一种微藻培养基及其应用.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 103224889 A (43)申请公布日 2013.07.31 CN 103224889 A *CN103224889A* (21)申请号 201310189796.5 (22)申请日 2013.05.21 C12N 1/12(2006.01) C12R 1/89(2006.01) (71)申请人 青岛蔚蓝生物集团有限公司 地址 266061 山东省青岛市崂山区苗岭路 29 号山东高速大厦 12A07 (72)发明人 李自英 苟万里 武玉强 王鹏 郑玉莲 (74)专利代理机构 青岛海昊知识产权事务所有 限公司 37201 代理人 曾庆国 (54) 发明名称 一种微藻。

2、培养基及其应用 (57) 摘要 本发明的目的是提供一种微藻培养基及其应 用， 即一种防止微藻附壁结团的培养基， 该培养基 使用简单方便， 能有效抑制微藻附壁结团， 从而简 化微藻的生产工艺， 减小对生产设备的损耗。 本发 明的培养基由硝酸盐、 尿素 （CON2H4） 、 磷酸氢盐和 / 或磷酸二氢盐、 硅酸盐、 微量元素、 阿拉伯胶、 海 藻多糖和卡拉胶组成。本发明所述培养基配制方 法简单， 使用方便， 可应用于多种微藻的培养， 能 有效防止微藻附壁结团， 从而大大减少实验室培 养的工作量， 降低封闭式反应器的清洗难度， 延长 光生物反应器的使用寿命， 为微藻的工业化生产 提供了保障。 (51。

3、)Int.Cl. 权利要求书 1 页 说明书 4 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书4页 附图1页 (10)申请公布号 CN 103224889 A CN 103224889 A *CN103224889A* 1/1 页 2 1. 一种微藻培养基， 所述的培养基由硝酸盐、 尿素、 磷酸氢盐和 / 或磷酸二氢盐、 硅酸 盐、 微量元素、 阿拉伯胶、 海藻多糖和卡拉胶组成。 2. 如权利要求 1 所述的培养基， 其特征在于所述的硝酸盐为 NaNO3和 / 或 KNO3。 3. 如权利要求 1 所述的培养基， 其特征在于所述的磷酸氢盐。

4、为 Na2HPO4和 / 或 K2HPO4。 4.如权利要求1所述的培养基， 其特征在于所述的磷酸二氢盐为NaH2PO4和/或KH2PO4。 5. 如权利要求 1 所述的培养基， 其特征在于所述的硅酸盐为 Na2SiO3和 / 或 K2SiO3。 6. 权利要求 1 所述的培养基， 其特征在于， 所述的培养基由 NaNO3、 CON2H4、 NaH2PO4、 Na2SiO3、 微量元素、 阿拉伯胶、 海藻多糖和卡拉胶组成。 7. 如权利要求 6 所述的培养基， 其特征在于所述的培养基各组分及其质量百分比含 量分别为 NaNO33 10%、 CON2H43 10%、 NaH2PO40.5 1.5。

5、%、 Na2SiO32.5 10%、 微量元素 1.0 1.5%、 阿拉伯胶 5 10%、 海藻多糖 60 70% 和卡拉胶 5 10%。 8. 如权利要求 7 所述的培养基， 其特征在于所述的微量元素由 FeCl3、 Na2EDTA、 CuSO4、 Na2MoO4、 ZnSO4、 CoCl2和 MnCl2组成。 9. 如权利要求 8 所述的培养基， 其特征在于所述的微量元素的组分及其质量百分比含 量分别为 ： FeCl340 45%、 Na2EDTA54.5 59%、 CuSO40.1 0.15%、 Na2MoO40.05 0.1%、 ZnSO40.1 0.4%、 CoCl20.05 0.1。

6、5%、 MnCl20.1 0.3%。 10. 如权利要求 9 所述的培养基， 其特征在于所述的培养基各组分及其质量百分比 含量分别为 NaNO310%、 CON2H43%、 NaH2PO41.5%、 Na2SiO310%、 微量元素 1.5%、 阿拉伯胶 5%、 海 藻多糖 64% 和卡拉胶 5% ； 其中微量元素的组分及其质量百分比含量分别为 ： FeCl341.4%、 Na2EDTA57.8%、 CuSO40.14%、 Na2MoO40.08%、 ZnSO40.25%、 CoCl20.12%、 MnCl20.21%。 权 利 要 求 书 CN 103224889 A 2 1/4 页 3 一。

7、种微藻培养基及其应用 技术领域 0001 本发明属于藻类培养技术领域， 具体涉及一种微藻培养基及其应用， 即一种防止 微藻附壁结团的培养基及其使用方法。 背景技术 0002 微藻在水体中具有多种作用， 一方面可直接作为虾、 蟹、 贝及鱼类幼体的基础饵 料， 或培养轮虫、 枝角类、 桡足类等动物性饵料， 起间接饵料作用 ； 另一方面藻类经光合作 用能增加水体溶解氧， 并能降低水中的亚硝氮、 氨氮， 稳定水质， 维护良性生态循环系统， 因 此， 微藻是水产养殖中影响水质的关键因素。 目前在水产经济动物生产中微藻被广泛应用， 作为虾蟹类的幼体、 海参、 鱼苗、 贝类的优良开口饵料， 可以极大地提高种。

8、苗的成活率。 微藻 藻粉蛋白为优质蛋白， 且富含不饱和脂肪酸、 维生素及各种矿物质， 因此在商业化养殖场， 通常在饲料中添加藻类干粉以补充营养， 可极大地提高产品的市场价值， 对维持水产动物 正常生长和健康养殖、 提高存活率和繁殖率具有极为重要的作用。随着人们对水产品需求 的飞速增长， 水产养殖快速发展， 改善养殖环境、 提高养殖产量、 处理养殖污染成为摆在人 们面前的几个大课题。微藻技术的快速发展和应用， 成为解决这些问题的重要方法。 0003 微藻在实验室摇瓶培养过程中， 需每天摇动数次防止其附壁和下沉， 不仅大大增 加了实验室人员的工作量， 而且一旦出现结团或附壁现象， 则很难将其分离开。

9、来， 尤其在需 要进行细胞计数及分离细胞提取功能性物质的情况下， 会造成实验数据不准确。 0004 在工业级实验室使用的各种封闭式反应器中， 微藻易附着于内壁， 影响光生物反 应器的透光性和培养效果， 限制了其生产上的应用。 就反应器功能和技术性能而言， 结构实 际上并不复杂， 只要反应器能够对藻液的 CO2、 pH 和营养原料进行控制， 满足微藻生长参数 的需要， 微藻就可以在反应器中快速生长。 不同结构的反应器， 区别仅是培养微藻效率的不 同， 但是无论何种结构的封闭式反应器， 都需控制和在线检测系统简单， 能够避免检测元件 受微藻附壁的影响 ； 如果不能解决对附着在反应器内壁的微藻进行自。

10、动清洗的问题， 则没 有工业化应用的前景。 为解决此问题， 有研究通过不断改善反应器结构以防止微藻附壁， 使 反应器可长时间高效率的培养微藻， 如气提式循环水藻类培养系统、 多层次可抑制微藻附 壁生长的大容量箱式光生物反应器， 但这些设备成本较高， 且在抑制微藻附壁生长方面的 功效并不是很理想。 因此为了实现微藻的工业化生产， 急需一种更为简单、 应用广泛的方法 来防止微藻附壁结团。 发明内容 0005 本发明的目的是提供一种微藻培养基及其应用， 即一种防止微藻附壁结团的培养 基， 该培养基使用简单方便， 能有效抑制微藻附壁结团， 从而简化微藻的生产工艺， 减小对 生产设备的损耗。 0006 。

11、本发明的培养基， 由硝酸盐、 尿素 （CON2H4） 、 磷酸氢盐和 / 或磷酸二氢盐、 硅酸盐、 微量元素、 阿拉伯胶、 海藻多糖和卡拉胶组成。 说 明 书 CN 103224889 A 3 2/4 页 4 0007 所述硝酸盐优选为 NaNO3和 / 或 KNO3。 0008 所述磷酸氢盐优选为 Na2HPO4和 / 或 K2HPO4。 0009 所述磷酸二氢盐优选为 NaH2PO4和 / 或 KH2PO4。 0010 所述硅酸盐优选为 Na2SiO3和 / 或 K2SiO3。 0011 本发明所述的培养基， 其优选由 NaNO3、 CON2H4、 NaH2PO4、 Na2SiO3、 微量。

12、元素、 阿拉伯 胶、 海藻多糖和卡拉胶组成 ； 0012 其中微量元素由 FeCl3、 Na2EDTA、 CuSO4、 Na2MoO4、 ZnSO4、 CoCl2和 MnCl2组成。 0013 上述培养基各组分及其质量百分比含量分别为 NaNO33 10%、 CON2H43 10%、 NaH2PO40.5 1.5%、 Na2SiO32.5 10%、 微量元素 1.0 1.5%、 阿拉伯胶 5 10%、 海藻多糖 60 70% 和卡拉胶 5 10% ； 0014 其中微量元素的组分及其质量百分比含量分别为 ： FeCl34045%、 Na2EDTA54.5 59%、 CuSO40.1 0.15%。

13、、 Na2MoO40.05 0.1%、 ZnSO40.1 0.4%、 CoCl20.05 0.15%、 MnCl20.1 0.3%。 0015 上述培养基各组分及其质量百分比含量分别优选为 NaNO310%、 CON2H43%、 NaH2PO41.5%、 Na2SiO310%、 微量元素 1.5%、 阿拉伯胶 5%、 海藻多糖 64% 和卡拉胶 5% ； 其中微 量元素的组分及其质量百分比含量分别优选为 ： FeCl341.4%、 Na2EDTA57.8%、 CuSO40.14%、 Na2MoO40.08%、 ZnSO40.25%、 CoCl20.12%、 MnCl20.21%。 0016 本。

14、发明另一方面提供了上述培养基的使用方法为 ： 按上述组分按比例分别称取培 养基组分， 按质量体积比 1-3加水， 高温灭菌或煮沸 ； 完全冷却后， 加入上述比例的微量 元素， 搅拌均匀， 即可按常规操作接种培养各种微藻。 0017 上述培养基适用于绿藻、 硅藻和金藻等微藻的培养。 0018 所述微藻优选栅藻、 微尼双眉藻和桑葚实球藻。 0019 本发明所述培养基配制方法简单， 使用方便， 可应用于多种微藻的培养， 能有效防 止微藻附壁结团， 从而大大减少实验室培养的工作量， 降低封闭式反应器的清洗难度， 延长 光生物反应器的使用寿命， 为微藻的工业化生产提供了保障。 附图说明 0020 图 1。

15、 ： 本发明的培养基培养桑葚实球藻的细胞密度变化图。 具体实施方式 0021 申请人经过长期的筛选发现 , 阿拉伯胶、 海藻多糖和卡拉胶这三种物质通过协同 作用能有效的抑制微藻附壁结团 , 从而促成了本发明。 0022 本发明所述原料和设备可选自市售任一产品， 例如 ： NaNO3、 CON2H4、 NaH2PO4、 Na2SiO3、 FeCl3、 Na2EDTA、 CuSO4、 Na2MoO4、 ZnSO4、 CoCl2、 MnCl2、 阿拉伯胶和卡拉胶均可购自国 药集团 ； 海藻多糖可购自陕西杰弗高科实业有限公司。 0023 实施例 1 0024 一种防止微藻附壁结团的培养基， 其组分及其。

16、质量百分比含量分别为 NaNO33%、 CON2H46%、 NaH2PO40.5%、 Na2SiO32.5%、 微量元素1%、 阿拉伯胶7%、 海藻多糖70%和卡拉胶10%。 0025 上 述 培 养 基 中 微 量 元 素 的 组 分 及 其 质 量 百 分 比 含 量 分 别 为 ： FeCl340%、 说 明 书 CN 103224889 A 4 3/4 页 5 Na2EDTA59%、 CuSO40.1%、 Na2MoO40.05%、 ZnSO40.4%、 CoCl20.15%、 MnCl20.3%。 0026 实施例 2 0027 一种防止微藻附壁结团的培养基， 其组分及其质量百分比含。

17、量分别为 NaNO310%、 CON2H43%、 NaH2PO41.5%、 Na2SiO310%、 微量元素1.5%、 阿拉伯胶5%、 海藻多糖64%和卡拉胶5%。 0028 上述培养基中微量元素的组分及其质量百分比含量分别为 ： FeCl341.4%、 Na2EDTA 57.8%、 CuSO40.14%、 Na2MoO40.08%、 ZnSO40.25%、 CoCl20.12%、 MnCl20.21%。 0029 实施例 3 0030 一种防止微藻附壁结团的培养基， 其组分及其质量百分比含量分别为 NaNO36%、 CON2H410%、 NaH2PO41%、 Na2SiO35%、 微量元素 。

18、1.3%、 阿拉伯胶 10%、 海藻多糖 60% 和卡拉胶 6.7%。 0031 上述培养基中微量元素的组分及其质量百分比含量分别为 ： FeCl345%、 Na2EDTA 54.5%、 CuSO40.15%、 Na2MoO40.1%、 ZnSO40.1%、 CoCl20.05%、 MnCl20.1%。 0032 实施例 4 0033 1. 材料与方法 0034 1.1 藻种 ： 栅藻 0035 1.2 实验方法 0036 称取实施例 1 所述培养基组分 （微量元素除外） 共 1g， 加自来水 1000mL， 115灭 菌 30min ； 完全冷却后， 加入按比例称取的微量元素， 搅拌均匀， 。

19、分装至 500mL 已灭菌三角瓶 内， 每瓶300mL。 对照组为淡水f/2培养液， 每一实验组设2个平行， 培养一周后观察藻细胞 生长情况。 0037 培养条件 ： 接种量 5%， 温度 25， 光照 3000 5000lx， L:D=12:12 0038 2. 实验结果 0039 培养结果表明， 对照组的栅藻细胞完全沉降至三角瓶底部， 部分附壁， 结团较严 重 ； 而应用实施例 1 培养基的实验组藻液颜色均匀， 无结团细胞， 表明使用本发明的培养基 培养栅藻， 能有效防止栅藻附壁结团。 0040 实施例 5 0041 1. 材料与方法 0042 1.1 藻种 ： 微尼双眉藻 0043 1.。

20、2 实验方法 0044 称取实施例 2 所述培养基组分 （微量元素除外） 共 2g， 加自来水 1000mL， 115灭 菌 30min ； 完全冷却后， 加入按比例称取的微量元素， 搅拌均匀， 分装至 500mL 已灭菌三角瓶 内， 每瓶300mL。 对照组为淡水f/2培养液， 每一实验组设2个平行， 培养一周后观察藻细胞 生长情况。 0045 培养条件 ： 接种量 10%， 温度 25， 光照 3000 5000lx， L:D=12:12 0046 2. 实验结果 0047 培养结果表明， 对照组的微尼双眉藻细胞结团严重， 细胞均以结团状态存在 ； 而本 发明实施例 2 培养基培养的藻液颜。

21、色均匀， 结团细胞明显减少， 表明使用本发明的培养基 培养微尼双眉藻， 能有效防止微尼双眉藻附壁结团。 0048 实施例 6 说 明 书 CN 103224889 A 5 4/4 页 6 0049 1. 材料与方法 0050 1.1 藻种 ： 桑葚实球藻 0051 1.2 实验方法 0052 本实验设备采用可高温灭菌的搅拌式光生物反应器。按质量体积比为 3的比例 称取实施例3所述培养基组分 （微量元素除外） ， 加入反应器中， 加水灭菌煮沸， 完全冷却后， 加入按比例称取的微量元素， 打开搅拌 300 400r/min 搅拌均匀， 即可接种培养。 0053 光照培养箱培养 ： 500mL 三角。

22、瓶内装 300mL 培养液， 光照强度为 3000 5000lx， L:D=12:12， 培养温度为 25， 培养 14d。 0054 光生物反应器培养 ： 将培养至对数期的藻种以一定的移种量移入 7L 玻璃搅拌式 光生物反应器中培养， 培养周期 13d， 光生物反应器装液量 5L( 接种后体积 )， 连续光照， 反 应器内表面的光照强度为 2000 5000lx， 培养温度 25， 搅拌转速 0r/min， 通气量 100L/ h。保持接种时的 OD 值不变。 0055 对照组为 f/2 培养液配方， 控制其 N 含量与本产品相同。此实验重复两次。 0056 1.3 细胞密度测定 0057 。

23、采用血球板计数法。每 2 天定时取样测定细胞密度变化。 0058 2. 实验结果 0059 2.1 桑葚实球藻细胞密度变化 0060 桑葚实球藻细胞密度变化如图 1 所示。从图 1 可以看出， 使用本发明的培养基培 养的桑葚实球藻细胞量与相同 N 含量的 f/2 培养基相差不大。说明本产品不影响细胞的正 常生长繁殖。 0061 2.2 搅拌式反应器变化 0062 使用普通 f/2 培养基的反应器内壁及内部结构上存在大量藻细胞贴壁， 而且不易 清洗， 后期工作耗费时间长 ； 而实验组细胞贴壁现象明显减轻， 只需在放料后， 用水简单冲 洗反应器， 即基本干净， 非常方便， 同时能节省大量工时和能耗， 大大简化了整个生产工艺， 也减少了对反应器的损耗。 0063 本发明所述培养基还适用于其他绿藻、 硅藻和金藻等微藻的培养， 且防止附壁结 团的效果显著。 说 明 书 CN 103224889 A 6 1/1 页 7 图 1 说 明 书 附 图 CN 103224889 A 7 。