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1、(10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201310070886.2 (22)申请日 2013.03.06 C07K 7/08(2006.01) C12N 15/31(2006.01) G01N 33/68(2006.01) (73)专利权人 南昌大学 地址 330031 江西省南昌市红谷滩新区学府 大道 999 号 (72)发明人 何庆华 许杨 陈波 (74)专利代理机构 南昌新天下专利商标代理有 限公司 36115 代理人 施秀瑾 (54) 发明名称 伏马菌素 B1的抗原模拟表位及其应用 (57) 摘要 本 发 明 属 于 生 物 技 术 领 域， 涉 及 伏 马 菌 素 。
2、B1的 抗 原 模 拟 表 位， 其 氨 基 酸 序 列 为 NNAAMYSEMATD。 本发明FB1抗原模拟表位可以替换 价格昂贵且毒性强的FB1标准品， 并作为竞争抗原 或固相包被抗原应用于FB1的免疫学检测， 该抗原 模拟表位具有与天然 FB1分子相似的免疫反应特 性， 效果非常好。减少了 FB1对人体健康的危害， 节约了成本， 具有很高的应用价值。 (51)Int.Cl. 审查员 李翠莹 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书1页 说明书6页 序列表4页 附图1页 (10)授权公告号 CN 103342739 B (45)授权公告日 2015.03.11 C。
3、N 103342739 B 1/1 页 2 1. 伏马菌素 B1的抗原模拟表位， 其特征在于氨基酸序列为 ： NNAAMYSEMATD。 2. 编码权利要求 1 所述抗原模拟表位氨基酸序列的核苷酸。 3. 如权利要求 2 所述的核苷酸序列对应为 ： AATAATGCGGCGATGTATTCGGAGATGGCTACTGAT。 4. 权利要求 1 所述抗原模拟表位在非治疗目的免疫学检测分析中的应用。 5.如权利要求4所述应用， 其特征在于伏马菌素B1抗原模拟表位以固相抗原或竞争抗 原在免疫学检测分析中的应用。 6.如权利要求4所述应用， 其特征在于伏马菌素B1抗原模拟表位作为固相抗原在胶体 金免疫。
4、层析检测分析中的应用。 权 利 要 求 书 CN 103342739 B 2 1/6 页 3 伏马菌素 B1的抗原模拟表位及其应用 技术领域 0001 本发明属于生物技术领域， 具体涉及伏马菌素 B1抗原模拟表位及其应用。 背景技术 0002 伏马菌素 B1(Fumonisins B1， FB1) 是一种常见的真菌毒素， 主要由串珠镰刀菌 (Fusarium moniliforme) 产生研究表明， FB1对人类及动物具有较强的毒性作用， 包括神 经毒性、 生殖毒性、 胚胎毒性及致畸致癌等， 国际癌症研究中心已把 FB1化分为 2B 组， 即对 人类可能的致癌物。目前， 多数国家已经对谷物、 。
5、粮食及食品中 FB1的残留含量设定了限量 标准， 如联合国粮农组织 （FAO） 规定每日最大允许摄入 FB1， FB2， FB3 总量为 2 g/kg 体重 ； 瑞士规定粮食中 FB1 和 FB2总残留限量为 1000 g/L。 0003 目前， 检测食品中 FB1的方法主要有高效液相色谱、 气相色谱、 薄层色谱及免疫学 检测等方法， 免疫学检测方法以其灵敏度高、 检测方便、 成本低廉等优势在 FB1的检测中得 到了广泛的应用。然而， 在建立免疫学检测方法的过程中， 必须使用 FB1标准品为原料来制 备竞争抗原或者固相包被抗原， FB1不仅价格昂贵而且具有极强的致癌性， 对检测人员的健 康和环。
6、境造成极大的威胁， 从而在一定程度上制约了免疫学检测方法的应用和推广。有鉴 于此， 人们开始采用抗独特型抗体及抗原模拟表位技术来实现有害小分子物质标准品的替 代， 并取得了一定的进展。噬菌体展示肽库技术的主要特点是可有效地筛选出与目标靶体 特异结合的噬菌体展示多肽， 该技术在探索受体与配体之间相互作用结合位点、 寻求高亲 和力生物活性的配体分子、 探索未知蛋白质空间结构表位、 新型疫苗的研制等方面应用广 泛。 0004 本发明通过用噬菌体展示肽库技术， 从肽库中筛选出能与靶分子 （抗 FB1单克隆抗 体） 特异性结合的多肽 （抗原模拟表位） ， 该抗原模拟表位具有与天然 FB1分子相似的免疫反。
7、 应特性， 通过获得的FB1抗原模拟表位， 以代替价格昂贵且毒性强的FB1标准品， 并作为竞争 抗原或固相包被抗原应用于 FB1的免疫学检测。 发明内容 0005 本发明以抗 FB1单克隆抗体为靶分子， 将靶分子固相包被于酶标板上， 投入噬菌体 随机展示十二肽库， 进行亲和淘选， 获得了七种 FB1的抗原模拟表位。它们的氨基酸序列如 下 ： 0006 NNAAMYSEMATD、 FYTSPGRTSHYM、 IHQELRYTKDSP、 GDGVHKSHDIRG、 TTLQMRSEMADD、 SMLNDYRDYTTH、 TRDKSSMLERWP。 0007 本发明还涉及编码上述抗原模拟表位氨基酸序。
8、列的核苷酸序列， 分别对应为 ： 0008 AATAATGCGGCGATGTATTCGGAGATGGCTACTGA、 TTTTATACTAGTCCGGGTCGGACGAGTCATTAT ATG 、 ATTCATCAGGAGTTGCGTTATACTAAGGATTCTCCG、 GGGGATGGGGTGCATAAGTCGCATGATATCCGTGG G、 ACTACGCTTCAGATGCGTAGTGAGATGGCTGATGAT、 TCGATGCTTAATGATTATCGTGATTATACTACTCAT、 A CTCGGGATAAGTCGTCGATGTTGGAGCGTTGGCCG 说 明 书 CN 1。
9、03342739 B 3 2/6 页 4 0009 上述抗原模拟表位 （多肽） 结构中， 大写英文字母分别代表二十一种已知天然L-型 氨基酸残基或其 D- 型异构体的一种， C 代表半胱氨酸残基， D 代表天冬氨酸残基， P 代表脯 氨酸残基， R 代表精氨酸残基， K 代表赖氨酸残基， H 代表组氨酸残基， I 代表异亮氨酸残基， V 代表缬氨酸残基， Y 代表酪氨酸残基， S 代表丝氨酸残基， F 代表苯丙氨酸残基， E 代表谷氨 酸残基， M 代表甲硫氨酸残基， G 代表甘氨酸残基， L 代表亮氨酸残基， Q 代表谷氨酰胺残基， W 代表色氨酸残基， N 代表天冬酰胺残基， A 代表丙氨。
10、酸残基， T 代表苏氨酸残基。 0010 本发明提及的 FB1 抗原模拟表位 （多肽） 可通过噬菌体扩增、 化学合成或基因工程 重组表达的方式进行大量制备。噬菌体扩增是指将展示有 FB1 抗原模拟表位 （多肽） 的噬菌 体， 通过生物扩增的方式， 大量繁殖生产展示有 FB1 抗原模拟表位 （多肽） 的噬菌体粒子。化 学合成是指依据公布的 FB1 抗原模拟表位的氨基酸序列， 通过化学合成多肽的方式进行多 肽合成。基因工程重组表达的方式是指将编码 FB1 抗原模拟表位的基因， 通过克隆至表达 载体， 以多肽 - 融合蛋白的形式进行 FB1 抗原模拟表位的大量制备。 0011 本发明还涉及所述伏马菌。
11、素 B1抗原模拟表位在免疫学检测分析中的应用。免疫 学检测的类型包括酶联免疫吸附检测、 胶体金免疫层析、 免疫斑点杂交等基于抗原 - 抗体 特异性反应的免疫学分析检测类型。 0012 本发明伏马菌素 B1抗原模拟表位 （NNAAMYSEMATD、 FYTSPGRTSHYM、 IHQELRYTKDSP、 GDGVHKSHDIRG、 TTLQMRSEMADD、 SMLNDYRDYTTH、 TRDKSSMLERWP） 在应用时， 可以把合成的模拟 表位用于免疫学检测分析， 将通过噬菌体扩增获得的展示有 FB1抗原模拟表位 （多肽） 的噬 菌体粒子直接用于分析检测， 当然， 也可以将 FB1抗原模拟表。
12、位从噬菌体上切下来代替 FB1 标准品来进行免疫学检测分析。 0013 还涉及伏马菌素 B1抗原模拟表位以固相抗原或竞争抗原在免疫学检测分析中的 应用。 0014 还涉及伏马菌素 B1抗原模拟表位作为固相抗原在胶体金免疫层析检测分析中的 应用。 0015 前述伏马菌素 B1抗原模拟表位可以替换价格昂贵且毒性强的 FB1标准品， 并作为 竞争抗原或固相包被抗原应用于FB1的免疫学检测， 该抗原模拟表位具有与天然FB1分子相 似的免疫反应特性， 效果非常好。 0016 本发明的有益效果是 ： 本发明伏马菌素B1抗原模拟表位可以替换价格昂贵且毒性 强的 FB1标准品， 并作为竞争抗原或固相包被抗原应。
13、用于 FB1的免疫学检测， 该抗原模拟表 位具有与天然 FB1分子相似的免疫反应特性， 效果非常好。减少了 FB1对人体健康的危害， 节约了成本， 具有很高的应用价值。 附图说明 0017 图 1 为以 FB1 抗原模拟表位建立的间接竞争 ELISA 标准曲线。标准曲线的线性回 归方程为 y = -144.5ln(x) + 196.18， R = 0.9609， IC50值为 0.562ng/mL， 线性检测范围 为 0.1712.420 ng/mL， 最低检测限为 0.121 ng/mL。 具体实施方式 0018 实施例 1. FB1抗原模拟表位的亲和淘选及其鉴定 说 明 书 CN 1033。
14、42739 B 4 3/6 页 5 0019 1） FB1抗原模拟表位的亲和淘选 ： 具体方法为 ： 用 10 mM PBS (pH 7.4) 稀释抗 FB1单克隆抗体， 并以终浓度 100 g/mL 包被 96 孔酶标板， 4孵育过夜。第二天用 TBST (50 mM NaCl, pH 7.5 包含 0.1% Tween-20 (v/v) ) 洗涤 10 次后， 加入 300 l 封闭液 （3% BSA-PBS） 4孵育 2 小时。2 小时后弃封闭液， 用 TBST 洗涤 5 次， 每孔加入 100 l 噬 菌体肽库 （噬菌体展示十二肽库， 购自 NEB 公司， 用 TBS 10 倍稀释噬菌。
15、体原液， 约 1.01011 pfu） ， 22-26振荡反应 1 小时。弃去未结合的噬菌体， 用 TBST 洗涤 10 次， 结合上的噬菌体 用 0.2 M Glycine-HCl (pH 2.2) 洗脱， 并立即用 15 l 1 M Tris-HCl (pH 9.1) 中和。 取 10 l 洗脱噬菌体测滴度， 其余的用于感染 20 mL 生长至对数前期的E. coli ER2738 菌株进行扩增。第三天用 PEG/NaCl 沉淀纯化噬菌体， 并测定扩增后噬菌体的滴度。 0020 在第二、 第三轮的淘选过程中， 包被的抗 FB1单克隆抗体浓度分别为 75 g/mL 和 50 g/mL， 所用。
16、的 TBST 浓度为 0.25% 和 0.5%， 其余步骤同上。 0021 2） 阳性噬菌体克隆的鉴定 ： 从第三轮淘选后测定噬菌体滴度的平板中随机挑 取 20 个噬菌体斑， 进行噬菌体的扩增， 采用间接酶联免疫吸附检测方法 （Indirect Enzyme Linked immunoasorbent assay, I-ELISA） 进行阳性噬菌体克隆的鉴定， 具体方法为 ： 首 先， 用10 mM PBS (pH 7.4) 稀释抗FB1单克隆抗体， 10 g/mL包被96孔酶标板， 4孵育过 夜。第二天用 PBST (10 mM PBS, 0.05% Tween-20 (v/v) ) 洗涤 。
17、3 次后， 用含有 3% 脱脂奶 粉的 PBS 进行封闭， 37孵育 1 小时 ； 投入 100 l 噬菌体斑扩增液 （1.01011 pfu） ， 以原 始噬菌体肽库作为阴性对照， 37 孵育 1 小时 ； 加入 1:5000 倍稀释的 HRP 标记抗 M13 噬菌 体二抗 100 l， 37 孵育 1 小时 ； 加入 100l TMB 底物液， 避光显色 5min， 酶标仪 （Thermo Scientifi c Multiskan FC） 读取 450 nm 处的吸收值。选取 OD450大于阴性对照 2 倍的噬菌 体克隆为阳性克隆。 0022 3) FB1抗原模拟表位的鉴定 ： 采用间接。
18、竞争 ELISA 的方法进行 FB1抗原模拟表位 的鉴定， 具体方法为 ： 用 10 mM PBS (pH 7.4) 稀释抗 FB1单克隆抗体， 10 g/mL 包被酶标 板， 4孵育过夜 ； 第二天用 PBST (10 mM PBS, 0.05% Tween-20 (v/v) 洗涤 3 次后， 用含 有 3% 脱脂奶粉的 PBS 进行封闭， 37孵育 1 小时 ； 投入 50 l 经间接 ELISA 鉴定为阳性的 噬菌体克隆 （1.01011 pfu） 和 50 l FB1标准品 （浓度范围为 0-20 ng/ml） ， 37孵育 1 小 时 ； 加入 1:5000 稀释 HRP 标记的抗 。
19、M13 噬菌体二抗 100 l， 37孵育 1 小时 ； 加入 100l TMB 底物液， 避光显色 5min， 读取 OD450， 能结合抗 FB1单克隆抗体， 且能被 FB1标准品所阻断 的噬菌体， 鉴定为 FB1的抗原模拟表位。 0023 实施例 2. FB1抗原模拟表位编码基因的测序及其氨基酸序列的确定 0024 将经过间接竞争 ELISA 鉴定展示有 FB1 抗原模拟表位的噬菌体进行扩增， 提取噬 菌体的 DNA 测序模板。简要过程如下 ： 进行噬菌体扩增， 在第一步离心后， 将 800 l 含噬菌 体上清转入一新离心管。加入 200 l PEG/NaCl 沉淀噬菌体。离心后将沉淀重。
20、悬于 100 l 碘化物缓冲液 (10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM EDTA, 4 M NaI)， 加入250 l无水乙醇 沉淀 DNA， 离心后再用 70% 乙醇洗涤沉淀 （DNA 测序模板） 。沉淀最终重悬于 20 l 灭菌水， 取 2 l 进行琼脂糖凝胶电泳分析 ； 取 5 L 噬菌体模板进行 DNA 测序， 其 -96 gIII 测序引 物为 ： 5 -HOCCC TCA TAG TTA GCG TAA CG-3 。依据 DNA 测序结果及密码子表可获得 FB1抗 原模拟表位的氨基酸序列。它们的氨基酸序列如下 ： 0025 NNAAMYSEMATD、 FYTS。
21、PGRTSHYM、 IHQELRYTKDSP、 GDGVHKSHDIRG、 TTLQMRSEMADD、 说 明 书 CN 103342739 B 5 4/6 页 6 SMLNDYRDYTTH、 TRDKSSMLERWP。 0026 实施例 3. FB1 抗原模拟表位作为竞争抗原在 ELISA 中的应用 0027 (1) 样品提取 0028 称取5g 样品 （谷物及其相关食品） ， 加入25 毫升 60 % 的甲醇-PBS溶液， 200 rpm 振荡 5 分钟 ； 将提取液用 whatman 1 号滤纸进行过滤后， 取 1 毫升滤液加入 4 毫升 PBS （磷 酸盐缓冲液， pH=7.2） 混匀。
22、后， 即为样品提取液， 待用。 0029 （2） 包被及封闭 0030 用 10 mM PBS (pH 7.4) 稀释抗 FB1单克隆抗体， 10 g/mL 包被酶标板， 4孵育 过夜。第二天用 PBST (10 mM PBS, 0.05% Tween-20 (v/v) 洗涤 3 次后， 用含有 3% 脱脂 奶粉的 PBS 进行封闭， 37孵育 1 小时后， 用 PBST 洗板 6 次待用。 0031 （3） 标准曲线的建立 0032 取出经步骤 （2） 处理好的板条， 每孔分别投入 50 l 展示有 FB1抗原模拟表位的噬 菌体 （1.01011 pfu） 和一系列不同浓度的50 l FB1。
23、标准品， 37孵育1小时。 加入1:5000 稀释 HRP 标记的抗 M13 噬菌体二抗， 37孵育 1 小时。然后用 TMB 底物显色， 读取 OD450。以 FB1浓度对数为横坐标， 结合率 （加入 FB1的孔的 OD450/ 未加入 FB1的孔的 OD450100%） 为纵 坐标， 建立间接竞争标准曲线。结果显示标准曲线呈 S 型， 线性相关性较好 （图 1） 。如图 1， 以 FB1 抗原模拟表位 （氨基酸序列为 NNAAMYSEMATD） 建立的间接竞争 ELISA 标准曲线。标 准曲线的线性回归方程为 y = -144.5ln(x) + 196.18， R = 0.9609， IC。
24、50 值为 0.562ng/ mL， 线性检测范围为 0.1712.420 ng/mL， 最低检测限为 0.121 ng/mL。 0033 （4） 样品的检测 0034 取出经步骤 （2） 处理好的板条， 每孔分别投入 50 l 展示有 FB1抗原模拟表位的噬 菌体 （1.01011 pfu） 和待测样品提取液， 37孵育 1 小时。加入 1:5000 稀释 HRP 标记的 抗 M13 噬菌体二抗， 37孵育 1 小时。然后用 TMB 底物显色， 读取 OD450， 计算结合率， 并根据 标准曲线， 倒推出样品中 FB1的含量。 0035 实施例 4. FB1 抗原模拟表位作为固相抗原在 EL。
25、ISA 中的应用 0036 (1) 样品提取 0037 称取5g 样品 （谷物及其相关食品） ， 加入25 毫升 60 % 的甲醇-PBS溶液， 200 rpm 振荡 5 分钟 ； 将提取液用 whatman 1 号滤纸进行过滤后， 取 1 毫升滤液加入 4 毫升 PBS （磷 酸盐缓冲液， pH=7.2） 混匀后， 即为样品提取液， 待用。 0038 （2） 包被及封闭 0039 用10 mM PBS (pH 7.4) 稀释展示有FB1抗原模拟表位的噬菌体 （2.01011 pfu） ， 100 微升包被于酶标板， 4孵育过夜。第二天用 PBST (10 mM PBS, 0.05% Twee。
26、n-20 (v/ v) 洗涤 3 次后， 用含有 3% 脱脂奶粉的 PBS 进行封闭， 37孵育 1 小时后， 用 PBST 洗板 6 次待用。 0040 （3） 标准曲线的建立 0041 取出经步骤 （2） 处理好的板条， 每孔分别投入 50 l 抗 FB1单克隆抗体 （0.5 ng/ ml） 和一系列不同浓度的 50 l FB1标准品， 37孵育 1 小时。加入 1:2000 稀释 HRP 标记 的羊抗鼠 IgG 二抗， 37孵育 1 小时。然后用 TMB 底物显色， 读取 OD450。以 FB1浓度对数为 横坐标， 结合率 （加入 FB1的孔的 OD450/ 未加入 FB1的孔的 OD4。
27、50100%） 为纵坐标， 建立间接 说 明 书 CN 103342739 B 6 5/6 页 7 竞争标准曲线。 0042 （4） 样品的检测 0043 取出经步骤 （2） 处理好的板条， 每孔分别投入 50 l 抗 FB1单克隆抗体 （0.5 ng/ ml） 和一系列不同浓度的 50 l FB1标准品， 37孵育 1 小时。加入 1:2000 稀释 HRP 标记 的羊抗鼠 IgG 二抗， 37孵育 1 小时。然后用 TMB 底物显色， 读取 OD450。以 FB1浓度对数为 横坐标， 结合率 （加入 FB1的孔的 OD450/ 未加入 FB1的孔的 OD450100%） 为纵坐标， 建立间。
28、接 竞争标准曲线。 0044 实施例 5. FB1 抗原模拟表位作为固相抗原在胶体金免疫层析分析中的应用 0045 (1) 样品提取 0046 称取5g 样品 （谷物及其相关食品） ， 加入25 毫升 60 % 的甲醇-PBS溶液， 200 rpm 振荡 5 分钟 ； 将提取液用 whatman 1 号滤纸进行过滤后， 取 1 毫升滤液加入 4 毫升 PBS （磷 酸盐缓冲液， pH=7.2） 混匀后， 即为样品提取液， 待用。 0047 （2） 噬菌体及控制线的点阵 0048 用10 mM PBS (pH 7.4) 稀释展示有本发明FB1抗原模拟表位的噬菌体 （2.01011 pfu） ， 。
29、用点阵仪或微量移液器将噬菌体划线于硝酸纤维素膜上 （孔径 0.2-0.45 微米） ， 作为 检测线 ； 将0.5 mg/ml的HRP标记的羊抗鼠IgG二抗， 用点阵仪或微量移液划线于同一张硝 酸纤维素膜上 （位于检测线的上方， 距离大于 5 毫米） ， 作为控制线。 0049 （3） 胶体金标记 FB1抗体 0050 将FB1抗体逐滴加入胶体金溶液 （pH=8.2） 中， 边滴边搅拌， 30分钟后， 取1% PEG加 入上述溶液中， 继续搅拌 15 分钟后加入十分之一体积的 10% BSA 溶液， 搅拌 15 分钟后， 静 置 30 分钟， 离心后去上清， 得到胶体金标记的 FB1抗体溶液。。
30、 0051 （4） 胶体金检测卡的组装 0052 将胶体金标记的 FB1抗体点喷于胶金垫上 （1.0 微克 / 毫升） ， 将样品垫、 胶金垫， 点阵了检测线和控制线的硝酸纤维素膜和吸收纸进行组装， 切成试纸条， 装入检测卡中待 用。 0053 （5） 样品的检测 0054 将样品提取液加入样品垫中， 静置 10 分钟， 若样品中含有 FB1且超过胶体金检测 试纸的检测阈值， 则检测线区域不显色， 而控制线区域显色 ； 若样品中不含有 FB1且低于胶 体金检测试纸的检测阈值， 则检测线区域显色， 控制线区域也显色。若控制线区域不显色， 表明试纸条失效。 0055 实施例 5 FB1抗原模拟表位。
31、的大量制备 0056 （1） 以噬菌体扩增的方式 0057 将展示有FB1抗原模拟表位的噬菌体加入至20 ml接种有ER 2738的培养物中， 37 度 220 rpm 振荡培养 4.5 h。将培养物转入另一离心管中， 4 10000 rpm 离心 10 min， 将上清的上部 80 % 转入一新鲜管中， 加入 1/6 体积的 PEG/NaCl， 4 下静置 120 min。4 10000 rpm 离心 PEG/NaCL 静置溶液 15 min。弃上清， 短暂离心后吸去残留上清液。加入 1mL TBS 进行重悬， 即为噬菌体扩增液。 0058 （2） 以 FB1抗原模拟表位 - 融合蛋白的方式。
32、进行制备 0059 A. PCR 扩增 FB1 抗原模拟表位的外源编码基因 说 明 书 CN 103342739 B 7 6/6 页 8 0060 PCR 反应体系 ： (50 L) 0061 10 Pyrobest Buffer (Mg2+ plus) 5 L 0062 dNTP Mixture (each for 2.5 mM) 4 L 0063 M13KE insert extension primer (10 mM） 1 L 0064 -96 gIII sequencing primer (10 mM) 1 L 0065 噬菌体 DNA 模板 1 L 0066 Pyrobest DNA。
33、 Polymerase 0.5 L 0067 灭菌 ddH2O 37.5 L 0068 PCR 反应条件 ： 95 5 min， 接着 95 30 sec， 55 30 sec， 72 40sec ， 72 10 min 共 30 cycles。 0069 采用 PCR 产物回收试剂盒纯化 PCR 产物， 微量核酸定量仪定量。 FB1抗原模拟表 位的编码基因序列分别对应为 ： 0070 AATAATGCGGCGATGTATTCGGAGATGGCTACTGA、 TTTTATACTAGTCCGGGTCGGACGAGTCATTAT ATG 、 ATTCATCAGGAGTTGCGTTATACTAAGG。
34、ATTCTCCG、 GGGGATGGGGTGCATAAGTCGCATGATATCCGTGG G、 ACTACGCTTCAGATGCGTAGTGAGATGGCTGATGAT、 TCGATGCTTAATGATTATCGTGATTATACTACTCAT、 A CTCGGGATAAGTCGTCGATGTTGGAGCGTTGGCCG 0071 B. 外源编码基因及表达载体的双酶切 0072 分别采用ACC65I和Eag I 酶对外源编码基因和表达载体 （pMAl-pIII, NEB公司， 可表达 MBP 融合蛋白） 进行双酶切。 0073 C. 酶切后产物的连接及转化 0074 将质粒 pMal-PII。
35、I 和目的片段以 1 10（摩尔比） 混匀， 于 16 水浴连接 12 h, 取 10 L 连接产物加至 100 L 感受态细胞 TB1 中， 充分混匀。冰浴 30 min 后， 42 水浴热激 90 s， 立即冰浴 5 min 后补加 600 L LB 液体培养液， 37 ， 200 rpm 培养 1 h， 10000 rpm 离心 2 min， 吸去上清留取约 200 L， 涂布于 LB-A 固体 （Ampr） 培养基中， 37 过夜培养， 得到阳性克隆。 0075 D. FB1抗原模拟表位 -MBP 融合蛋白的表达 0076 将上述获得的阳性克隆子， 从平板上挑一单菌落接种于 5 mL 。
36、LB-A， 0.2% 蔗糖中， 37， 220 r/min， 振荡培养过夜， 将过夜培养物按 1 % 接种量 （v/v） 接种于 50 mL 的 LB-A， 0.2 %蔗糖培养基中， 分别接种3瓶， 37， 220 r/min振荡培养， 当培养物细菌浓度OD600达 到 0.6 时， 向三瓶培养物中加入 IPTG 至终浓度为 0.2 mmol/L， 220 r/min 振荡培养， 将诱导 物 （PEG 溶液） 于 4 ， 4000 g， 离心 20 min 收集菌体沉淀， 弃上清。重悬细胞于 400 mL 30 mM Tris-HCl， 20% 蔗糖， pH 8.0 (80 mL/g 细胞湿重。
37、 )， 加入 EDTA 至 1 mM， 室温下震荡 5-10 min， 8000 g， 4， 离心20 min， 弃上清， 沉淀重悬于400 ml预冷的5 mM MgSO4， 冰上震荡10 min， 8000 g， 4， 离心20 min， 保留上清， 向上清液中加入8 mL 1 M Tris-HCl, pH 7.4， 获 得 FB1 抗原模拟表位 -MBP 融合蛋白。 说 明 书 CN 103342739 B 8 1/4 页 9 SEQUENCE LISTING 南昌大学 伏马菌素 B1的抗原模拟表位及其应用 1 14 PatentIn version 3.3 1 12 PRT 人工序列 1。
38、 Asn Asn Ala Ala Met Tyr Ser Glu Met Ala Thr Asp 1 5 10 2 12 PRT 人工序列 2 Phe Tyr Thr Ser Pro Gly Arg Thr Ser His Tyr Met 1 5 10 3 12 PRT 人工序列 序 列 表 CN 103342739 B 9 2/4 页 10 3 Ile His Gln Glu Leu Arg Tyr Thr Lys Asp Ser Pro 1 5 10 4 12 PRT 人工序列 4 Gly Asp Gly Val His Lys Ser His Asp Ile Arg Gly 1 5 10。
39、 5 12 PRT 人工序列 5 Thr Thr Leu Gln Met Arg Ser Glu Met Ala Asp Asp 1 5 10 6 12 PRT 人工序列 6 Ser Met Leu Asn Asp Tyr Arg Asp Tyr Thr Thr His 1 5 10 序 列 表 CN 103342739 B 10 3/4 页 11 7 12 PRT 人工序列 7 Thr Arg Asp Lys Ser Ser Met Leu Glu Arg Trp Pro 1 5 10 8 35 DNA 人工序列 8 aataatgcgg cgatgtattc ggagatggct actg。
40、at 36 9 36 DNA 人工序列 9 ttttatacta gtccgggtcg gacgagtcat tatatg 36 10 36 DNA 人工序列 10 attcatcagg agttgcgtta tactaaggat tctccg 36 序 列 表 CN 103342739 B 11 4/4 页 12 11 36 DNA 人工序列 11 ggggatgggg tgcataagtc gcatgatatc cgtggg 36 12 36 DNA 人工序列 12 actacgcttc agatgcgtag tgagatggct gatgat 36 13 36 DNA 人工序列 13 tcgatgctta atgattatcg tgattatact actcat 36 14 36 DNA 人工序列 14 actcgggata agtcgtcgat gttggagcgt tggccg 36 序 列 表 CN 103342739 B 12 1/1 页 13 图 1 说 明 书 附 图 CN 103342739 B 13 。