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1、(10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201210379779.3 (22)申请日 2012.09.26 CGMCC No.6529 2012.09.05 C12N 1/20(2006.01) C12R 1/425(2006.01) (73)专利权人 中国人民解放军总医院 地址 100853 北京市海淀区复兴路 28 号 (72)发明人 刘长庭 常德 王雅娟 方向群 李天志 王俊峰 郭英华 苏龙翔 陈振鸿 徐国纲 CN 101392227 A,2009.03.25, 谢琼等.空间环境对13株微生物生物学特性 的影响 .中华医院感染学杂志 .2004, 第 14 卷 ( 第 1。
2、1 期 ), (54) 发明名称 一株太空环境下的褪色沙雷菌 LCT-SM262 菌 株 (57) 摘要 本发明涉及一株太空环境下的褪色沙雷菌 LCT-SM262 菌株及其生物学特性、 基因组 DNA 序 列、 转录组和差异蛋白组学， 特别是同地面褪色沙 雷菌比较分析鉴定出的功能序列和分子， 本发明 可获得全面、 准确的太空环境褪色沙雷菌菌株突 变的基因、 差异表达基因和蛋白质分子， 有助于研 究太空环境对微生物的作用和机制， 保障太空环 境安全 ； 有助于发现新的毒力和耐药靶点， 为临 床感染性疾病提供新的治疗靶点 ； 其代谢产物灵 菌红素具有抗肿瘤、 免疫抑制作用， 具有潜在的应 用前景。。
3、 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 孙彦珂 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书1页 说明书8页 附图5页 (10)授权公告号 CN 103173374 B (45)授权公告日 2015.03.04 CN 103173374 B 1/1 页 2 1.一株太空环境下的褪色沙雷菌 （Serratia marcescens） LCT-SM262菌株， 其保藏号 为 ： CGMCC NO： 6529， 其特征在于 ： 革兰氏染色阴性， 形态呈杆状， 单个， 无芽孢 ； 同地面株相 比， 抗生素的敏感性无明显变化， 无生长速度的差异 ；。
4、 同地面株均无溶血反应 ； Biolog反应 板生化特征结果显示与地面株相比较可以利用 D-棉籽糖， 不能利用 -D-葡萄糖。 权 利 要 求 书 CN 103173374 B 2 1/8 页 3 一株太空环境下的褪色沙雷菌 LCT-SM262 菌株 技术领域 0001 本发明属于微生物及生物技术领域， 涉及一种新的微生物菌株以及其生物学特 性、 基因组 DNA 序列、 转录组和差异蛋白组学， 利用生物信息学技术获得其比较基因组学信 息、 转录组测序分析的差异表达基因以及差异蛋白组学鉴定的蛋白质分子。 背景技术 0002 随着我国神舟飞船和空间站等庞大航天计划的实施， 载人航天的医学保障需求日。
5、 益突出， 空间医学的研究日益重要。微生物在自然界普遍存在， 航天活动也不可避免， 人体 及太空部件均会携带微生物至太空。 既往在空间环境对微生物影响的研究中发现外太空环 境下， 微生物的生长曲线迟滞期将缩短、 生长与繁殖速度将增加、 并具有增加次级代谢产物 产量的潜力。更为重要的是， 病原微生物对药物抗性、 毒力及其致病性也可能增强。研究发 现在模拟微重力作用下， 大肠杆菌无论是在对数生长期还是平稳生长期， 其耐高渗能力及 耐酸能力都显著增强。 在模拟微重力条件下培养的鼠伤寒沙门氏菌对小鼠感染的毒力会增 强。美国航天局一些研究显示肺炎链球菌等机会致病菌在模拟微重力条件下毒力增强。因 此迫切需。
6、要研究太空环境对微生物尤其是条件致病菌的作用及其机制。 0003 褪色沙雷菌是一种兼性厌氧的革兰氏阴性杆菌， 广泛存在于自然界， 是水和土壤 中的常居菌群。 褪色沙雷菌也是临床常见的条件致病菌， 近几年在临床的检出率增高， 而且 因为广谱抗生素的广泛使用， 多重耐药、 泛耐药甚至全耐药的菌株显著增多， 临床抗感染治 疗手段已十分有限。既往针对该菌生物学特性、 致病性等研究均局限于地面。对空间环境 下褪色沙雷菌的研究尚未见报道。 发明内容 0004 本发明的目的是提供一种太空环境下的褪色沙雷菌 LCT-SM262 菌株， 通过表型研 究揭示其生物学特性及致病性变化， 以基因组学法明确空间环境对细。
7、菌遗传性状的作用， 结合转录组学和蛋白组学， 研究细菌对空间环境适应性变化的机制。 0005 本发明提供的菌株 LCT-SM262， 其保藏号为 CGMCC NO.6529。 0006 所述的一株褪色沙雷菌， 革兰氏染色阴性， 形态呈杆状、 单个、 无芽孢 ； 同地面株相 比， 抗生素的敏感性无明显变化 ； 无生长速度的差异 ； 同地面株均无溶血反应 ； Biolog 反应 板生化特征结果显示与地面株比较 LCT-SM262 可以利用 D- 棉子糖， 不能利用 -D- 葡萄 糖。 0007 所述的 LCT-SM262 菌株， 通过全基因组测序方法获得太空环境下的该菌株的突变 基因包括 ： 00。
8、08 (1)、 质粒差异分析显示 LCT-SM262 比对上粪肠球菌 RE25plasmidpRE25 上的二 个片段 ： 1996-3019bp 和 46311-48346bp。说明这段序列在菌株屎肠球菌 LCT-EF301( 与 LCT-SM262 和同属于上天的菌株 ) 上也存在， 则说明 ： LCT-SM262 与屎肠球菌发生基因交流 获得了这段序列。这段序列为四环素耐药基因上的转座子。 说 明 书 CN 103173374 B 3 2/8 页 4 0009 (2)、 耐药基因分析提示 LCT-SM262 缺失 tet41 基因， 该耐药基因编码蛋白的功能 为四环素的外排泵。 0010。
9、 (3)、 毒力基因分析结果显示 LCT-SM262 发生了毒力基因 flil 和 flgl 的缺失。 flil 是鞭毛特异性 ATP 合成酶， flgl 是鞭毛 P- 环蛋白前体。鞭毛同细菌的运动和粘附能 力有关， 表明该菌对宿主的粘附功能下降。 0011 (4)、 SNP 差异分析显示杂合 SNP 位点有 58 个， 其中有意义的有 13 个。 0012 所述的LCT-SM262菌株， 利用转录组测序鉴定获得该菌株的差异表达基因有20个 发生上调， 5 个发生下调。 0013 所述的 LCT-SM262 菌株， 采用差异蛋白组学方法鉴定得到该菌株的差异表达蛋白 分子， 其中上调的有 32 。
10、个， 下调的 35 个， 其中变化超过两倍以上的有 12 个上调， 15 个下 调的蛋白质分子。GO 功能富集分析提示这些差异表达蛋白主要与氧化还原酶活性有关， Pathway 富集分析显示这些差异蛋白主要集中在淀粉和蔗糖的代谢通路。 0014 所述的 LCT-SM262 菌株， 存在灵菌红素合成基因 (pigB-pigP)， 其编码的代谢产物 灵菌红素是一类含甲氧基吡咯骨架结构的天然色素， 具有免疫抑制、 抗细菌、 抗真菌和抗疟 疾等多种生物活性。 此外有研究发现灵菌红素具有很强的抗肿瘤及免疫抑制活性具有抗肿 瘤、 免疫抑制作用。 附图说明 0015 图 1 为褪色沙雷菌 LCT-SM262。
11、 菌株革兰氏染色 0016 图 2 为褪色沙雷菌 LCT-SM262 菌株 Biolog 生化特征 0017 图 3 为褪色沙雷菌 LCT-SM262 菌株生长曲线 0018 图 4 为褪色沙雷菌 LCT-SM262 质粒鉴定图 0019 图 5 为褪色沙雷菌 LCT-SM262 的 GC 含量与 Depth 关联分析图 0020 图 6 为褪色沙雷菌 LCT-SM262 的 15-mer 分析图 0021 图 7 为褪色沙雷菌 LCT-SM262 的转录组基因覆盖度 0022 图 8 为褪色沙雷菌 LCT-SM262 的转录组差异表达基因 0023 图 9 为褪色沙雷菌 LCT-SM262 。
12、的蛋白质组差异表达蛋白 具体实施方式 0024 下述实施实例中所用的实验方法， 如无特殊说明， 均为常规方法。 0025 下述实施实例中所用的材料、 试剂， 如无特殊说明， 均可从商业途径获得。 0026 本项目研究人员采用自制的样本管搭载细菌， 依据 ： HYK-GF15航天员系统载人 运输飞船/目标飞行器舱载产品环境试验技术条件 ， 该样本管通过了冲击、 快速减压、 震动 实验。褪色沙雷菌接种至样本管中， 培养基为 LB 琼脂半固体培养基。然后封装入代号为 20111001 的样品包 ( 材料为蓝色美塔斯阻燃布料 )。经过神舟八号搭载， 获得太空环境下 的褪色沙雷菌 LCT-SM262 菌。
13、株。 0027 具体实施实例一、 LCT-SM262 的表型特征分析 ： 0028 1. 形态特征 ： 取 50ul 样品离心， 弃上清， 加入无菌水 50ul， 吸取 20ul 于载玻片 上进行固定 ； 初染， 吸取革兰氏染色 I( 结晶紫 )2 滴于载玻片样品上进行初染 1min， 然后 说 明 书 CN 103173374 B 4 3/8 页 5 用自来水冲洗染液 ； 媒染， 吸取革兰氏染色II(碘液)2滴覆盖涂面染约1min， 然后用自来 水冲洗染液， 用吸水纸吸取涂面上的水分 ； 脱色， 吸取革兰氏染色 III( 酒精 )2 滴滴在涂 面上约 30s， 用水冲洗载玻片， 用吸水纸吸取。
14、涂面上的水分 ； 复染， 吸取革兰氏染色 IV( 番 红 )2 滴滴在涂面上约 1min， 用水冲洗载玻片， 用吸水纸吸取涂面上的水分 ； 观察， 先用显 微镜低倍镜找到目标视野， 然后再用油镜 (100) 进行观察， 判定并记录结果、 拍照， 见图 1。 0029 2. 菌株的 16s rDNA 鉴定 ： 16S rDNA 是 16S rRNA 序列的基因， 长约 1.5kb。将已 分纯的单菌直接经菌液 PCR 扩增 16S rDNA， 部分通过菌液 PCR 较难扩增的单菌经扩大培养 后提取基因组后扩增， 扩增所用引物序列如下 ： 0030 SgF ： AGAGTTTGATCATGGCTCA。
15、G 0031 SgR ： TAGGGTTACCTTGTTACGACTT 0032 16S rDNA PCR 产物用 96 孔 millpore 纯化系统纯化后准确定量， 经 ABl3730 xl 全 自动序列分析仪测序， 测序结果使用Sequence scanner、 Seqman等序列分析软件， 将两向测 序结果去掉首尾不可信序列后拼接， 余下的约 1350bp( 双向测序 ) 即用于同源性分析。所 得 16S rDNA 序列在 Eztaxon server2.1 数据库中进行比对， 确定菌株大致的分类地位。所 有单菌 16S 序列全部导入 seqman， 输出 single file(fa。
16、sta) 后， 经 Mega5.0 软件 clusterW 多重比对， 输出 meg 文件重新导入构建 Neighbor-Joining tree。其中， phylogeny test method 为 bootstrap 参数 设置为 1000。16s rDNA 鉴定结果为该菌株属于褪色沙雷菌。 0033 3. 耐药性检测 ： 经过 16s rDNA 测序分析后， 取出这些单菌的斜面， 用灭菌的竹签 从斜面上蘸取适量菌种于 1.5ml 离心管中， 混匀， 调菌浓度约 107 108。吸取备好的菌悬 液100ul进行涂布， 尽可能地涂布均匀， 每株单菌涂6个平板， 每涂完一株菌， 就进行下一步。
17、 (粘贴药敏片)。 粘贴药敏片， 选择的抗生素为青霉素G、 氨苄青霉素、 头孢唑林、 复达欣(头 孢他啶 )( 头孢噻甲羧肟 )、 菌必治 ( 头孢三嗪 )、 阿奇霉素 ( 泰力特 )、 环丙沙星 ( 奔克 ) (悉复欢)(丙氟哌酸)、 洁霉素(林可霉素)、 万古霉素、 复方新诺明、 氯霉素、 舒普深(先锋 必 / 舒巴坦 )、 丁胺卡那 ( 阿米卡星 )、 链霉素、 美满霉素 ( 二甲胺四环素 )( 米诺环素 )、 美 罗培南、 哌拉西林 / 他唑巴坦 ( 特治星 )。将平板放置在 37下培养 18 24h 培养 24h 后 观察抑菌圈大小。结果示 LCT-SM262 较地面株耐药性无明显变。
18、化。 0034 4. 溶血试验 ： 采用点种法， 将太空株和地面株点种于同一血琼脂培养基上， 培养 温度 37， 培养 24-48h 后观察结果。结果显示其无溶血反应。 0035 5. 生化代谢 (Biolog) 实验 ： 菌悬液制备， 取出菌株的斜面， 用灭菌竹签蘸取菌种 接种在LB液体培养基中(4ml体系)， 培养24h。 然后取2ml菌液6000r/s离心5min， 弃上清 培养基， 留下离心的菌体， 然后用灭菌的生理盐水洗涤菌体， 6000r/s 离心 5min， 再次弃去 上清， 再用 Biolog 接种液进行悬浮菌体， 最后再转至 15ml 的接种液中。调至浓度约 107 108；。
19、 接种， 将以上菌悬液倒至接种皿中， 震荡均匀， 用 12 道 ( 或 8 道 ) 排枪进行加样， 每个 Biolog 板孔加样 100ul， 共 96 孔， 加完样后， 盖上 Biolog 板盖， 放置在 37下培养， 24h 和 48h 进行观察， 并记录结果， 结果见表 1， 图 2。 0036 表 1 褪色沙雷菌 LCT-SM262Biolog 反应板生化特征 0037 LCT-S M262 LCT-SM213 说 明 书 CN 103173374 B 5 4/8 页 6 0038 糊精 +( 棕 ) +( 紫 ) D- 麦芽糖 +( 棕 ) +( 紫 ) PH 6 +( 黄 ) +(。
20、 紫 ) D- 棉子糖 + - -D- 乳糖 +( 棕 ) +( 紫 ) N- 乙酰神经氨酸 + +/- 1 NaCl +( 黄 ) +( 紫 ) -D- 葡萄糖 - + D- 半乳糖 +( 棕 ) +( 紫 ) 肌苷 +( 棕 ) +( 紫 ) 1乳酸钠 +( 黄 ) +( 紫 ) D- 甘露醇 + +/- 0039 6. 生长曲线测定 ： 菌株活化后接种至 100 孔蜂窝板中， 在 Bioscreen 中进行生长 曲线的测定， 测定 24h， 读取数据。将所得到的 OD 值进行平均值的计算， 然后绘制曲线， 见 图 3。LCT-SM262 无生长速度的差异。具体实施实例二、 LCT-SM2。
21、62 的基因组及比较基因组 学 ： 0040 培养褪色沙雷菌并提取基因组 DNA， 首先采用超声法将检测合格的 DNA 样品随 机打断， 得到一系列 DNA 片段， 经 T4DNA 聚合酶、 Klenow DNA 聚合酶和 T4 多聚核苷酸 激酶等处理后， 回收目的片段， 得到测序文库， 利用 Illumina 的 Genome Analyzer II 测序 ； 测序结束后得到的 reads， 经过滤处理后进行组装和分析 ； 采用 Glimmer3.0 软件 注释基因并分析 SNP、 Indel、 基因重排和结构变异等。LCT-SM262 的基因测序质控见图 5、 图 6。质粒差异分析见图 4。
22、。耐药分析提示 LCT-SM262 缺失 tet41 基因， 该耐药基因 编码蛋白的功能为四环素的外排泵。毒力基因分析结果见表 2， SNP 差异分析显示杂合 SNP 位点有 58 个， 其中有意义的有 13 个， 见表 3， Indel 分析未发现明显变化。该菌株 耐药、 毒力基因的变化为临床感染性疾病提供了潜在的治疗靶点。此外太空环境下的 LCT-SM262 存灵菌红素合成基因 (pigB -pigP)， 其编码的代谢产物灵菌红素是一类含 甲氧基吡咯骨架结构的天然色素， 具有免疫抑制、 抗细菌、 抗真菌和抗疟疾等多种生物 活性。有研究发现灵菌红素具有很强的抗肿瘤及免疫抑制活性。因此该菌在生。
23、物工程 方面具有潜在的应用前景。 0041 表 2 褪色沙雷菌 LCT-SM262 毒力基因分析结果 0042 毒力基因编号 名称 定义 LCT-SM213( 地面株 ) LCT-S M262 VFG2331 flil 鞭毛特异性 ATP 合成酶 UUSGL000753_90.25 VFG2344 flgl 鞭毛 P- 环蛋白前体 UUSGL000739_90.40 - 0043 表 3 褪色沙雷菌 LCT-SM262 的 SNP 位点对应基因功能注释 0044 说 明 书 CN 103173374 B 6 5/8 页 7 基因 ID 基因长度 (aa) 注释库 ID UUSGL000001 。
24、171 gi|290508598|ref|ZP_06547969.1| UUSGL000004 972 gi|333928609|ref|YP_004502188.1| UUSGL000125 840 gi|157371693|ref|YP_001479682.1| UUSGL000221 2022 gi|157371606|ref|YP_001479595.1| UUSGL000785 183 gi|270262353|ref|ZP_06190625.1| UUSGL003376 540 gi|157368519|ref|YP_001476508.1| UUSGL003778 2994 gi。
25、|157368518|ref|YP_001476507.1| UUSGL003925 1203 gi|270265363|ref|ZP_06193624.1| UUSGL003980 711 gi|293394701|ref|ZP_06638993.1| UUSGL004715 2190 gi|157369676|ref|YP_001477665.1| UUSGL004778 258 gi|270264573|ref|ZP_06192839.1| UUSGL004785 1155 gi|157372208|ref|YP_001480197.1| 0045 具体实施实例三、 LCT-SM262 。
26、菌株的转录组测序分析 ： 0046 提取 LCT-SM262 菌株总 RNA 后， 用试剂盒去除 rRNA 后。加入 fragmentation buffer将mRNA打断成短片段， 以mRNA为模板， 用六碱基随机引物(random hexamers)合成 第一条 cDNA 链， 然后加入缓冲液、 dNTPs、 RNase H 和 DNA polymerase I 合成第二条 cDNA 链， 在经过 QiaQuick PCR 试剂盒纯化并加 EB 缓冲液洗脱之后做末端修复、 加 polyA 并连接 说 明 书 CN 103173374 B 7 6/8 页 8 测序接头， 然后用琼脂糖凝胶电泳。
27、进行片段大小选择， 最后进行 PCR 扩增， 建好的测序文库 用 Illumina HiSeq 2000 进行测序。将原始序列数据去除杂质数据后统计 rRNA 统计、 评价 Reads 在基因组上的分布基因覆盖度、 统计基因表达量差异、 分析差异表达基因、 筛选差异 基因表达模式聚类分析、 GO 功能分析、 KEGG Pathway 分析和预测新转录本分析等。分布基 因覆盖度见图 7。差异表达基因见图 8， 表 4。 0047 表 4 褪色沙雷菌 LCT-SM262 的差异表达基因 (FDR 0.001 和 |log2Ratio| 1) 0048 0049 说 明 书 CN 103173374。
28、 B 8 7/8 页 9 0050 具体实施实例四、 LCT-SM262 菌株差异蛋白组学分析 ： 0051 从 LCT-SM262 菌株样品中提取蛋白 ； 对提取后的蛋白样品进行还原烷基化处理， 打开二硫键以便后续充分酶解蛋白 ； 用 GE 公司的 2D quant kit 法进行蛋白质的浓度测 定 ； 等体积进行 SDS( 十二烷基磺酸钠 ) 电泳 ； 酶解蛋白 ； 用 iTRAQ 试剂标记肽段 ； 将标记后 的肽段进行等量混合 ； 对混合后的肽段使用强阳离子交换色谱 (Strong Cation Exchange Choematography， SCX) 进行预分离 ； 进行液相串联质谱。
29、 (liquid chromatography coUpled with tandem mass spectrometry， LC-MS/MS) 分析。对质谱下机的原始文件， 进行峰识别， 得到峰列表 ； 建立参考数据库， 进行肽段及蛋白质的鉴定 ； 最后比较各蛋白在各样品之间 的相对含量的关系， 从而获得一些感兴趣的重要蛋白。 对这些蛋白进行功能分析。 最后比较 各蛋白在各样品之间的相对含量的关系， 当满足蛋白丰度差异倍数 1.2 倍以上且统计检验 值 P-value 小于 0.05 时， 从而获得差异表达的蛋白。对这些差异表达的基因进行 GO 功能 富集分析和 pathway 富集分析。差。
30、异表达蛋白分子见图 9， 其中差异超过 2 倍以上的见表 5。GO 功能富集分析提示这些差异表达蛋白主要与氧化还原酶活性有关， Pathway 富集分析 显示这些差异蛋白主要集中在淀粉和蔗糖的代谢通路。 0052 表 5 褪色沙雷菌 LCT-SM262 的差异蛋白质分子 ( 蛋白丰度差异倍数超过 2 倍以上 时 ； 经统计检验其 p-value 值小于 0.05 ； 三次重复中至少两次重复中达到上述要求 ) 0053 基因 ID 基因长度 (aa) 上调 / 下调 注释库 ID UUSGL003172 1665 + gi|270265101|ref|ZP_06193364.1| 说 明 书 C。
31、N 103173374 B 9 8/8 页 10 UUSGL001692 1011 + gi|293396549|ref|ZP_06640825.1| UUSGL004211 2664 + gi|333929041|ref|YP_004502620.1| UUSGL002992 954 + gi|270263893|ref|ZP_06192161.1| UUSGL003744 1509 + gi|333929717|ref|YP_004503296.1| UUSGL004492 984 + gi|157372683|ref|YP_001480672.1| UUSGL004305 1161 + 。
32、gi|333929214|ref|YP_004502793.1| UUSGL000686 483 + gi|293395545|ref|ZP_06639828.1| UUSGL000940 657 + gi|270262197|ref|ZP_06190469.1| UUSGL000630 978 + gi|270262470|ref|ZP_06190741.1| UUSGL004066 645 + gi|33331085|gb|AAQ10778.1| UUSGL000483 888 + gi|182679456|ref|YP_001833602.1| UUSGL004116 2970 - gi。
33、|270264927|ref|ZP_06193191.1| UUSGL004210 1887 - gi|333929040|ref|YP_004502619.1| UUSGL003504 1596 - gi|157368387|ref|YP_001476376.1| UUSGL000995 1638 - gi|157370g41|ref|YP_001478930.1| UUSGL003168 2439 - gi|270265113|ref|ZP_06193376.1| UUSGL002510 2583 - gi|333926049|ref|YP_004499628.1| UUSGL002488。
34、 2037 - gi|333926070|ref|YP_004499649.1| UUSGL003211 2118 - gi|333925319|ref|YP_004498898.1| UUSGL000620 2067 - gi|157371311|ref|YP_001479300.1| UUSGL003778 2994 - gi|365969410|ref|YP_004950971.1| UUSGL001513 1020 - gi|270261600|ref|ZP_06189873.1| UUSGL001003 537 - gi|157370928|ref|YP_001478917.1| U。
35、USGL002204 486 - gi|125540403|gb|EAY86798.1| UUSGL002664 1764 - gi|270263537|ref|ZP_06191806.1| UUSGL002503 897 - gi|157369457|ref|YP_001477446.1| 0054 关于保藏的 LCT-SM262 菌株的说明 0055 A. 菌种的保藏单位名称和地址 0056 名称 ： 中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 0057 地址 ： 北京市朝阳区北辰西路 1 号院 3 号中国科学院微生物研究所 0058 B. 交机构保藏的日期 0059 2012 年 9 月。
36、 5 日 0060 C. 保藏机构给予的保藏号 0061 CGMCC No.6529 0062 D. 分类命名 0063 粘质沙雷氏菌 Serratia marcescens 说 明 书 CN 103173374 B 10 1/5 页 11 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 103173374 B 11 2/5 页 12 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 103173374 B 12 3/5 页 13 图 5 图 6 说 明 书 附 图 CN 103173374 B 13 4/5 页 14 图 7 图 8 说 明 书 附 图 CN 103173374 B 14 5/5 页 15 图 9 说 明 书 附 图 CN 103173374 B 15 。