一种双酶分步水解制备甜高粱籽蛋白ACE抑制肽的方法及其产品和应用.pdf

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1、(10)授权公告号 CN 103194514 B (45)授权公告日 2014.08.13 CN 103194514 B (21)申请号 201310112362.5 (22)申请日 2013.04.02 C12P 21/06(2006.01) C07K 2/00(2006.01) (73)专利权人 江苏科技大学 地址 212000 江苏省镇江市京口区梦溪路 号 (72)发明人 吴琼英 贾俊强 颜辉 (74)专利代理机构 南京苏高专利商标事务所 ( 普通合伙 ) 32204 代理人 柏尚春 CN 101514355 A,2009.08.26, Kamath,V et al.Chymotrypt。

2、ic hydrolysates of a-kafirin， the storage protein of sorghum (Sorghum bicolor) exhibited angiotensin converting enzyme inhibitory activity. Food Chemistry .2007, 第 100 卷 ( 第 1 期 ), 朱均旺等 . 分步酶解法制备菜籽肽及其分 子量分布与抑制 ACE 活性关系研究 .食品科 技 .2010, 第 35 卷 ( 第 4 期 ), 杨严俊等 . 高效液相色谱分离纯化血管紧张 素转换酶活性抑制肽 . 色谱 .2003, 第 2。

3、1 卷 ( 第 3 期 ), (54) 发明名称 一种双酶分步水解制备甜高粱籽蛋白 ACE 抑 制肽的方法及其产品和应用 (57) 摘要 本发明涉及一种双酶分步水解制备甜高粱籽 蛋白 ACE 抑制肽， 其制备方法为 ： 将甜高粱籽粉碎 后配制成悬浮液， 利用淀粉酶辅助提取甜高粱籽 蛋白， 然后将甜高粱籽蛋白配成溶液， 调其 pH 后 依次分别用 - 胰凝乳蛋白酶和中性蛋白酶进行 酶解， 酶解产物经浓缩和喷雾干燥后， 即得到粉末 状甜高粱籽蛋白 ACE 抑制肽产品。本发明具有生 产时间短、 操作方便、 原料来源广泛及价格低廉、 甜高粱籽蛋白 ACE 抑制肽抑制活性高等优点， 产 品符合功能食品要。

4、求。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 李煦颖 权利要求书 1 页 说明书 4 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书1页 说明书4页 附图1页 (10)授权公告号 CN 103194514 B CN 103194514 B 1/1 页 2 1. 一种双酶分步水解制备甜高粱籽蛋白 ACE 抑制肽的方法， 其特征在于包括以下步 骤 ： 1） 将甜高粱籽进行粉碎， 然后用蒸馏水配制成甜高粱籽粉的质量百分数为 5 10 的悬浮液 ； 2） 将 5000 10000U/g 淀粉酶加入悬浮液中 50 70酶解 3h 4h， 酶解结束后， 将悬。

5、浮液的 pH 调至 8.0 9.5， 搅拌 30min 后离心， 取上清液， 调其 pH 至 4.0 4.5， 静置 30min 后离心， 收集沉淀， 将沉淀溶于蒸馏水中， 调 pH 至中性后经真空浓缩装置浓缩和喷雾 干燥得到甜高粱籽蛋白粉 ； 3） 将甜高粱籽蛋白粉配成质量百分数为 1 4的溶液， 调 pH 至 7.0 8.0， 加入 2000 4000U/g 的 - 胰凝乳蛋白酶， 在 40 50下第一次酶解 20 30min， 第一次酶 解结束后沸水浴灭酶得到混合液， 将混合液的 pH 调至 6.0 7.0， 加入 2000 4000U/g 中 性蛋白酶， 在5060下第二次酶解4060。

6、min， 第二次酶解结束后沸水浴灭酶， 离心收 集上清液， 上清液经真空浓缩装置浓缩至固型物的质量百分数为 5%-15， 用喷雾干燥后， 得到粉末状甜高粱籽蛋白 ACE 抑制肽。 2. 根据权利要求 1 所述的一种双酶分步水解制备甜高粱籽蛋白 ACE 抑制肽的方法， 其 特征在于 ： 所述步骤 1） 中甜高粱籽粉的质量百分数为 8。 3. 根据权利要求 1 所述的双酶分步水解制备甜高粱籽蛋白 ACE 抑制肽的方法， 其特征 在于 ： 所述步骤 2） 中将 7500U/g 淀粉酶加入悬浮液中 60酶解 3.5h， 酶解结束后， 将悬浮 液的 pH 调至 9.0， 搅拌 30min 后离心， 取上。

7、清液， 调其 pH 至 4.2， 静置 30min 后离心， 收集沉 淀， 将沉淀溶于蒸馏水中， 调 pH 至中性后经真空浓缩装置浓缩和喷雾干燥得到甜高粱籽蛋 白粉。 4. 根据权利要求 1 所述的双酶分步水解制备甜高粱籽蛋白 ACE 抑制肽的方法， 其特征 在于 ： 所述步骤 3） 中取 20g 甜高粱籽蛋白粉， 质量百分数为 2的溶液， 调 pH 至 7.5， 加入 3000U/g- 胰凝乳蛋白酶在 45下第一次酶解 25min， 第一次酶解结束后沸水浴灭酶得到 混合液， 将混合液的pH调至6.5， 加入3000U/g中性蛋白酶， 在55下第二次酶解50min， 第 二次酶解结束后沸水浴灭。

8、酶， 离心收集上清液， 上清液经真空浓缩装置浓缩至固型物质量 百分数为 10， 用喷雾干燥， 得到粉末状甜高粱籽蛋白 ACE 抑制肽。 权 利 要 求 书 CN 103194514 B 2 1/4 页 3 一种双酶分步水解制备甜高粱籽蛋白 ACE 抑制肽的方法及 其产品和应用 技术领域 0001 本发明涉及生物工程领域， 可用于功能性食品添加剂的开发， 具体涉及一种双酶 分步水解制备甜高粱籽蛋白 ACE 抑制肽的方法及其产品和应用。 背景技术 0002 甜高粱是高粱的一个变种， 它起源于非洲， 具有抗旱、 耐涝、 耐盐碱、 耐瘠薄等特 性， 因此在我国各地都有种植。 中国甜高粱分布较广泛， 主。

9、要分布在西北、 华北、 东北、 东南、 华东和华中地区， 从云南到黑龙江， 从上海到新疆都有栽培。甜高粱秸秆含有大量糖类物 质， 主要用于制备生物能源酒精， 该生产过程中的副产物甜高粱穗没有得到有效利用 （专 利 “用甜高粱秸杆制取乙醇的方法， 公开号 CN101024848A” 和 “一种用甜高粱秸杆制备乙醇 的方法， 公开号 CN101343647A” ） 。甜高粱穗中的籽粒含有较高的蛋白质， 蛋白质含量约为 13%（w/w） ， 必需氨基酸在总氨基酸含量中约占 41%（w/w） ， 蛋白营养价值较高， 另外， 甜高 粱籽蛋白中脯氨酸、 芳香族氨基酸和疏水性氨基酸含量高， 分别占到总氨基酸。

10、约 4.4（w/ w） 、 9.0（w/w） 和 39.2（w/w） 左右， 根据 ACE 抑制肽的构效关系， 这些氨基酸在 ACE 抑 制肽活性方面起到重要作用。由此可知， 甜高粱籽蛋白能被用于生产高活性 ACE 抑制肽。 0003 ACE 是血管紧张素转化酶， ACE 抑制肽是一种生物活性肽， 能够调节高血压病人的 血压， 且无毒副作用， 是近年来天然药物研究领域的热点之一， 现已有大量的食源 ACE 抑制 肽被发现， 如 ： 草鱼蛋白ACE抑制肽 （Chen J, Wang Y, Zhong Q, et al. Purification and characterization of a。

11、 novel angiotensin-I converting enzyme (ACE) inhibitory peptide derived from enzymatic hydrolysate of grass carp proteinJ. Peptides, 2012, 33(1): 52-58.） 、 鱿鱼明胶 ACE 抑制肽 （Alemn A, Gimnez B, Prez-Santin E, et al. Contribution of Leu and Hyp residues to antioxidant and ACE-inhibitory activities of pept。

12、ide sequences isolated from squid gelatin hydrolysateJ. Food Chemistry, 2011, 125(2): 334-341.） 和乳清蛋白 ACE 抑制肽 （Pan D, Cao J, Guo H, et al. Studies on purification and the molecular mechanism of a novel ACE inhibitory peptide from whey protein hydrolysateJ. Food Chemistry, 2012, 130(1): 121-126.） 等。而。

13、利用甜高粱籽蛋白制备 ACE 抑制肽的鲜见报道， 特别是利用双酶 分步水解制备甜高粱籽蛋白 ACE 抑制肽的研究未见报道。 发明内容 0004 发明目的 ： 本发明的目的是提供一种双酶分步水解制备甜高粱籽蛋白 ACE 抑制肽 的方法， 本发明能够克服单酶水解位点不足， 混合酶水解相互干扰以及 ACE 抑制肽不能有 效释放等缺点， 而该方法国内外尚无报道。 0005 技术方案 ： 为了实现上述目的， 本发明的一种双酶分步水解制备甜高粱籽蛋白 ACE 抑制肽的方法， 其特征在于包括以下步骤 ： 说 明 书 CN 103194514 B 3 2/4 页 4 0006 1） 将甜高粱籽进行粉碎， 然后。

14、用蒸馏水配制成甜高粱籽粉的质量百分数为 5 10的悬浮液 ； 0007 2） 将 5000 10000U/g 淀粉酶加入悬浮液中 50 70酶解 3h 4h， 酶解结束 后， 将悬浮液的 pH 调至 8.0 9.5， 搅拌 30min 后离心， 取上清液， 调其 pH 至 4.0 4.5， 静 置30min后离心， 收集沉淀， 将沉淀溶于蒸馏水中， 调pH至中性后经真空浓缩装置浓缩和喷 雾干燥得到甜高粱籽蛋白粉 ； 0008 3） 将甜高粱籽蛋白粉配成质量百分数为 1 4的溶液， 调 pH 至 7.0 8.0， 加 入 2000 4000U/g- 胰凝乳蛋白酶， 在 40 50下第一次酶解 2。

15、0 30min， 第一次酶 解结束后沸水浴灭酶得到混合液， 将混合液的 pH 调至 6.0 7.0， 加入 2000 4000U/g 中 性蛋白酶， 在5060下第二次酶解4060min， 第二次酶解结束后沸水浴灭酶， 离心收 集上清液， 上清液经真空浓缩装置浓缩至固型物的质量百分数为 5%-15， 用喷雾干燥后， 得到粉末状甜高粱籽蛋白 ACE 抑制肽。 0009 所述步骤 1） 中甜高粱籽粉的质量百分数为 8。 0010 所述步骤 2） 中将 7500U/g 淀粉酶加入悬浮液中 60酶解 3.5h， 酶解结束后， 将悬 浮液的 pH 调至 9.0， 搅拌 30min 后离心， 取上清液， 。

16、调其 pH 至 4.2， 静置 30min 后离心， 收集 沉淀， 将沉淀溶于蒸馏水中， 调 pH 至中性后经真空浓缩装置浓缩和喷雾干燥得到甜高粱籽 蛋白粉。 0011 所述步骤 3） 中取 20g 甜高粱籽蛋白粉， 质量百分数为 2的溶液， 调 pH 至 7.5， 加入 3000U/g- 胰凝乳蛋白酶在 45下第一次酶解 25min， 第一次酶解结束后沸水浴灭 酶得到混合液， 将混合液的 pH 调至 6.5， 加入 3000U/g 中性蛋白酶， 在 55下第二次酶解 50min， 第二次酶解结束后沸水浴灭酶， 离心收集上清液， 上清液经真空浓缩装置浓缩至固 型物质量百分数为 10， 用喷雾干。

17、燥， 得到粉末状甜高粱籽蛋白 ACE 抑制肽。 0012 所述甜高粱籽蛋白 ACE 抑制肽的 IC50值为 0.261 0.552mg/mL。 0013 所述的双酶分步水解制备的甜高粱籽蛋白 ACE 抑制肽在抑制肽活性研究方面的 应用。 0014 采用乙酸乙酯萃取比色法测定甜高粱籽蛋白 ACE 抑制肽的抑制活性 （Muguerza B, Ramos M, Snchez E, et al. Antihypertensive activity of milk fermented by Enterococcus faecalis strains isolated from raw milk J. I。

18、nternational Dairy Journal, 2006, 16(1): 61 -69.） ， 具体方法如下 ： 0015 将10 L甜高粱籽蛋白ACE抑制肽溶液与10 L ACE溶液在37 下预热5 min， 加入 45 L 5 mmol/L HHL（马尿酰 - 组氨酰 - 亮氨酸） 溶液， 在 37 反应 30 min， 反应 结束后立即加入 85 L 1mol/L HCl 溶液终止反应 ； 在反应液中加入 1 mL 乙酸乙酯， 振荡 2 min 后， 4 000 r/min 离心 10 min， 取出 800 L 有机相溶液转入玻璃管中， 在 100 下 蒸发30 min， 蒸发。

19、后的残渣中加入800 L双蒸水， 混匀后在228 nm下测定吸光度， 每个样 品重复 3 次。另以双蒸水代替样品作为空白。按下式计算 ACE 抑制活性 ： 0016 I （A C） /（A B） 100% 0017 式中， I甜高粱籽蛋白 ACE 抑制肽的抑制率 ； A空白组的吸光度 ； B反应体系 中没有加入甜高粱籽蛋白ACE抑制肽时的吸光度 ； C反应体系中有甜高粱籽蛋白ACE抑制 肽和样品时的吸光度。 说 明 书 CN 103194514 B 4 3/4 页 5 0018 有益效果 ： 与现有技术相比， 本发明的优点是 ： 0019 1） 提高了甜高粱秸秆转化乙醇产业中副产物甜高粱穗的利。

20、用价值。 0020 2） 克服了单酶水解位点不足， 单酶水解得到的甜高粱籽蛋白 ACE 抑制肽抑制的 IC50值为1.0301.475mg/mL， 混合酶水解相互干扰的缺点， 混合酶水解得到的甜高粱籽蛋 白 ACE 抑制肽抑制的 IC50值为 0.770 0.993mg/mL， 而本方法大大提高了酶解产物甜高粱 籽蛋白 ACE 抑制肽抑制活性， 其 IC50值为 0.261 0.552mg/mL。 0021 3） 该方法操作简单， 产品性质稳定， 适宜规模化生产。 附图说明 0022 图 1 利用双酶分步水解技术制备甜高粱籽蛋白 ACE 抑制肽的工艺流程。 具体实施方式 0023 下面结合具体。

21、实施例对本发明作进一步阐述。 0024 本实验所用的试剂均购自美国 Sigma 公司。 0025 实施例 1 0026 将粉碎后的甜高粱籽粉配成 5（w/v） 悬浮液， 用淀粉酶在 50酶解 3h， 加酶量 为 5000U/g， 酶解结束后， 将悬浮液的 pH 调至 8.0， 搅拌 30min 后离心， 取上清液， 调其 pH 至 4.0， 静置 30min 后离心， 收集沉淀， 将沉淀溶于蒸馏水中， 调 pH 至中性后喷雾干燥， 即得到 甜高粱籽蛋白粉。 0027 取 20g 甜高粱籽蛋白粉配制成质量百分数为 1（w/v） 的溶液， 调 pH 至 7.0， 用 - 胰凝乳蛋白酶在 40酶解 。

22、20min， 加酶量为 2000U/g， 酶解结束后， 沸水浴灭酶， 将反应 混合液的 pH 调至 6.0， 用中性蛋白酶在 50酶解 40min， 加酶量为 2000U/g， 酶解结束后沸 水浴灭酶， 离心收集上清液， 上清液用真空浓缩装置浓缩至固型物含量 10（w/v） 左右， 用 喷雾干燥设备进行干燥， 得到粉状甜高粱籽蛋白 ACE 抑制肽， 其 IC50值为 0.552mg/mL。 0028 实施例 2 0029 将粉碎后的甜高粱籽粉配成 8（w/v） 悬浮液， 用淀粉酶在 60酶解 3.5h， 加酶 量为 7500U/g， 酶解结束后， 将悬浮液的 pH 调至 9.0， 搅拌 30m。

23、in 后离心， 取上清液， 调其 pH 至 4.2， 静置 30min 后离心， 收集沉淀， 将沉淀溶于蒸馏水中， 调 pH 至中性后喷雾干燥。 0030 取 20g 甜高粱籽蛋白粉配制成质量百分数为 2（w/v） 的溶液， 调 pH 至 7.5， 用 - 胰凝乳蛋白酶在 45酶解 25min， 加酶量为 3000U/g， 酶解结束后， 沸水浴灭酶， 将反应 混合液的 pH 调至 6.5， 用中性蛋白酶在 55酶解 50min， 加酶量为 3000U/g， 酶解结束后沸 水浴灭酶， 离心收集上清液， 上清液用真空浓缩装置浓缩至固型物含量 10（w/v） 左右， 用 喷雾干燥设备进行干燥， 得到。

24、粉状甜高粱籽蛋白 ACE 抑制肽， 其 IC50值为 0.261mg/mL。 0031 实施例 3 0032 将粉碎后的甜高粱籽粉配成 10（w/v） 悬浮液， 用淀粉酶在 70酶解 4h， 加酶量 为 10000U/g， 酶解结束后， 将悬浮液的 pH 调至 9.5， 搅拌 30min 后离心， 取上清液， 调其 pH 至 4.5， 静置 30min 后离心， 收集沉淀， 将沉淀溶于蒸馏水中， 调 pH 至中性后喷雾干燥。 0033 取20g甜高粱籽蛋白粉配制成高粱籽蛋白粉质量百分数为4 （w/v） 的溶液， 调pH 至 8.0， 用 - 胰凝乳蛋白酶在 50酶解 30min， 加酶量为 4000U/g， 酶解结束后， 沸水浴灭 说 明 书 CN 103194514 B 5 4/4 页 6 酶， 将反应混合液的 pH 调至 7.0， 用中性蛋白酶在 60酶解 60min， 加酶量为 4000U/g， 酶解 结束后沸水浴灭酶， 离心收集上清液， 上清液用真空浓缩装置浓缩至固型物含量 10 （w/v） 左右， 用喷雾干燥设备进行干燥， 得到粉状甜高粱籽蛋白 ACE 抑制肽， 其 IC50值为 0.359mg/ mL。 说 明 书 CN 103194514 B 6 1/1 页 7 图 1 说 明 书 附 图 CN 103194514 B 7 。