百分比为3％～5％的比例将步骤(2)所得的种子液接种到发酵培养基中，在30℃～32℃、pH7.0～7.5、170～210r/min条件下振荡培养40～50h，得发酵液。 2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于所述的LB培养基的组成成分及质量百分比为：酵母膏0.5％，胰蛋白胨1％，氯化钠0.5％，琼脂1.2％，其余为水；所述的种子液培养基的组成成分及质量百分比为：葡萄糖0.5％，酵母膏0.5％，蛋白胨1％，氯化钠0.5％，其余为水。 3.一种芽孢耐热性强的枯草芽孢杆菌菌剂，其特征在于按照如下方法制备：向枯草芽孢杆菌发酵培养前的发酵培养基或者发酵培养结束后的发酵液中添加MgCl，搅拌均匀；按照每100mL发酵培养基中添加0.1g～0.3g MgCl的比例向发酵培养基中添加MgCl；其中所述的发酵培养基的组成成分及质量百分比为：葡萄糖2％～2.5％，可溶性淀粉3％～5％，蛋白胨0.1％～0.2％，NaNO1％～2％，KHPO0.2％～0.4％，MgSO·7HO0.1％～0.2％，CaCO0.05％～0.15％，其余为水；其中所述的枯草芽孢杆菌是指BAB-1，已于2007年7月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.2099；或按照每100mL发酵液中添加0.1g～0.3g MgCl的比例向发酵液中添加MgCl；所述的发酵液按照如下方法制备：(1)、将低温保存的枯草芽孢杆菌菌种在LB培养基固体平板中划线，然后在28～32℃下培养20～24小时，得活化菌种；其中所述的枯草芽孢杆菌是指BAB-1；所述的LB培养基的组成成分及质量百分比为：酵母膏0.5％，胰蛋白胨1％，氯化钠0.5％，琼脂1.2％，其余为水；(2)、按照一接种环活化菌种接种于100mL种子液培养基的比例将活化菌种接种于种子液培养基中，在30℃～32℃、170～210r/min条件下振荡培养10～15h，得种子液；所述的种子液培养基的组成成分及质量百分比为：葡萄糖0.5％，酵母膏0.5％，蛋白胨1％，氯化钠0.5％，其余为水；(3)、按照体积百分比为3％～5％的比例将步骤(2)所得的种子液接种到发酵培养基中，在30℃～32℃、pH7.0～7.5、170～210r/min条件下振荡培养40～50h，得发酵液。

说明书

技术领域

本发明属于微生物农药领域，具体涉及氯化镁在提高枯草芽孢杆菌芽孢耐热性上的应用；以及利用氯化镁提高枯草芽孢杆菌芽孢耐热性的方法；此外还涉及一种芽孢耐热性强的枯草芽孢杆菌菌剂及其制备方法。

背景技术

枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）是土壤中一类比较重要的生防微生物群体，能够防治多种植物病害（何礼远.生物防治通报,1985,1(3)：28-31； Yu G Y等，Soil Biology and Biochemistry.2002,34:955-963）。芽孢是芽孢杆菌在发酵后期产生的一类抗逆性较强的休眠体（沈萍等，微生物学，高等教育出版社.2006,55-60），常被作为有效成分制作成微生物农药，但是相对于化学农药，以芽孢为有效成分的微生物农药货架期相对较短，而芽孢的耐热能力是影响其货架期的主要因素之一。

芽孢的耐热性能除了受相关基因的控制外，外界环境中金属离子、温度、酸碱度等均能影响芽孢的形成与性能，其中金属离子Ca2+、Mn2+、Fe2+对芽孢的耐热性能有不同程度的提高效果（Granger A C等.Applied and Environmental Microbiology.2011,77(1):32-40）。因此，提高枯草芽孢杆菌芽孢的耐热性是延长相应的微生物农药货架期的有效途径之一。

发明内容

针对枯草芽孢杆菌微生物农药货架期短的问题，本发明目的在于提供氯化镁在提高枯草芽孢杆菌芽孢耐热性上的应用。

本发明另一目的在于提供利用氯化镁提高枯草芽孢杆菌芽孢耐热性的方法。

本发明第三目的在于提供一种芽孢耐热性强的枯草芽孢杆菌菌剂。

本发明第四目的在于提供上述芽孢耐热性强的枯草芽孢杆菌菌剂的制备方法。

本发明的目的通过以下的技术方案实现：

氯化镁在提高枯草芽孢杆菌芽孢耐热性上的应用。

本发明利用氯化镁提高枯草芽孢杆菌芽孢耐热性的方法，包括向枯草芽孢杆菌发酵培养前的发酵培养基或者发酵培养结束后的发酵液中添加MgCl2，搅拌均匀。

上述利用氯化镁提高枯草芽孢杆菌芽孢耐热性的方法，按照每100mL发酵培养基中添加0.1g～0.3g MgCl2的比例向发酵培养基中添加MgCl2；其中所述的发酵培养基的组成成分及质量百分比为：葡萄糖2%～2.5%，可溶性淀粉 3%～5%，蛋白胨0.1%～0.2%，NaNO31%～2%，K2HPO40.2%～0.4%， MgSO4·7H2O0.1%～0.2%，CaCO30.05%～0.15%，其余为水。

上述利用氯化镁提高枯草芽孢杆菌芽孢耐热性的方法，按照每100mL发酵液中添加0.1g～0.3g MgCl2的比例向发酵液中添加MgCl2；其中所述的发酵液中枯草芽孢杆菌的总菌数为1.0×109～1.0×1010个/mL，其中芽孢约占枯草芽孢杆菌总菌数的90％。

所述的枯草芽孢杆菌是指以芽孢作为微生物农药有效成分的枯草芽孢杆菌；如BAB-1（2007年7月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.2099）。

上述利用氯化镁提高枯草芽孢杆菌芽孢耐热性的方法中，其所述的发酵液按照如下方法制备：

（1）菌种活化

将低温保存的枯草芽孢杆菌菌种在LB培养基固体平板上划线，然后在 28℃～32℃下培养20～24小时，得活化菌种；

（2）种子液制备

按照将一接种环活化菌种接种于100mL种子液培养基的比例将活化菌种接种于种子液培养基中，在30℃～32℃、170～210r/min条件下振荡培养10～ 15h，得种子液；

（3）发酵液制备

按照体积百分比为3%～5%的比例将步骤（2）所得的种子液接种到发酵培养基中，在30℃～32℃、pH7.0～7.5、170～210r/min条件下振荡培养40～ 50h，得发酵液。

上述利用氯化镁提高枯草芽孢杆菌芽孢耐热性的方法中所述的LB培养基、种子液培养基、发酵培养基按照常规方法制备。

上述利用氯化镁提高枯草芽孢杆菌芽孢耐热性的方法中所述的LB培养基的组成成分及质量百分比为：酵母膏0.5%，胰蛋白胨1%，氯化钠0.5%，琼脂 1.2%，其余为水。

上述利用氯化镁提高枯草芽孢杆菌芽孢耐热性的方法中所述的种子液培养基的组成成分及质量百分比为：葡萄糖0.5%，酵母膏0.5%，蛋白胨1%，氯化钠0.5%，其余为水。

上述利用氯化镁提高枯草芽孢杆菌芽孢耐热性的方法中所述的发酵培养基的组成成分及质量百分比为：葡萄糖2%～2.5%，可溶性淀粉3%～5%，蛋白胨0.1%～0.2%，NaNO31%～2%，K2HPO40.2%～0.4%，MgSO4·7H2O0.1%～ 0.2%，CaCO30.05%～0.15%，其余为水。

本发明一种芽孢耐热性强的枯草芽孢杆菌菌剂，按照如下方法制备：向枯草芽孢杆菌发酵培养前的发酵培养基或者发酵培养结束后的发酵液中添加 MgCl2，搅拌均匀。

上述枯草芽孢杆菌菌剂，按照每100mL发酵培养基中添加0.1g～0.3g MgCl2的比例向发酵培养基中添加MgCl2；其中所述的发酵培养基的组成成分及质量百分比为：葡萄糖2%～2.5%，可溶性淀粉3%～5%，蛋白胨0.1%～0.2%， NaNO31%～2%，K2HPO40.2%～0.4%，MgSO4·7H2O0.1%～0.2%，CaCO30.05%～0.15%，其余为水。

上述枯草芽孢杆菌菌剂，按照每100mL发酵液中添加0.1g～0.3g MgCl2的比例向发酵液中添加MgCl2；其中所述的发酵液中枯草芽孢杆菌的总菌数为 1.0×109～1.0×1010个/mL，其中芽孢约占枯草芽孢杆菌总菌数的90％。

所述的枯草芽孢杆菌是指以芽孢作为微生物农药有效成分的枯草芽孢杆菌；如BAB-1（2007年7月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.2099）。

上述枯草芽孢杆菌菌剂中所述的发酵液，按照如下方法制备：

（1）菌种活化

将低温保存的枯草芽孢杆菌菌种在LB培养基固体平板中划线，然后在 28～32℃下培养20～24小时，得活化菌种；

（2）种子液制备

按照一接种环活化菌种接种于100mL种子液培养基的比例将活化菌种接种于种子液培养基中，在30℃～32℃、170～210r/min条件下振荡培养10～15h，得种子液；

（3）发酵液制备

按照体积百分比为3%～5%的比例将步骤（2）所得的种子液接种到发酵培养基中，在30℃～32℃、pH7.0～7.5、170～210r/min条件下振荡培养40～50h，得发酵液。

所述的枯草芽孢杆菌可以是BAB-1（2007年7月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.2099）。

上述枯草芽孢杆菌菌剂中所述的LB培养基、种子液培养基、发酵培养基按照常规方法制备。

上述枯草芽孢杆菌菌剂中所述的LB培养基的组成成分及质量百分比为：酵母膏0.5%，胰蛋白胨1%，氯化钠0.5%，琼脂1.2%，其余为水。

上述枯草芽孢杆菌菌剂中所述的种子液培养基的组成成分及质量百分比为：葡萄糖0.5%，酵母膏0.5%，蛋白胨1%，氯化钠0.5%，其余为水。

上述枯草芽孢杆菌菌剂中所述的发酵培养基的组成成分及质量百分比为：葡萄糖2%～2.5%，可溶性淀粉3%～5%，蛋白胨0.1%～0.2%，NaNO31%～2%， K2HPO40.2%～0.4%，MgSO4·7H2O0.1%～0.2%，CaCO30.05%～0.15%，其余为水。

上述芽孢耐热性强的枯草芽孢杆菌菌剂的制备方法，包括向枯草芽孢杆菌发酵培养前的发酵培养基或者发酵培养结束后的发酵液中添加MgCl2，搅拌均匀。

上述芽孢耐热性强的枯草芽孢杆菌菌剂的制备方法，按照每100mL发酵培养基中添加0.1g～0.3g MgCl2的比例向发酵培养基中添加MgCl2；其中所述的发酵培养基的组成成分及质量百分比为：葡萄糖2%～2.5%，可溶性淀粉3～ 5%，蛋白胨0.1%～0.2%，NaNO31%～2%，K2HPO40.2%～0.4%，MgSO4·7H2O 0.1%～0.2%，CaCO30.05%～0.15%，其余为水。

上述芽孢耐热性强的枯草芽孢杆菌菌剂的制备方法，按照每100mL发酵液中添加0.1g～0.3g MgCl2的比例向发酵液中添加MgCl2；其中所述的发酵液中枯草芽孢杆菌的总菌数为1.0×109～1.0×1010个/mL，其中芽孢约占枯草芽孢杆菌总菌数的90％。

上述制备方法中所述的枯草芽孢杆菌发酵液，按照如下方法制备：

（1）菌种活化：将低温保存的枯草芽孢杆菌菌种在LB培养基固体平板中划线，然后在28℃～32℃下培养20～24小时，得活化菌种；

（2）种子液制备：按照将一接种环活化菌种接种于100mL种子液培养基的比例将活化的菌种接种于种子液培养基中，在30℃～32℃、170～210r/min 条件下振荡培养10～15h，得种子液；

（3）发酵液制备：按照体积百分比为3%～5%的比例将步骤（2）所得的种子液接种到发酵培养基中，在30℃～32℃、pH7.0～7.5、170～210r/min条件下振荡培养40～50h，得发酵液。

上述制备方法中所述的LB培养基、种子液培养基、发酵培养基按照常规方法制备。

本发明芽孢耐热性强的枯草芽孢杆菌菌剂按照本领域技术人员熟知的方式可以制备成悬浮剂、可湿性粉剂、泡腾片剂、颗粒剂等农药剂型。

本发明具有的优点和有益效果为：与现有的枯草芽孢杆菌菌剂相比，本发明通过向发酵培养液或发酵培养基中添加MgCl2所得的枯草芽孢杆菌菌剂中，其芽孢耐热能力显著提高；本发明枯草芽孢杆菌菌剂货架期长。

附图说明

图1.发酵液中添加MgCl2的枯草芽孢杆菌菌剂的货架期曲线图。

图2.发酵培养基中添加MgCl2的枯草芽孢杆菌菌剂的货架期曲线图。

具体实施方式

以下以具体实施例对本发明作进一步的说明，但是不以任何方式构成对本发明的限制。

实施例1 增强枯草芽孢杆菌芽孢耐热性的金属离子筛选试验

（1）将保存在-80℃冰箱的枯草芽孢杆菌BAB-1菌种（2007年7月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.2099）在LB培养基固体平板中划线，将平板置于30℃培养箱中活化培养 24h，得活化菌种。

（2）用接种环挑取一环活化菌种接种于100mL种子液培养基（种子液培养基的组成成分及其重量比为：葡萄糖5g，酵母膏5g，蛋白胨10g，氯化钠 5g，水1000mL）中，在31℃、180r/min条件下振荡培养12h，得到种子液。

（3）按照体积百分比为4%的比例将种子液接种到发酵培养基（发酵培养基的组成成分及其重量比为：葡萄糖20g，可溶性淀粉40g，蛋白胨1g，NaNO310g，K2HPO43g，MgSO4·7H2O1g，CaCO31g，水1000mL）中，在31℃、 180r/min条件下振荡培养48h，得发酵液。

（4）取样10mL，做革兰氏染色，在显微镜下观察芽孢形成情况，在芽孢形成率大于90%时，停止发酵；

（5）取5份相同体积的发酵液，按照0.2g/100mL的比例向发酵液中分别添加金属离子：NaCl、CaCl2、MgCl2、MnSO4、FeSO4，以不添加任何金属离子的处理作为对照（CK）。

（6）将各处理发酵液置于54℃培养箱中静置14d。

（7）将各处理发酵液取出，分别取1mL样品，用无菌水以10倍浓度梯度稀释，将发酵液稀释至10-n。将LB培养皿分为四个区，每区点20μL稀释液。培养皿置于35℃培养8h，计数每区菌落，以10-40个菌落浓度为宜，并计算出每mL发酵液中芽孢的数量，比较不同金属离子处理的发酵液芽孢存活数量

芽孢数量=(A1+A2+A3+A4)／4×10n×50（单位：个/mL）。

其中A1、A2、A3、A4为培养皿各区的菌落数，n为稀释倍数。

（8）结果（见表1）54℃处理7d后对照的芽孢数量为6.1×109，NaCl、 CaCl2、MnSO4和FeSO4处理的芽孢数量分别为6.0×109，5.5×109，6.0×109，6.2×109， 6.2×109，而MgCl2处理的芽孢数量为8.4×109，显著高于对照和其他金属离子处理的芽孢数量，说明NaCl，CaCl2，MnSO4和FeSO4对枯草芽孢杆菌芽孢耐热性基本没有影响，而MgCl2能够显著提高枯草芽孢杆菌芽孢的耐热能力。

表1 不同金属离子对枯草芽孢杆菌芽孢耐热能力的影响的试验结果

实施例2 本发明枯草芽孢杆菌菌剂的制备及芽孢耐热性对比试验

具体包括如下步骤：

（1）、将保存在-80℃冰箱的枯草芽孢杆菌BAB-1菌种在LB培养基固体平板中划线，将平板置于30℃培养箱中活化培养24h。

（2）、用接种环挑取一环活化菌种接种于种子液培养基（种子液培养基的组成成分及其重量比为：葡萄糖5g，酵母膏5g，蛋白胨10g，氯化钠5g，水 1000mL）100ml中，在31℃、180r/min条件下振荡培养12h，得到种子液。

（3）、按照体积比为4%的比例将种子液接种到发酵培养基（发酵培养基的组成成分及其重量比为：葡萄糖20g，可溶性淀粉40g，蛋白胨1g，NaNO310g，K2HPO43g，MgSO4·7H2O1g，CaCO31g，水1000mL）中，在31℃、 180r/min条件下振荡培养48h。

（4）、取样10mL，做革兰氏染色，在显微镜下观察芽孢形成情况，在芽孢形成率大于90%时停止发酵。

（5）、将发酵液取出分成2份，其中一份中按照0.2g/100mL比例添加MgCl2，搅拌均匀，得本发明菌剂；另一份不做处理。

（6）、将（5）中两份发酵液在90℃和100℃水浴处理30分钟，取出置于冷水中迅速降温至室温，用无菌水以10倍浓度梯度稀释，将发酵液稀释至 10-n。将LB培养皿分为四个区，每区点20μL稀释液。培养皿置于35℃培养 8h，计数每区菌落，以10-40个菌落浓度为宜，并计算出每mL发酵液中芽孢的数量，比较两份发酵液的芽孢存活数量

芽孢数量=(A1+A2+A3+A4)／4×10n×50（单位：个/mL）。

注：A1、A2、A3、A4为培养皿各区的菌落数，n为稀释倍数。

结果（见表2），90℃处理下，MgCl2处理芽孢耐热能力较对照有显著提高； 100℃处理下，MgCl2处理芽孢存活率为对照组的7.5倍。说明在发酵液中添加 MgCl2后，枯草芽孢杆菌芽孢的耐热能力显著提高。

表2 MgCl2对枯草芽孢杆菌芽孢耐热能力的影响的对比试验结果

实施例3 本发明枯草芽孢杆菌菌剂的制备及芽孢耐热性对比试验

按照如下方法进行：

（1）同实施例2步骤（1）。

（2）同实施例2步骤（2）。

（3）配制2份发酵培养基，其中一份不添加MgCl2，其组成成分及其重量比为：葡萄糖20g，可溶性淀粉40g，蛋白胨1g，NaNO310g，K2HPO43g， MgSO4·7H2O1g，CaCO31g，水1000mL。另一份添加MgCl2，即按照在上述相同组成发酵培养基的基础上添加0.2%的MgCl2。

将步骤（2）的种子液按照体积比为4%的比例分别接种到上述发酵培养基中，在31℃、180r/min条件下振荡培养48h。

（4）取样10mL，做革兰氏染色，在显微镜下观察芽孢形成情况，在芽孢形成率大于90%时停止发酵，得发酵液，其中发酵培养基中添加MgCl2的所得发酵液即为本发明枯燥芽孢杆菌的悬浮液。

（5）将两种发酵液分别在90℃和100℃水浴处理30min，取出置于冷水中迅速降温至室温，使用无菌水以10倍浓度梯度稀释，将发酵液稀释至10-n。将LB培养皿分为四个区，每区点20μL稀释液。培养皿置于35℃培养8h，计数每区菌落，以10-40个菌落浓度为宜，并计算出每mL发酵液中芽孢的数量，比较两份发酵液的芽孢存活数量

芽孢数量=(A1+A2+A3+A4)／4×10n×50（单位：个/mL）。

注：A1、A2、A3、A4为培养皿各区的菌落数，n为稀释倍数。

结果（见表3），90℃和100℃处理下，添加MgCl2的发酵培养基中的芽孢存活率比未添加MgCl2的处理均有显著提高，说明在发酵培养基中添加也能显著提高枯草芽孢杆菌芽孢的耐热性。

表3 MgCl2对枯草芽孢杆菌芽孢耐热能力的影响的对比试验结果

实施例4 本发明枯草芽孢杆菌菌剂的货架期长短对比试验

按照如下方法进行：

（1）按照实施例2和实施例3的方法，分别制备成在发酵培养基或发酵液中添加0.2%浓度MgCl2的枯草芽孢杆菌菌剂，以未添加MgCl2的枯草芽孢杆菌菌剂为对照。

（2）将添MgCl2的菌剂和未添加MgCl2的对照菌剂置于同一个培养箱中 45℃放置，每隔一个月进行取样品1mL。

（3）将样品用无菌水以10倍浓度梯度稀释，将发酵液稀释至10-n。将LB 培养皿分为四个区，每区点20μL稀释液。培养皿置于35℃培养8h，计数每区菌落，以10-40个菌落浓度为宜，并计算出每mL菌剂中芽孢的数量，比较两份菌剂的芽孢存活数量

芽孢数量=(A1+A2+A3+A4)／4×10n×50（单位：个/mL）。

注：A1、A2、A3、A4为培养皿各区的菌落数，n为稀释倍数。

（4）对按照实施例2中制得发酵液中添加MgCl2的菌剂进行12个月的检测，结果（见图1），添加MgCl2的枯草芽孢杆菌菌剂的芽孢含量在12个月的监测中逐渐降低，降低程度缓慢，最终在12个月时芽孢含量为4.05×109个/mL，而未添加MgCl2的处理中，芽孢含量迅速下降，在12个月时芽孢含量仅为 0.8×108个/mL。说明在发酵液中添加MgCl2所得的枯草芽孢杆菌菌剂货架期长。

（5）对按照实施例3中制得发酵培养基中添加MgCl2的菌剂进行12个月的检测，结果（见图2）添加MgCl2的枯草芽孢杆菌菌剂的芽孢含量在12个月的监测中逐渐降低，降低程度缓慢，最终在12个月时芽孢含量为7.2×108个/mL，而未添加MgCl2的处理中，芽孢含量迅速下降，在12个月时芽孢含量仅为 0.4×108个/mL。表明在发酵培养基中添加MgCl2所得的枯草芽孢杆菌菌剂货架期长。