发明领域
本发明属于体外诊断学领域。具体而言，在此领域内，其关注可能存在 于至少一份流体样品中的至少第一和第二靶核酸的扩增。本发明进一步提供 了用于实施所述扩增的试剂盒和分析系统。
发明背景
在分子诊断学领域中，自众多来源扩增核酸具有相当大的意义。核酸扩 增和检测的诊断性应用的例子是对病毒诸如人乳头状瘤病毒(HPV)、西尼罗 病毒(WNV)的检测，或针对人免疫缺陷病毒(HIV)、乙肝病毒(HBV)和/或丙 肝病毒(HCV)的存在的献血常规筛选。此外，所述扩增技术适用于细菌性靶 物诸如分枝杆菌或沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)和淋病奈瑟氏球菌 (Neisseria gonorrhoeae)，或对肿瘤标志物的分析。
最突出且广泛使用的扩增技术是聚合酶链式反应(PCR)。其它扩增反应 包含连接酶链式反应、聚合酶连接酶链式反应、缺口-LCR、修复链式反应、 3SR、NASBA、链置换扩增(SDA)、转录介导的扩增(TMA)、和Qβ扩增，等 等。
用于基于PCR的分析的自动化系统经常利用PCR过程期间在同一反应容 器中产物扩增的实时检测。这类方法的关键是使用携带报告物基团或标记物 的经修饰的寡核苷酸。
已经显示了在同一容器中对超过一种靶核酸的扩增和检测是有可能的。 此方法通常称作“多重”扩增，并且如果实施实时检测，那么需要不同标记 物来加以区分。
Rohayem等已经提出了一种多重RT-PCR测定法，用于RNA病毒诺如病毒 (Norovirus)和星状病毒(Astrovirus)以及DNA病毒腺病毒的基于琼脂糖凝胶的 检测(2004,Journal of Virological Methods118,49-59)。
提供了一种用于不同核酸的同时扩增和检测的改进方法。
发明描述
本发明提供了用于扩增可能存在于流体样品中的至少第一和第二靶核 酸的方法。本发明进一步提供了用于实施所述扩增的试剂盒和分析系统。
在第一个方面，本发明涉及一种用于同时扩增可能存在于流体样品中的 至少第一和第二靶核酸的方法，所述方法包括下列自动化步骤：
d.在至少两个反应容器中使来自所述样品的核酸与包含具有逆转录酶活 性的聚合酶的一种或多种扩增试剂接触，其中至少第一反应容器至少包 含所述第一靶核酸，而至少第二反应容器至少包含所述第二靶核酸，且 其中所述第二靶核酸不存在于所述第一反应容器中；
e.在所述反应容器中将所述纯化的核酸与所述一种或多种扩增试剂在一 定条件下一起温育一段时间，该条件和时间段适合于通过所述具有逆转 录酶活性的聚合酶发生RNA转录；
f.在所述反应容器中将所述纯化的核酸与所述一种或多种扩增试剂在一 定条件下一起温育一段时间，该条件和时间段足以发生指示所述第一和 第二靶核酸存在或缺乏的扩增反应，
其中步骤d.至f.中用于转录和扩增的条件对于所述至少第一和第二靶核酸是 相同的。
用于快速、简便且可靠地同时扩增和检测多种不同核酸的这类改良方法 特别但不仅对于具有高样品通量的临床实验室是高度有利的。
经常地，特别是在临床诊断学领域中，在预分析步骤中分离核酸是有利 的或甚至是必要的。
因此，在一个优选的实施方案中，本发明涉及一种用于分离及同时扩增 可能存在于至少一份流体样品中的至少第一和第二靶核酸的方法，所述方法 包括下列自动化步骤：
a.将固体支持材料和流体样品在一定条件下组合在一起达一段时间，该条 件和时间段足以允许包含所述靶核酸的核酸在所述固体支持材料上固 定化；
b.在分离站中将所述固体支持材料与存在于所述流体样品中的其它材料 分离；
c.在分离站中纯化所述核酸，其通过将所述流体样品与所述固体支持材料 分开，并将所述固体支持材料用清洗缓冲液清洗一次或多次来进行；
d.在至少两个反应容器中使纯化的核酸与包含具有逆转录酶活性的聚合 酶的一种或多种扩增试剂接触，其中至少第一反应容器至少包含所述第 一靶核酸，而至少第二反应容器至少包含所述第二靶核酸，且其中所述 第二靶核酸不存在于所述第一反应容器中；
e.在所述反应容器中将所述纯化的核酸与所述一种或多种扩增试剂在一 定条件下一起温育一段时间，该条件和时间段适合于通过所述具有逆转 录酶活性的聚合酶发生RNA转录；
f.在所述反应容器中将所述纯化的核酸与所述一种或多种扩增试剂在一 定条件下一起温育一段时间，该条件和时间段足以发生指示所述第一和 第二靶核酸存在或缺乏的扩增反应，
其中步骤d.至f.中用于转录和扩增的条件对于所述至少第一和第二靶核酸是 相同的。
包括上文提及的自动化步骤的方法展示出多种优点。
首先，将样品制备、RNA逆转录和靶核酸扩增以自动化方式组合显著降 低对手动干预的需要以及由此潜在的污染风险。
此外，在现有技术中的一项挑战是，在单个反应容器中实施的多重测定 法中的不同靶核酸数目受限于合适标记物的数目。例如在实时PCR测定法 中，荧光染料光谱的潜在重叠对于测定法性能(假阳性结果的风险、较低的 精确性，等等)具有很大的影响。因此，相应的荧光团必须经过仔细选择， 并且在光谱上良好地分开，从而确保诊断测试的期望性能。典型地，不同可 用荧光团的数目对应于PCR仪荧光通道的单数位数目。
相比之下，在依照本发明的方法中，在至少两个不同的反应容器中发生 至少第一和第二靶核酸的扩增，从而允许较高数目的不同靶核酸的同时扩 增，因为可以彼此独立地检出不同反应容器中的信号。如下的实施方案仍然 在本发明的范围内，其中在多个反应容器的一个或多个中实施多重反应，由 此成倍增加可以同时且在相同条件下扩增的靶物数目。
因此，本发明的一个优选的方面涉及上文所描述的方法，其中在同一反 应容器中扩增至少两种靶核酸。
在其它情况中，例如根据所讨论的样品和/或一种或多种靶核酸，可以优 选的是扩增在第一反应容器中的第一而非第二靶核酸，和在第二反应容器中 的仅第二而非第一靶核酸。
因此，本发明的又一个优选的实施方案是上文描述的方法，其中所述第 一靶核酸不存在于第二反应容器中。
特别地，如果怀疑流体样品含有来自不同生物体的靶核酸，或甚至不同 生物体本身，或者如果不清楚哪些不同核酸或生物体可能存在于所述样品 中，本发明的一个有利且如此优选的实施方案是上文描述的方法，其中所述 第一靶核酸和第二靶核酸来自不同生物体。
本发明的又一个优选的方面是上文描述的方法，其中所述第一和/或第二 靶核酸是非病毒核酸。
还有，本发明的一个优选的方面是上文所描述的方法，其中所述第一和 /或第二靶核酸是细菌核酸。
依照本发明的方法需要相当少的动手实践时间，并且测试的实施比现有 技术中使用的实时PCR方法简单得多。依照本发明的方法在例如临床病毒学 领域中提供一项主要的优点，因为其允许平行实验中数种病毒的平行扩增。 该方法特别可用于管理需要频繁的病毒监测的移植后患者。由此，依照本发 明的方法促进节省成本的诊断学，并且促成抗病毒剂的使用和病毒性并发症 以及住院的降低。这同样适用于临床微生物学领域。一般而言，效率会在更 快的周转时间和改善的测试灵活性中增加。因此，这导致为了做出诊断对患 者要求的测试数目的减少和潜在较短的住院期(例如如果可以较快地提供诊 断，那么需要抗微生物疗法的患者会较快地接受它，并且因此较早恢复)。 另外，患者显示较小的发病率，并且因此引起较少的支持疗法(例如败血症 诊断延迟相关的加强监护)相关成本。较快地提供阴性结果对于抗生素的开 药过量可以具有重要的含意。例如，如果通过依照本发明的方法获得的测试 结果能够比用标准实时PCR方法更快地排除病原体，那么就不会迫使临床医 生使用经验抗生素。或者，如果使用经验抗生素，那么可以缩短相应治疗的 持续时间。
就设计一种基于依照本发明的方法的特定测试而言，熟练技术人员会特 别但不仅仅受益于下列优点：
·软件复杂性的降低(导致编程错误的风险降低)
·将测定法开发努力聚焦于化学优化而非化学以及仪器控制参数
·可靠得多的系统，因为总是使用单一方法，并且可以最佳地设计硬件来 实施此方案
·给实施依照本发明的方法的熟练技术人员提供作为同一过程的部分平 行运行多种不同测定法的灵活性
·成本降低。
在本发明的意义中，核酸的“纯化”、“分离”或“提取”指如下的情况： 可以在诊断测定法中例如通过扩增分析核酸前，通常必须从含有不同组分的 复杂混合物的生物学样品中将它们纯化、分离或提取。对于第一步，经常使 用允许核酸富集的方法。为了释放细胞或病毒颗粒的内容物，可以将它们用 酶或化学药品处理以将细胞壁或病毒颗粒溶解、降解或变性。此过程通常称 为裂解。所得的含有这类裂解物质的溶液称为溶胞物。在裂解过程中经常遇 到的问题是降解感兴趣组分的其它酶，例如降解核酸的脱氧核糖核酸酶或核 糖核酸酶在裂解规程期间与感兴趣的组分接触。这些降解酶也可以存在于细 胞外部或者在裂解前可能在不同细胞区室中空间分开。当裂解发生时，感兴 趣的组分变得暴露于所述降解酶。在此过程期间释放的其它组分可以例如是 属于对细胞有毒性的脂多糖类家族的内毒素，并且可以对意图用在人或动物 疗法中的产品引起问题。
有多种手段来处理上文提及的问题。当意图释放核酸时，通常使用离液 剂诸如硫氰酸胍或阴离子、阳离子、两性离子或非离子型去污剂。使用快速 降解先前描述的酶或不期望的蛋白质的蛋白酶也是一种优点。然而，这可能 产生另一个问题，因为所述物质或酶可能在随后步骤中干扰试剂或组分。
在上文提及的这类裂解或样品制备过程中可以有利地使用的酶是如下 的酶，其切割蛋白质底物中的酰胺连接，并且分类为蛋白酶，或(互换地)肽 酶(参见Walsh,1979,Enzymatic Reaction Mechanisms.W.H.Freeman and Company,San Francisco，第3章)。现有技术中使用的蛋白酶包括碱性蛋白酶 (WO98/04730)或酸性蛋白酶(US5,386,024)。在现有技术中已经在核酸分离 中广泛用于样品制备的蛋白酶是来自白色念球菌(Tritirachium album)的蛋白 酶K(参见例如Sambrook J.等,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York,1989)，其在中 性pH左右是有活性的，并且属于本领域技术人员称为枯草杆菌蛋白酶的蛋白 酶家族。对于在上文提及的裂解或样品制备方法中使用特别有利的是酶 Esperase，即一种在高碱度和于高温两者都保留其活性的强力的蛋白酶(EP1 201753)。
在裂解步骤后的样品制备步骤中，进一步富集感兴趣的组分。如果感兴 趣的非蛋白质性组分是例如核酸，那么通常在将它们在基于探针的测定法中 使用前从复杂的裂解混合物提取它们。
有数种用于核酸纯化的方法：
-序列依赖性的或生物特异性的方法如例如：
·亲和层析
·与固定化的探针杂交
-不依赖于序列的或物理化学的方法如例如：
·用例如酚-氯仿进行的液体-液体萃取
·用例如纯乙醇进行的沉淀
·用滤纸进行的提取
·用微团形成剂如鲸蜡基三甲基溴化铵进行的提取
·结合固定化的嵌合染料，例如吖啶衍生物
·吸附至硅胶或硅藻土(diatomic earth)
·在离液序列高的(chaotropic)条件下吸附至磁性玻璃颗粒(MGP) 或有机硅烷颗粒。
对于纯化目的特别感兴趣的是将核酸吸附至玻璃表面，尽管其它表面也 是有可能的。近年来已经提出了许多通过利用核酸对玻璃表面的结合行为用 于将其从其天然环境中分离出来的规程。如果未修饰的核酸是靶物，那么优 选将核酸直接结合至具有硅土表面的材料，因为核酸不必进行修饰，而且甚 至可以结合天然核酸，等等。这些方法由多份文件详细地描述。例如，在 Vogelstein B.等,Proc.Natl.Acad.USA76(1979)615-9中，提出了一种用于将 来自琼脂糖凝胶的核酸在存在碘化钠的情况下结合到磨砂火石玻璃的规程。 在存在过氯酸钠的情况下在玻璃粉上自细菌纯化质粒DNA记载于Marko M. A.等,Anal.Biochem.121(1982)382-387。在DE-A3734442中，描述了在玻 璃纤维滤器上分离单链M13噬菌体DNA，其通过使用乙酸将噬菌体颗粒沉 淀，并用高氯酸盐裂解噬菌体颗粒来进行。清洗结合到玻璃纤维滤器的核酸， 然后用含有甲醇的Tris/EDTA缓冲液洗脱。一种用于从λ噬菌体纯化DNA的类 似规程记载于Jakobi R.等,Anal.Biochem.175(1988)196-201。该规程需要使 核酸在离液盐溶液中选择性结合玻璃表面以及将核酸与污染物诸如琼脂糖、 蛋白质或细胞残留物分开。为了将玻璃颗粒与污染物分开，可以将该颗粒离 心或者将流体抽过玻璃纤维滤器。然而，这是一个限制步骤，其阻止该规程 用于加工大量样品。在通过添加盐和乙醇进行沉淀后使用磁性颗粒来固定化 核酸是更有利的，并且记载于例如Alderton R.P.等,S.,Anal.Biochem.201 (1992)166-169和PCT GB91/00212中。在此规程中，将核酸与磁性颗粒一起 凝集。通过应用磁场并实施清洗步骤将凝集物与初始溶剂分开。在一个清洗 步骤后，将核酸溶解于Tris缓冲液中。然而，此规程具有的缺点在于沉淀对 于核酸不是选择性的。更确切地，也将多种固体和溶解的物质凝集。因此， 不可以使用此规程来除去可能存在的、特定酶促反应的大量的任何抑制剂。 磁性多孔玻璃也是市场上可获得的，其在多孔特殊玻璃基质中含有磁性颗 粒，并且用含有链霉亲合素的层覆盖。如果生物学材料例如蛋白质或核酸在 复杂的制备步骤中修饰，从而它们共价结合生物素，那么可以使用此产品来 分离它们。可磁化的特殊吸附剂证明为对于自动样品制备是非常有效且合适 的。出于此目的，使用亚铁磁性和铁磁性以及超顺磁性(superparamagnetic) 色素。最优选的磁性玻璃颗粒和使用它们的方法是那些记载于WO01/37291 中的。依照R.Boom等(J Clin Microbiol.28(1990),495-503)的方法特别可用于 本发明上下文中的核酸分离。
术语“固体支持材料”包含就核酸固定化而言的、上文提及的任何固体 材料，例如磁性玻璃颗粒、玻璃纤维、玻璃纤维滤器、滤纸等，尽管固体支 持材料并不限于这些材料。
因此，本发明的一个优选的方面是上文所描述的方法，其中所述固体支 持材料包含一种或多种选自下组的材料：硅土、金属、金属氧化物、塑料、 聚合物和核酸。在本发明的一个非常优选的实施方案中，所述固体支持材料 是磁性玻璃颗粒。
“固定化”在本发明的上下文中意指以可逆或不可逆的方式捕捉对象诸 如例如核酸。具体地，“在固体支持材料上固定化”意指出于将其与任何周 围介质分开的目的，使一种或多种对象与固体支持材料结合，并且可以例如 通过在后来的点时与固体支持材料分开来回收。在此上下文中，“固定化” 可以例如包括将核酸吸附至玻璃或固体材料的其它合适的表面，如上文所描 述的。此外，可以通过结合捕捉探针来特异性“固定化”核酸，其中核酸通 过碱基配对而结合附着于固体支持物的、基本上互补的核酸。在后一种情况 中，这类特异性固定化导致靶核酸的优势结合。
在将核酸(包括靶核酸)从其天然环境纯化或分离后，可以例如经由依照 本发明的同时扩增来实施分析。
“同时”在本发明的意义中意味着同一时间且在相同物理条件下实施两 种行为，诸如扩增第一和第二或更多种核酸。在一个实施方案中，在一个容 器中实施至少第一和第二靶核酸的同时扩增。在另一个实施方案中，在一个 容器中用至少一种核酸而在第二容器中用至少第二种核酸同时且在相同物 理条件(特别就温度和温育时间而言)下实施同时扩增。
“第一靶核酸”和“第二靶核酸”是不同的核酸。
“流体样品”是可以进行靶向核酸的诊断性测定法的任何流体材料，并 且优选地，自生物学来源衍生。还优选地，所述流体样品自人衍生，并且是 体液。在本发明的一个优选的实施方案中，流体样品是人血液、尿液、痰、 汗液、拭样、可移液的粪、或脊髓液。最优选地，流体样品是人血液。
术语“反应容器”包含但不限于，管或板诸如微孔、深孔或其它类型多 孔板的孔，其中发生用于分析流体样品的反应诸如例如逆转录或聚合酶链式 反应。这类容器的外部界限或壁是化学惰性的，使得它们不干扰之内发生的 分析反应。优选地，如上文所描述的核酸分离也在多孔板中实施。
在此背景中，分析系统中的多孔板允许多份样品的平行分离和分析或贮 存。可以对多孔板优化最大液体摄取，或最大热转移。用于本发明上下文中 的优选的多孔板是经过优化的，以在自动化分析仪中温育或分离分析物。优 选地，多孔板构建并排列为接触磁性装置和/或加热装置。
所述优选的多孔板(可互换地，其在本发明的上下文中称作“加工板”)， 包含：
-包含成行排列的、顶部有开口的多个容器的顶部表面。容器包含上部部 分、中心部分和底部部分。上部部分与多孔板的顶部表面连接，并且包 含两个较长侧和两个较短侧。中心部分具有实质上矩形的横截面，其具 有两个较长侧和两个较短侧；
-两个相向的较短的和两个相向的较长的侧壁，和
-基部，其中所述基部包含开口，该开口构建并排列为将多孔板置于与所 述磁性装置和/或加热装置的接触中。
在多孔板的一个优选的实施方案中，一行内相邻的容器在所述几乎矩形 形状的较长侧上连接。
优选地，多孔板包含位于容器的相邻行间的连续空间。所述连续空间构 建并排列为容纳板形状的磁性装置。在一个优选的实施方案中，容器的底部 部分包含球形底部。在一个更优选的实施方案中，所述容器的底部部分包含 位于所述中心部分和所述球形底部之间的圆锥部分。
在一个优选的实施方案中，所述顶部表面包含圆拱(rib)，其中所述圆拱 围绕所述容器的开口。优选地，容器的所述上部部分的一个较短侧包含凹口 (recess)，所述凹口包含从圆拱延伸到该容器内侧的弯曲表面。
此外，在一个优选的实施方案中，所述容器包含圆形内侧形状。
为了固定到加工或温育站，优选地，基部包含含有凹口的边缘。分析仪 站上的闩锁夹(latch clip)可以衔接所述凹口以将板固定在站上。
在一个优选的实施方案中，所述容器包含基本上恒定的壁厚度。
在本发明上下文中优选的加工板(101)是1组件板。其顶部表面(110)包含 多个容器(103)(图5、图6)。每个容器在顶部具有开口(108)，并且在底部端(112) 是闭合的。顶部表面(110)包含圆拱(104)，优选地，其相对于顶部表面(110) 是升高的，并且围绕容器(103)的开口(108)。这防止可能落到板(101)的顶部 表面(110)上的液滴污染容器(103)的内容物。在图3至8中显示了优选的加工板 的视图。
优选地，加工板(101)的足迹包含对应于ANSI SBS足迹形式的基部长度 和宽度。更优选地，长度为127.76mm+/-0.25mm，而宽度为85.48mm+/-0.25 mm。因此，该板(101)具有两个相向的较短的侧壁(109)和两个相向的较长的 侧壁(118)。加工板(101)包含用于与输送装置(handler)(500，图12)相互作用 的形式锁定元件(106)。可以将加工板(101)在维持正确取向和位置的情况中 以高速快速且安全地夹紧、转运并定位。优选地，用于夹紧的形式锁定元件 (106)位于加工板(101)的上部中心部分，优选地，上部中心的三分之一内。 这具有的优点在于加工板(101)的潜在扭曲对形式锁定元件(106)只具有较小 的影响，而且板(101)的操作更强力。
优选地，加工板(101)包含硬件标识符(102)和(115)。硬件标识符(102)和 (115)是加工板(101)独特的，并且不同于同一系统中使用的其它消耗品的硬件 标识符。优选地，硬件标识符(102、115)在该消耗品侧壁上包含隆起部(ridge) (119)和/或凹口(125)，其中所述隆起部(119)和/或凹口(125)的模式对于特定的 消耗品类型，优选地加工板(101)是独特的。此独特模式在本文中也称为独特 的“表面几何学”。硬件标识符(102、115)确保用户仅可以将加工板(101)以正 确的取向加载到分析用仪器的适当堆垛机(stacker)位置中。在加工板(101)的 侧面，包含导向元件(116)和(117)(图3、图4)。它们防止加工板(101)倾斜。 导向元件(116、117)允许用户将具有导向元件(116、117)的加工板(101)作为 堆垛(stack)加载到分析用仪器中，然后将其在不使板倾斜的情况中在堆垛机 中在该仪器内垂直转移。
容器(103)的中心部分(120)具有几乎为矩形的横截面(图6、图7)。它们沿 着几乎为矩形形状的较长侧(118)以共用壁(113)分隔(图3)。由此形成的容器 (103)行具有的优点在于尽管可用的空间有限，但是它们具有大体积，优选地 为4ml的体积。另一个优点在于由于基本上恒定的壁厚度，生产是非常经济 的。进一步的优点在于容器(103)彼此加强，并且因此可以获得形状的高稳定 性。
连续空间(121)位于容器(103)行之间(图6、图7)。该空间(121)可以容纳磁 体(202、203)或加热装置(128)(图11)。优选地，这些磁体(202、203)和加热 装置(128)是固体装置。因此，可以将容器(103)中可容纳的液体(215)中包含 的磁性颗粒(216)从该液体(215)分离，其通过在使磁体(202、203)接近容器 (103)时对容器(103)施加磁场来实现。或者，在将加工板(101)置于加热装置 (128)上时，可以以升高的、受控的温度温育容器(103)的内容物。由于磁体 (202、203)或加热装置(128)可以是固体，因此可以实现高能量密度。容器(103) 的中心部分(120)的几乎矩形的形状(图10)还通过优化容器(103)和磁体(202) 或加热装置(128)之间的接触表面，并且因此增强能量转移入容器(103)中来 优化容器壁(109)和扁平形状的磁体(202)或加热装置(128)之间的接触。
在容器的圆锥底部(111)的区域中，空间(121)甚至更为明显，并且可以容 纳更多磁体(203)。容器的上部区域中大磁体(202)和圆锥区域中较小磁体(203) 的组合允许较大或小体积液体(215)中磁性颗粒(216)的分离。因此，小磁体 (203)使得在洗脱物移液过程中扣留磁性颗粒(216)更简单。这使得通过减少 磁性颗粒(216)沉淀物的死体积来以最小的损失移液洗脱物成为可能。此外， 使转移的洗脱物中磁性颗粒(216)的存在最小化。
在容器(103)的上部端，容器(103)的较短侧壁(109)之一包含延伸至圆周 圆拱(104)的试剂入口通道(105)(图3、4、7)。将试剂移液至试剂入口通道(105) 上，并且从通道(105)排入容器(103)中。因此，防止移液管针或尖端(3、4) 和容器中含有的液体之间的接触。此外，防止源自将液体直接分配入容器 (103)中含有的另一种液体(215)中的喷溅，其可能引起移液管针或尖端(3、4) 或相邻容器(103)的污染。将小体积试剂，随后为最大体积的另一种试剂连续 移液入试剂入口通道(105)上确保将仅以少量添加的试剂完全排入容器(103) 中。因此，移液小体积的试剂在不损失要实施的测试的准确度的情况中是可 能的。
在内侧，在容器底部(111、112)，形状变成圆锥形(111)，并且以球形底 部(112)为末端(图6、图7)。容器的内侧形状(114)(包括矩形中心部分(120)) 是圆形的。球形底部(112)、圆形内侧形状(114)、圆锥形部分(111)和容器(103) 的精细表面的组合产生有利的流体学，其促进加工板(101)中分析物的有效分 离和纯化。球形底部(112)允许分离洗脱物的基本上完全使用和死体积的降 低，这减少试剂遗留物或样品交叉污染。
加工板(101)的基部(129)上的边缘包含用于衔接加工站(201)或加热装置 (128)或分析用仪器(126)上的闩锁夹(124)的凹口(107)(图5、图9)。闩锁夹(124) 与凹口(107)的衔接允许加工板(101)在加工站(201)上的定位和固定。凹口 (107)的存在允许闩锁力几乎与基部(129)垂直地对加工板(101)起作用。因此， 仅可以发生横向起作用的小力。这降低应变的发生以及如此加工板(101)的变 形。垂直闩锁力也可以中和加工板(101)的任何变形，从而导致加工站(201) 内球形底部(111)的更精确定位。一般地，加工板(101)和分析仪内加工站(201) 或加热装置(128)之间的精确界面减少死体积，而且还降低样品交叉污染的风 险。
“分离站”是分析系统中允许固体支持材料自流体样品中存在的其它材 料分离的一种装置或组件。这类分离站可以例如包括但不限于离心机、过滤 管架、磁体、或其它合适的组件。在本发明的一个优选的实施方案中，分离 站包含一个或多个磁体。优选地，使用一个或多个磁体来分离作为固体支持 物的磁性颗粒，优选地，磁性玻璃颗粒。如果例如流体样品和固体支持材料 在多孔板的孔中组合在一起，那么分离站包含的一个或多个磁体可以例如通 过将磁体引入孔中来与流体样品自身接触，或者可以使所述一个或多个磁体 靠近孔的外壁以吸引磁性颗粒，随后将它们与周围液体分开。
在一个优选的实施方案中，分离站是包含多孔板的装置，所述多孔板包 含具有多孔板顶部表面处开口和闭合底部的容器。该容器包含上部部分、中 心部分和底部部分，其中所述上部部分与多孔板的顶部表面连接，并且优选 地，包含两个较长侧和两个较短侧。中心部分具有含两个较长侧的实质上矩 形的横截面，其中所述容器成行排列。连续空间位于两个相邻行间以使夹具 (fixture)上安放的至少一个磁体与处于至少两个Z位置的侧壁选择性接触。该 装置进一步包含磁性分离站，该磁性分离站包含至少一个夹具。夹具包含至 少一个产生磁场的磁体。存在移动机械，其相对于多孔板的容器至少在第一 和第二位置之间垂直移动包含至少一个磁体的所述至少一个夹具。优选地， 容器的所述至少两个Z位置包含所述容器的侧壁和底部部分。优选地，所述 至少一个磁体的磁场在所述至少一个磁体处于所述第一位置时将磁性颗粒 拉到容器与所述至少一个磁体相邻的内表面。所述磁场的效应在所述至少一 个磁体处于所述第二位置时小于在所述至少一个磁体处于所述第一位置时。 优选地，包含所述至少一个磁体的夹具包含框。容器具有优选的特征，如上 文在多孔板/加工板的背景中描述的。一种这类优选特征是所述容器的至少一 部分具有与所述容器的轴成直角的实质上矩形的横截面。
在所述第一位置中，所述至少一个磁体与所述容器的所述部分相邻。相 邻理解为意指极其接近从而对容器的内容物施加磁场，或者与容器有物理接 触。
分离站包含接受多孔板的框和附着多孔板的闩锁夹。优选地，分离站包 含两类磁体。下文进一步描述了此优选的实施方案。
下文描述了第二个优选的实施方案，其包含对包含磁体的框施加压力， 使得磁体相对于多孔板的容器挤压的弹簧。
优选地，第一磁体构建并排列为与多孔板的容器相互作用以对所述容器 中容纳的包含磁性颗粒的大体积液体施加磁场。优选地，所述第二磁体构建 并排列为与多孔板的容器相互作用以对所述容器中容纳的包含磁性颗粒的 小体积液体施加磁场。所述第一和第二磁体可以移动到不同的Z位置。
此外，分离和纯化核酸的方法在本发明的上下文和所述分离站中是有用 的。该方法包括使核酸在多孔板的容器中与磁性颗粒结合的步骤。所述容器 包含上部开口、中心部分和底部部分。然后，当液体的主要部分位于容器中 圆锥部分以具有矩形形状的中心部分替换的截面之上时，如下将结合的材料 与液体中含有的未结合的材料分开，即将磁体从第二位置移动到第一位置， 并且在所述第一位置中，对中心部分应用磁场，以及任选地，对所述容器的 底部部分另外应用磁场。任选地，可以用清洗溶液清洗磁性颗粒。通过对所 述容器的底部部分选择性应用磁场自所述磁性颗粒分离小体积的液体，其中 液体的主要部分位于容器中圆锥部分以具有矩形形状的中心部分替换的截 面之下。
用于分离与磁性颗粒结合的核酸的磁性分离站在本发明的上下文中也 是有用的，所述分离站包含第一磁体和第二磁体，所述第一磁体构建并排列 为与多孔板的容器相互作用以对所述容器中容纳的包含磁性颗粒的大体积 液体施加磁场，所述第二种磁体构建并排列为与多孔板的容器相互作用以对 所述容器中容纳的包含磁性颗粒的小体积液体施加磁场，且其中所述第一和 第二磁体可以移动到不同的Z位置。在本文中描述了磁性分离站的优选实施 方案。
下文描述了对本发明有用的分离站(201)的第一个优选的实施方案。所述 分离站(201)的第一个优选的实施方案包含至少两类磁体(202、203)。第一长 型磁体(202)构建并排列为适合于加工板(101)的空间(121)。如此，磁体(202) 对容器(103)中的液体(215)施加磁场以扣留容器壁内侧的磁性颗粒(216)。当 存在大体积液体(215)时，这允许磁性颗粒(216)和任何与其结合的材料与容 器(103)内侧的液体(215)分离。磁体(202)具有伸长的结构，并且构建并排列 为与容器的基本上矩形的中心部分(120)相互作用。因此，当液体(215)的主 要部分位于容器(103)中圆锥部分(111)以具有矩形形状的中心部分(120)替换 的截面之上时使用磁体(202)。如图40中显示的，磁体(202)的优选构造包含 夹具(204、204a)，该夹具包含适合于加工板(101)中容器(103)行之间的空间 (121)的磁体(202)。磁体(202)的另一种优选的实施方案包含排列在夹具(204、 204a)上的磁体(202)。优选的分离站(201)的磁体(203)较小，并且可以与容器 (103)的圆锥部分(111)相互作用。这在图10中显示。优选地，磁体(203)在基 部(205)上排列，所述基部可以移动到加工板(101)的空间(121)中。优选地， 每个磁体(202、203)构建为与两个相邻行中的两个容器(103)相互作用。在一 个优选的实施方案中，所述加工板(101)具有每行8个容器(103)的6行。可以 与优选的加工板(101)相互作用的分离站(201)具有3个包含磁体(202)的夹具 (204、204a)和4个包含磁体(203)的基部(205)。还包括一种如下的实施方案， 其中所述分离站具有4个包含磁体(202)的磁性夹具(204、204a)和3个包含磁体 (203)的磁性基部(205)。
所述磁体(202、203)是可移动的。所述分离站(201)包含移动夹具(204、 204a)和基部(205)的机械。所有夹具(204、204a)通过基部(217)相互连接，并 且因此协调移动。所有磁体(203)与一个基部(218)连接，并且因此协调移动。 用于移动磁性板(202)和(203)的机械构建并排列为将两类磁性板(202、203) 移动至总共4个末端位置：
在图40a-c中，所述磁体(203)位于加工板(101)的容器(103)的圆锥部分附 近。这是磁体(203)的最高位置，并且是分离位置。在此图中，所述磁体(202) 位于最低位置。当它们在此位置时它们不牵涉分离。
在图10中显示的优选实施方案中，磁体(202)的基部(217)与定位轮(206) 连接。该基部(217)包含通过移动元件(209)与连接元件(208)柔性接触的底部 末端(207)。所述移动元件构建并排列为将连接元件(208)沿着轨道(212)从一 侧移动到另一侧。所述移动元件(209)用销(220)固定到连接元件(208)。所述 连接元件(208)通过螺钉(210)固定到定位轮(206)。连接元件(208)也与轴(211) 连接。优选地，所述连接元件(208)是矩形板。当定位轮(206)绕着轴(211)偏 心移动，使得螺钉(210)从高于偏心轴的点移动到低于偏心轴的点时，使移动 元件(209)和附着有磁体(202)的基部(204)的底部末端(207)从最高位置移动到 最低位置。基部(218)在底部部分(219)上安放，并且在其较低末端用销(213) 与移动元件(214)连接，优选地，所述移动元件是轮，其与定位轮(206)相互 作用。当定位轮(206)绕轴(211)旋转时，轮(214)沿着定位轮(206)移动。如果 轮(214)位于定位轮(206)中离轴(211)的距离较短的截面上，那么磁体(203)处 于其最低位置。如果轮(214)位于定位轮(206)中离轴(211)的距离最大的截面 上时，磁体(203)处于其最高位置。因此，在分离站的第一个实施方案的优选 实施方案中，磁体(203)的位置受定位轮(206)形状控制。当移动元件(209)沿 着轨道(212)的中心、圆形的上部或下部部分(212a)移动时，小型磁体(203)上 下移动。当移动元件(209)位于底部末端(207)的侧面(212b)并且向上或向下移 动时，磁体(202)向上或向下移动。定位轮可以由任何电动机(224)旋转。
在一个优选的实施方案中，弹簧(225)附着于分离站的基部(222)和磁体 (203)的基部(218)以确保磁体(203)在其向下移动时移动到最低位置中。
如本文中使用的，术语“销”指任何固定元件，包括螺钉或销。
在第二个优选的实施方案中，所述分离站(230)包含至少一个夹具(231)， 该夹具包含至少一个磁体(232)，优选地，与行(123)中的容器(103)数目相等 数目的磁体。优选地，所述分离站(230)包含与上文中描述的多孔板(101)的 行(123)数目相等数目的夹具(231)。更优选地，6个夹具(231)在分离站(230) 上安放。至少一个磁体(232)在一个夹具(231)上安放。优选地，磁体(232)数 目等于一行(123)中容器(103)的数目。最优选地，8个磁体(232)在一个夹具上 (231)安放。优选地，在所述夹具(231)上包含一类磁体(232)。更优选地，磁 体(232)在朝向与磁体相互作用的容器取向的一侧安放。
夹具(231)在基部(233)上安放。优选地，所述安放是柔性的。基部(233) 包含安放于其上的弹簧(234)。弹簧(234)的数目是所述基部(233)上安放的每 个夹具(231)至少一个弹簧。该基部进一步包含斜面(236)，其限制弹簧及因 此包含磁体(232)的夹具(231)的移动。优选地，任一个所述弹簧(234)构建并 排列为与夹具(231)相互作用。更优选地，所述弹簧(234)是轭式弹簧(yoke spring)。所述相互作用控制夹具(231)的水平移动。此外，分离站(230)包含框 (235)。具有夹具(231)的基部(233)通过移动机械与框(235)连接，如在上文中 对第一个实施方案的磁体(232)描述的。
优选地，所述基部(233)和夹具(231)构建并排列为(以Z方向)垂直移动。
将上文中描述的多孔板(101)插入在分离站(230)中。垂直移动包含磁体 (232)的夹具(231)。如此，将任一个夹具(232)移动到容器(103)的两行(123)之 间的空间(121)中。垂直移动使安放在夹具(231)上的磁体(232)与容器(103)接 触。根据容器(103)内侧的液体(215)体积选择Z位置。对于大体积，磁体(232) 在中心位置(120)中接触容器(103)，在那里容器(103)具有近似矩形形状。对 于小体积液体(215)(其中液体(215)的主要部分位于容器(103)的中心部分 (120)下)，优选地，磁体(232)接触容器(103)的圆锥部分(111)。
弹簧附着于任一个框(231)的基部(233)(图9a)、b))。该弹簧使磁体(232) 挤压容器(103)。这确保在磁性分离过程中磁体(232)和容器(103)之间的接触。 优选地，磁体(232)在位于入口(105)下面的侧壁(109)上接触容器(103)。这具 有的优点在于，通过移液添加的液体流过扣留的磁性颗粒，并且确保将颗粒 重悬浮，而且相同处理所有容器中的所有样品。
此实施方案特别适合于在所述多孔板(101)的容器(103)中含有不同水平 的液体(215)时将如上文中描述的多孔板(101)中包含的液体(215)与磁性颗粒 (216)分开。
“清洗缓冲液”是设计为除去不期望的组分(尤其在纯化规程中)的流体。 这类缓冲液是本领域中公知的。在核酸纯化背景中，清洗缓冲液适于清洗固 体支持材料以将固定化的核酸与任何不期望的组分分开。所述清洗缓冲液可 以例如在如上文所描述的具有酸性pH且没有乙醇和/或离液剂的一种或多种 缓冲溶液中含有乙醇和/或离液剂。清洗溶液或其它溶液经常以储备溶液提 供，所述储备溶液在使用前必须稀释。
依照本发明的方法中的清洗需要将固体支持材料及其上固定化的核酸 与清洗缓冲液进行程度不同的强烈接触。不同方法有可能实现这点，例如在 相应的一个或多个容器中或与相应的一个或多个容器一起摇动清洗缓冲液 及固体支持材料。另一种有利的方法是将包含清洗缓冲液和固体支持材料的 悬浮液抽吸并分配一次或多次。优选地，使用移液管实施此方法，其中优选 地，所述移液管包含抽吸所述悬浮液并将其再次分配的一次性移液管尖端。 这类移液管尖端在弃去和替换前可以使用数次。优选地，对本发明有用的一 次性移液管尖端具有至少10μl，更优选地，至少15μl，更优选地，至少100μl， 更优选地，至少500μl，更优选地，至少1ml，甚至更优选地，约1ml的体积。 在本发明的上下文中使用的移液管也可以是移液针。
因此，本发明的一个优选的方面是上文所描述的方法，其中步骤c.中的 所述清洗包含抽吸和分配包含固体支持材料的清洗缓冲液。
在本发明的上下文中，“扩增试剂”是使核酸能够扩增的化学或生物化 学成分。这类试剂包含但不限于核酸聚合酶、缓冲液、单核苷酸诸如三磷酸 核苷、寡核苷酸例如如寡核苷酸引物、盐及其相应的溶液、检测探针、染料， 等等。
如本领域中已知的，“核苷”是碱基-糖组合。核苷的碱基部分通常是杂 环碱基。两类最常见的这类杂环碱基是嘌呤和嘧啶。
“核苷酸”是进一步包含与核苷的糖部分共价连接的磷酸根基团的核 苷。对于那些包含呋喃戊糖基糖的核苷，磷酸根基团可以与糖的2’-、3’-或5’- 羟基模块连接。核苷酸是“寡核苷酸”(其可以更一般地称为“寡聚化合物”)， 或“多核苷酸”(更一般称为“多聚化合物”)的单体单元。前述物质的另一 种一般表述是脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)。
依照本发明，“寡聚化合物”是由“单体单元”组成的化合物，所述“单 体单元”可以是单独的核苷酸或单独的非天然化合物(见下文)，更特别地是 经修饰的核苷酸(或核苷酸类似物)或非核苷酸化合物，或其组合。
“寡核苷酸”和“经修饰的寡核苷酸”(或“寡核苷酸类似物”)是寡聚 化合物的亚组。在本发明的背景中，术语“寡核苷酸”指自多个作为其单体 单元的核苷酸形成的组分。磷酸根基团通常称为形成寡核苷酸的核苷间主 链。RNA和DNA的正常连接或主链是3’至5’磷酸二酯连接。可以合成对本发 明有用的寡核苷酸和经修饰的寡核苷酸(见下文)，如主要在本领域中描述的 且本领域中熟练人员已知的。用于制备特定序列的寡聚化合物的方法是本领 域中已知的，并且包括例如合适序列的克隆和限制以及直接化学合成。化学 合成方法可以包括例如由Narang S.A.等,Methods in Enzymology68(1979) 90-98描述的磷酸三酯方法、由Brown E.L.等,Methods in Enzymology68 (1979)109-151披露的磷酸二酯方法、在Beaucage等,Tetrahedron Letters22 (1981)1859中披露的亚磷酰胺方法、在Garegg等,Chem.Scr.25(1985) 280-282中披露的H-膦酸盐方法以及在US4,458,066中披露的固体支持物方 法。
在依照本发明的方法中，寡核苷酸可以经过化学修饰，即引物和/或探针 包含经修饰的核苷酸或非核苷酸化合物。因而，探针或引物是经修饰的寡核 苷酸。
“经修饰的核苷酸”(或“核苷酸类似物”)与天然核苷酸相差一些修饰， 但是仍然由碱基、呋喃戊糖基糖、磷酸根部分、碱基样、呋喃戊糖基糖样和 磷酸根样部分或其组合组成。例如，可以将标记物附着于核苷酸的碱基部分， 由此获得经修饰的核苷酸。核苷酸中的天然碱基也可以用例如7-脱氮嘌呤替 换，由此也获得经修饰的核苷酸。
“经修饰的寡核苷酸”(或“寡核苷酸类似物”)，属于另一特定亚组的 寡聚化合物，拥有一个或多个核苷酸和一个或多个经修饰的核苷酸作为单体 单元。因此，术语“经修饰的寡核苷酸”(或“寡核苷酸类似物”)指以与寡 核苷酸基本上相似的方式发挥功能的结构，并且在本发明的背景中可以互换 使用。从合成观点来看，可以例如通过对磷酸根主链、核糖单元或核苷酸碱 基的适当修饰通过化学修饰寡核苷酸来生成经修饰的寡核苷酸(或寡核苷酸 类似物)(Uhlmann和Peyman,Chemical Reviews90(1990)543;Verma S.和 Eckstein F.,Annu.Rev.Biochem.67(1998)99-134)。代表性修饰包括用硫代磷 酸酯、二硫代磷酸酯、膦酸甲酯、磷酸三酯或氨基磷酸酯核苷间连接替换磷 酸二酯核苷间连接；用脱氮或氮杂嘌呤和嘧啶替换天然的嘌呤和嘧啶碱基， 在第5位或第6位具有取代基基团的嘧啶碱基；在第2位、第6位或第8位或第7 位(如7-脱氮嘌呤)具有改变的取代基基团的嘌呤碱基；携带烃基/烷基、烯基、 炔基或芳基模块，例如低级烃基/烷基基团诸如甲基、乙基、丙基、丁基、叔 丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基，或芳基基团如苯基、苄基、 萘基的碱基；在例如其2’位置具有取代基基团的糖；或碳环或无环糖类似物。 与本发明的精神一致的其它修饰是本领域的技术人员已知的。这类经修饰的 寡核苷酸(或寡核苷酸类似物)最好描述为与天然寡核苷酸在功能上可互换， 但在结构上不同。更为详细的，例示性修饰披露于Verma S.和Eckstein F.,Annu. Rev.Biochem.67(1998)99-134或WO02/12263中。另外，可以做出如下的修 饰，其中核苷单元经由取代核苷间磷酸酯或糖磷酸酯连接的基团连接。这类 连接包括那些披露于Verma S.和Eckstein F.,Annu.Rev.Biochem.67(1998) 99-134中的。当利用磷酸酯以外的连接来连接核苷单元时，这类结构也描述 为“寡核苷”。
“核酸”以及“靶核酸”是如本领域熟练技术人员已知的核苷酸的多聚 化合物。“靶核酸”在本文中用于指样品中应该分析，即应该测定样品中其 存在、不存在和/或量的核酸。
术语“引物”在本文中如本领域熟练技术人员已知的那样使用，指能够 通过模板依赖性DNA聚合酶引发DNA合成的寡聚化合物，主要指寡核苷酸， 但也指经修饰的寡核苷酸，即例如引物的3’端提供游离的3’-OH基团，可以 通过建立3’至5’磷酸二酯连接的模板依赖性DNA聚合酶对所述游离的3’-OH 基团附着其它核苷酸，其中使用三磷酸脱氧核苷且其中释放焦磷酸。
“探针”也指天然的或经修饰的寡核苷酸。如本领域中已知的，探针满 足检测分析物或扩增物的目的。在依照本发明的方法的情况中，可以使用探 针来检测靶核酸的扩增物。出于此目的，探针通常携带标记物。
“标记物”，经常称为“报告基团”，一般是使与其结合的核酸，特别是 寡核苷酸或经修饰的寡核苷酸，以及任何核酸与样品的剩余部分可区别的基 团(具有附着的标记物的核酸也可以称作经标记的核酸结合化合物、经标记 的探针或仅探针)。依照本发明的优选的标记物是荧光标记物，其是例如荧 光染料诸如荧光素染料、罗丹明染料、花菁染料和香豆素染料。依照本发明 的优选的荧光染料是FAM、HEX、JA270、CAL635、香豆素343、Quasar705、 Cyan500、CY5.5、LC-红640、LC-红705。
在本发明的上下文中，任何引物和/或探针都可以是经过化学修饰的，即 引物和/或探针包含经修饰的核苷酸或非核苷酸化合物。因而，探针或引物是 经修饰的寡核苷酸。
核酸扩增的优选方法是聚合酶链式反应(PCR)，其披露于美国专利No. 4,683,202、4,683,195、4,800,159和4,965,188，等等。PCR通常采用两种或更 多种结合选择的核酸模板(例如DNA或RNA)的寡核苷酸引物。对核酸分析有 用的引物包括能够在靶核酸的核酸序列内充当核酸合成的起始点的寡核苷 酸。可以通过常规方法从限制性消化物纯化引物，或者其可以合成生成。优 选地，引物是单链以在扩增中实现最大效率，但是引物可以是双链。首先， 将双链引物变性，即处理以将链分开。将双链核酸变性的一种方法通过加热 进行。“热稳定性聚合酶”是热稳定的酶聚合酶，即其是催化形成与模板互 补的引物延伸产物，并且在受到升高的温度处理达实现双链模板核酸变性必 需的时间时没有不可逆地变性的酶。一般地，合成在每条引物的3’端起始， 并且沿着模板链以5’到3’方向进行。热稳定性聚合酶已经例如自黄色栖热菌 (Thermus flavus)、红色栖热菌(T.rubber)、嗜热栖热菌(T.thermophilus)、水生 栖热菌(T.aquaticus)、乳栖热菌(T.lacteus)、红色栖热菌(T.rubens)、嗜热脂 肪芽胞杆菌(Bacillus stearothermophilus)和炽热甲烷嗜热菌(Methanothermus fervidus)分离。不过，非热稳定性聚合酶也可以在PCR测定法中采用，只要 该酶得到补充。
如果模板核酸是双链的，那么有必要在可以使用其作为PCR中的模板前 将两条链分开。可以通过任何合适的变性方法，包括物理、化学或酶手段来 实现链分开。一种分开核酸链的方法牵涉加热核酸，直至其变性占优势(例 如，大于50%、60%、70%、80%、90%或95%变性)。使模板核酸变性必需 的加热条件会取决于例如缓冲盐浓度和变性的核酸的长度和核苷酸组成，但 是范围通常为约90°C至约105°C达某个时间，该时间取决于反应特征诸如温 度和核酸长度。变性通常实施约5秒至9分钟。为了不使相应的聚合酶如例如 Z05DNA聚合酶暴露于这类高温太长及如此有损失功能性酶的风险，优选使 用较短的变性步骤。
在本发明的一个优选的实施方案中，变性步骤长至30秒，进一步优选地， 长至20秒，进一步优选地，长至10秒，进一步优选地，长至5秒，最优选地， 约5秒。
如果通过加热来使双链模板核酸变性，那么允许反应混合物冷却至如下 的温度，该温度促进每条引物在靶核酸上与其靶序列退火。
优选地，用于退火的温度是约35°C至约70°C，进一步优选地，约45°C 至约65°C；进一步优选地，约50°C至约60°C，进一步优选地，约55°C至约 58°C。退火时间可以是约10秒至约1分钟(例如约20秒至约50秒；约30秒至约 40秒)。在此背景中，可以有利的是使用不同的退火温度来增加相应测定法 的包容性(inclusivity)。简言之，这意味着于相对较低的退火温度，引物也可 以结合具有单一错配的靶物，因此也可以扩增特定序列的变体。如果例如某 种生物体具有已知或未知的也应该检出的遗传变体，那么这可以是期望的。 在另一方面，相对较高的退火温度具有提供较高特异性的优点，因为朝向更 高的温度，引物结合不完全匹配的靶序列的可能性不断降低。为了受益于这 两种现象，在本发明的一些实施方案中，优选的是，上文所描述的方法包括 于不同温度，优选地，首先于较低温度，然后于较高温度退火。如果例如第 一温育于55°C发生约5个循环，那么可以(预)扩增不完全匹配的靶序列。这接 着可以是例如于58°C约45个循环，从而提供贯穿实验的主要部分的较高特异 性。这样，在特异性保持相对较高的情况中不遗漏潜在重要的遗传变体。
然后，将反应混合物调节至促进或优化聚合酶活性的温度，即足以自退 火引物发生延伸以生成与要分析的核酸互补的产物的温度。温度应该足以从 与核酸模板退火的每条引物合成延伸产物，但是不应高得以致于延伸产物从 其互补模板变性(例如，一般地，用于延伸的温度范围为约40°C至约80°C； 例如约50°C至约70°C；约60°C)。延伸时间可以是约10秒至约5分钟，优选地， 约15秒至2分钟，进一步优选地，约20秒至约1分钟，进一步优选地，约25秒 至约35秒。新合成的链形成双链分子，其可以在反应的随后步骤中使用。可 以根据需要经常重复链分开、退火、和延伸步骤以产生期望量的与靶核酸对 应的扩增产物。反应中的限制因素是反应中存在的引物、热稳定性酶、和三 磷酸核苷的量。优选地，将循环步骤(即变性、退火、和延伸)至少重复一次。 为了在检测中使用，循环步骤数目会取决于例如样品的性质。如果样品是核 酸的复杂混合物，那么将需要更多的循环步骤来扩增足以检出的靶序列。一 般地，将循环步骤至少重复约20次，但是可以重复多达40、60或甚至100次。
在本发明的范围内，可以实施如下的PCR，其中退火和延伸步骤在同一 步骤中(一步PCR)或者如上文所描述的，在分开的步骤中(两步PCR)实施。将 退火和延伸一起及如此在相同物理和化学条件下，用合适的酶诸如例如Z05 DNA聚合酶实施具有的优点在于节省每个循环中用于额外步骤的时间，并且 还消除对退火和延伸之间额外的温度调节的需要。因此，一步PCR降低相应 测定法的总体复杂性。
一般地，总体扩增的时间较短是优选的(因为缩短获得结果时间)，而且 导致可能更早的诊断。
在本发明的上下文中要使用的其它优选的核酸扩增方法包括连接酶链 式反应(LCR;Wu D.Y.和Wallace R.B.,Genomics4(1989)560-69；及Barany F., Proc.Natl.Acad.Sci.USA88(1991)189-193)；聚合酶连接酶链式反应(Barany F.,PCR Methods and Applic.1(1991)5-16)；缺口-LCR(WO90/01069)；修复 链式反应(Repair Chain Reaction)(EP0439182A2)、3SR(Kwoh D.Y.等,Proc. Natl.Acad.Sci.USA86(1989)1173-1177;Guatelli J.C.等,Proc.Natl.Acad.Sci. USA87(1990)1874-1878;WO92/08808)、以及NASBA(US5,130,238)。此外， 有链置换扩增(SDA)、转录介导的扩增(TMA)和Qb扩增(关于综述，参见例如 Whelen A.C.和Persing D.H.,Annu.Rev.Microbiol.50(1996)349-373; Abramson R.D.和Myers T.W.,Curr Opin Biotechnol4(1993)41-47)。
“具有逆转录酶活性的聚合酶”是能够基于RNA模板合成DNA的核酸聚 合酶。它也能够在RNA已经逆转录成单链cDNA后形成双链DNA。在本发明 的一个优选的实施方案中，具有逆转录酶活性的聚合酶是热稳定的。
在一个优选的实施方案中，依照本发明的方法包括将含有RNA模板的样 品与寡核苷酸引物和优选地热稳定性DNA聚合酶在存在至少所有4种天然的 或经修饰的三磷酸脱氧核糖核苷的情况中在合适的缓冲液中一起温育，所述 寡核苷酸引物与所述RNA模板充分互补以与后者杂交，所述合适的缓冲液包 含金属离子缓冲液，在一个优选的实施方案中，其缓冲pH和金属离子浓度两 者。于某个温度实施此温育，所述温度足以使所述引物与所述RNA模板杂交， 并且所述DNA聚合酶催化所述三磷酸脱氧核糖核苷的聚合，以形成与所述 RNA模板序列互补的cDNA序列。
如在本文中使用的，术语“cDNA”指使用核糖核酸链(RNA)作为模板 合成的互补DNA分子。RNA可以是例如mRNA、tRNA、rRNA、或另一种形 式的RNA，诸如病毒RNA。cDNA可以是单链的、双链的或者可以与互补RNA 分子氢键键合，如在RNA/cDNA杂合物中的。
适合于与RNA模板退火的引物也可以适合于通过PCR扩增。对于PCR， 与逆转录cDNA链互补的第二条引物为延伸产物的合成提供起始位点。
在通过DNA聚合酶来扩增RNA分子中，第一延伸反应是使用RNA模板 的逆转录，并且生成DNA链。使用DNA模板的第二延伸反应生成双链DNA 分子。因此，通过DNA聚合酶从RNA模板合成互补DNA链为扩增提供起始 材料。
热稳定性DNA聚合酶可以在偶联的单酶逆转录/扩增反应中使用。术语 “同质的”在此背景中指用于RNA靶物的逆转录和扩增的两步骤单一添加反 应。同质的意指在逆转录(RT)步骤后，不需要在扩增步骤前打开反应容器或 以其它方式调节反应组分。在非同质性RT/PCR反应中，在逆转录后且在扩 增前，例如调节、添加、或稀释一种或多种反应组分诸如扩增试剂，为此不 得不打开反应容器，或者至少不得不操作其内容物。虽然本发明的范围包括 同质性和非同质性实施方案两者，但是优选RT/PCR的同质形式。
逆转录是RT/PCR中的一个重要的步骤。例如，本领域中已知的是，RNA 模板显示形成二级结构的趋势，所述二级结构可以阻碍引物结合和/或相应逆 转录酶对cDNA链的延伸。因此，RT反应的相对较高的温度就转录效率而言 是有利的。在另一方面，提高温育温度也意味着更高的特异性，即RT引物不 会与同预期的一种或多种序列显示错配的序列退火。尤其在多种不同靶RNA 的情况中，可能期望也转录，并且随后扩增并检测具有单一错配的序列，例 如在流体样品中可能存在生物体的未知的或不常见的亚株或亚种的情况中。
为了受益于上文所描述的两种优点，即减少二级结构和具有错配的模板 的逆转录，本发明的一个方面是于超过一种不同温度实施RT温育。
因此，本发明的一个优选的方面是上文所描述的方法，其中在步骤e.中， 于30°C至75°C，优选地45°C至70°C，进一步优选地55°C至65°C的不同温度 实施具有逆转录酶活性的聚合酶的温育。
作为逆转录的又一个重要方面，较长的RT步骤可以损伤可存在于流体样 品中的DNA模板。如果流体样品含有RNA和DNA种类两者，如此，有利的 是将RT步骤的持续时间保持得尽可能短，但是同时确保合成的cDNA量足以 用于随后的扩增和任选的扩增物检测。
因此，本发明的一个优选的方面是上文所描述的方法，其中在步骤e中， 时间段是长至30分钟、20分钟、15分钟、12.5分钟、10分钟、5分钟、或1分 钟。
本发明的又一个优选的方面是上文所描述的方法，其中具有逆转录酶活 性且包含突变的聚合酶选自下组：
a.CS5DNA聚合酶
b.CS6DNA聚合酶
c.海栖热袍菌(Thermotoga maritime)DNA聚合酶
d.水生栖热菌DNA聚合酶
e.嗜热栖热菌DNA聚合酶
f.黄色栖热菌DNA聚合酶
g.丝状栖热菌(Thermus filiformis)DNA聚合酶
h.栖热菌属物种sps17DNA聚合酶
i.栖热菌属物种Z05DNA聚合酶
j.那不勒斯栖热袍菌(Thermotoga neapolitana)DNA聚合酶
k.非洲栖热腔菌(Termosipho africanus)DNA聚合酶
l.Thermus caldophilus DNA聚合酶。
特别适合于这些要求的是在聚合酶域中携带突变的酶，所述突变就较快 的延伸速率而言增强其逆转录效率。
因此，本发明的一个优选的方面是上文所描述的方法，其中具有逆转录 酶活性的聚合酶是相对于相应的野生型聚合酶包含突变的聚合酶，所述突变 赋予改善的核酸延伸速率和/或改善的逆转录酶活性。
在一个更优选的实施方案中，在上文所描述的方法中，具有逆转录酶活 性的聚合酶是相对于相应的野生型聚合酶包含突变的聚合酶，所述突变赋予 改善的逆转录酶活性。
携带使其特别可用于本发明背景的点突变的聚合酶披露于WO 2008/046612中。具体地，要在本发明背景中使用的优选的聚合酶是在聚合酶 域中至少包含下述基序的突变的DNA聚合酶： T-G-R-L-S-S-Xb7-Xb8-P-N-L-Q-N；其中Xb7是选自S或T的氨基酸，且其中Xb8是选自G、T、R、K或L的氨基酸，其中该聚合酶包含3’-5’外切核酸酶活性， 并且相对于野生型DNA聚合酶具有改善的核酸延伸速率和/或改善的逆转录 效率，其中在所述野生型DNA聚合酶中，Xb8是选自D、E或N的氨基酸。
一个特别优选的例子是来自栖热菌属物种Z05的热稳定性DNA聚合酶突 变体(记载于例如US5,455,170)，如与相应的野生型酶Z05相比，所述变异在 聚合酶域中包含突变。对依照本发明的方法特别优选的是突变体Z05DNA聚 合酶，其中第580位氨基酸选自下组：G、T、R、K和L。
对于使用热稳定性聚合酶的逆转录，Mn2+作为二价阳离子是优选的， 并且通常以盐形式，例如氯化锰(MnCl2)、乙酸锰(Mn(OAc)2)、或硫酸锰 (MnSO4)包括在内。如果例如在含有50mM Tricine缓冲液的反应中包含 MnCl2，那么MnCl2一般以0.5-7.0mM的浓度存在；当利用各200mM dGTP、 dATP、dUTP、和dCTP时优选0.8-1.4mM；且2.5-3.5mM MnCl2是最优选的。 此外，使用Mg2+作为二价阳离子用于逆转录在本发明的背景中也是优选的。
由于在保留DNA靶核酸的情况中将RNA靶核酸逆转录成cDNA在本发 明的范围内，因此可以使用cDNA和DNA两者进行随后的扩增，依照本发明 的方法特别可用于同时扩增自具有RNA基因组的生物体或具有DNA基因组 的生物体两者衍生的靶核酸。此优点相当大地增加可以在相同物理条件下分 析的一批不同生物体，特别是病原体。
因此，本发明的一个优选的方面是上文所描述的方法，其中至少两种靶 核酸包含RNA和DNA。
如本文中使用的，“生物体”意指任何活的单细胞或多细胞生命形态。 在本发明的上下文中，病毒是一种生物体。
特别由于适当的最适温度，酶如Tth聚合酶或优选地上文提及的突变体 Z05DNA聚合酶适合于实施随后扩增靶核酸的步骤。对逆转录和扩增两者采 用同一种酶促成易于实施该方法，并且促进了自动化，因为不必在RT和扩增 步骤之间操作流体样品。
因此，在一个优选的实施方案中，在上文所描述的方法中，在步骤e.和 步骤f.中使用相同的具有逆转录酶活性的聚合酶。优选地，所述酶是上文描 述的突变体Z05DNA聚合酶。
为了不使本发明上下文中使用的反应混合物的聚合酶或其它组分暴露 于升高的温度达长于必要的时间，在一个优选的实施方案中，高于90°C的步 骤长多至20秒，优选地多至15秒，更优选地多至10秒，更优选地多至5秒， 且最优选地5秒。这也缩短获得结果时间，并且缩短测定法的总体需要时间。
在这类同质性设置中，可以具有相当大的优点的是在启动RT和扩增前将 反应容器密封，由此降低污染的风险。可以例如如下实现密封，即应用优选 为透明的箔、盖，或者通过对反应容器添加油，并在流体顶部形成亲脂相作 为密封层。
因此，本发明的一个优选的方面是上文描述的方法，其在步骤d.和步骤 e.之间进一步包括将至少两个反应容器密封的步骤。
为了易于操作并促进自动化，优选的是，将至少两个反应容器在整体排 列中组合，因此可以对它们一起操作。
因此，本发明的一个优选的方面是上文描述的方法，其中所述至少两个 反应容器在同一个整体排列中组合。
整体排列可以是例如可逆或不可逆地彼此附着或在架中排列的管形瓶 或管。优选地，所述整体排列是多孔板。
扩增步骤的靶物可以是RNA/DNA杂合分子。靶物可以是单链或双链核 酸。虽然最广泛使用的PCR规程使用双链靶物，但是这并不是必须的。在单 链DNA靶物的第一轮扩增循环后，反应混合物含有双链DNA分子，其由单 链靶物和新合成的互补链构成。类似地，在RNA/cDNA靶物的第一轮扩增循 环后，反应混合物含有双链cDNA分子。在这点时，进行连续扩增循环，如 上文所描述的。
由于核酸扩增(特别但不仅仅是在PCR的情况中)在作为循环反应实施时 是非常有效的，本发明的一个优选的方面是上文所描述的方法，其中步骤f. 中的扩增反应由多个循环步骤组成。
合适的核酸检测方法是本领域技术人员已知的，并且记载于标准教科书 如Sambrook J.等,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York,1989及Ausubel F.等:Current Protocols in Molecular Biology1987,J.Wiley and Sons,NY。在实施核酸检测 步骤前也可以有进一步的纯化步骤，如例如沉淀步骤。检测方法可以包括但 不限于结合或插入特定的染料如溴化乙啶，其插入双链DNA中，此后改变其 荧光。也可以任选地在限制性消化后通过电泳方法分离纯化的核酸，此后将 其显现。还有基于探针的测定法，其采用寡核苷酸与特定序列的杂交和随后 对杂交物的检测。
优选的是在扩增反应期间或之后检测扩增的靶核酸以评估分析结果。特 别对于实时检测，使用核酸探针是有利的。
因此，本发明的一个优选的方面是上文所描述的方法，其中循环步骤包 括扩增步骤和杂交步骤，所述杂交步骤包括使扩增的核酸与探针杂交。
可以有利的是实时监测扩增反应，即在扩增自身期间检测靶核酸和/或其 扩增物。
因此，本发明的一个优选的方面是上文所描述的方法，其中用供体荧光 模块和相应的接受荧光模块标记探针。
优选地，上文所列的方法基于供体荧光模块和接受荧光模块之间的荧光 共振能量转移(FRET)。代表性的供体荧光模块是荧光素，而代表性的相应接 受荧光模块包括LC-红640、LC-红705、Cy5、和Cy5.5。通常，检测包括以 供体荧光模块吸收的波长激发样品，并且显现和/或测量由相应的接受荧光模 块发射的波长。在依照本发明的方法中，优选地，检测继之以量化FRET。 优选地，在每个循环步骤后实施检测。最优选地，实时实施检测。通过使用 商品化实时PCR仪(例如LightCyclerTM或)，PCR扩增和扩增产物的 检测可以以显著缩短的循环时间在单个封闭的小杯中组合。由于检测与扩增 同时发生，因此实时PCR方法消除对操作扩增产物的需要，并且降低扩增产 物间交叉污染的风险。实时PCR大大地缩短周转时间，并且是临床实验室中 常规PCR技术的一种有吸引力的备选。
下列专利申请描述了如在LightCyclerTM技术中使用的实时PCR：WO 97/46707、WO97/46714和WO97/46712。LightCyclerTM仪是一种与利用高质 量光学镜的微体积荧光计组合的快速热循环仪。此快速热循环技术使用薄玻 璃小杯作为反应容器。反应室的加热和冷却通过交替加热的和周围的空气来 控制。由于空气的质量低以及小杯的表面积与体积的比率高，可以在热室内 实现非常快速的温度交换速率。
技术利用用两种荧光模块标记的单链杂交探针。当第一荧光模 块用合适波长的光激发时，吸收的能量依照FRET的原理转移到第二荧光模 块。一般地，第二荧光模块是猝灭剂分子。以此形式使用的典型荧光染料是 例如FAM、HEX、CY5、JA270、Cyan和CY5.5，等等。在PCR反应的退火步 骤期间中，经标记的杂交探针结合靶核酸(即扩增产物)，并且在随后的延伸 阶段期间，受到Taq或如熟练技术人员已知的另一种合适的聚合酶，诸如优 选的突变体Z05聚合酶的5’至3’外切核酸酶活性降解。结果，激发的荧光模块 和猝灭剂模块变成彼此空间分开。因此，在没有猝灭剂的情况中激发第一荧 光模块后，可以检出来自第一荧光模块的荧光发射。
在上文描述的两种检测形式中，发射信号的强度可以与初始靶核酸分子 数目相关联。
作为FRET的一种备选，可以使用双链DNA结合染料诸如荧光DNA结合 染料(例如SYBRGREEN 或(Molecular Probes))来检测扩增 产物。在与双链核酸相互作用后，这类荧光DNA结合染料在用合适波长的光 激发后发射出荧光信号。也可以使用双链DNA结合染料诸如核酸嵌入染料。 当使用双链DNA结合染料时，通常实施解链曲线分析以确认扩增产物的存 在。
使用本发明的实时PCR方法，也可以使用与FRET结合的分子信标来检 测扩增产物的存在。分子信标技术使用用第一荧光模块和第二荧光模块标记 的杂交探针。第二荧光模块一般是猝灭剂，并且荧光标记物通常位于探针的 每个末端。分子信标技术使用具有允许二级结构形成(例如发夹)的序列的探 针寡核苷酸。由于探针内二级结构形成，两种荧光模块在探针在溶液中时为 空间接近。在与扩增产物杂交后，探针的二级结构受到破坏，并且荧光模块 变得彼此分开，使得在用合适波长的光激发后，可以检出第一荧光模块的发 射。
因此，利用FRET的上文描述的方法在依照本发明的优选方法中，其中 所述探针包含允许二级结构形成的核酸序列，其中所述二级结构形成导致所 述第一和第二荧光模块之间的空间接近。
仅可以在荧光模块直接局部接近时，且在供体荧光模块的发射光谱与接 受荧光模块的吸收光谱重叠时发生有效的FRET。
因此，在本发明的一个优选的实施方案中，所述供体和接受荧光模块在 所述探针上在彼此的不超过5个核苷酸内。
在又一个优选的实施方案中，所述接受荧光模块是猝灭剂。
如上文描述的，在TaqMan形式中，在PCR反应的退火步骤期间中，经标 记的杂交探针结合靶核酸(即扩增产物)，并且在随后的延伸阶段期间，受到 Taq或如熟练技术人员已知的另一种合适的聚合酶，诸如优选的突变体Z05 聚合酶的5’至3’外切核酸酶活性降解。
因此，在一个优选的实施方案中，在依照本发明的方法中，扩增采用具 有5’至3’外切核酸酶活性的酶聚合酶。
进一步有利的是注意选择由依照本发明的方法产生的扩增子的长度。一 般地，相对较短的扩增子提高扩增反应的效率。因此，本发明的一个优选的 方面是依照本发明的方法，其中扩增片段包含多至450个碱基，优选地多至 300个碱基，进一步优选地多至200个碱基，且进一步优选地多至150个碱基。
依照本发明，使用对照核酸可以进一步具有优点。本领域已知的是定性 和定量对照两者特别在诊断环境中具有相当大的意义。
在此背景中，充当“定量标准核酸”的对照核酸倾向是参照物，并且作 为参照物使用以量化靶核酸，即测定靶核酸的量。出于此目的，一种或多种 定量标准核酸与靶核酸一起经历所有可能的样品制备步骤。此外，贯穿整个 方法在相同反应混合物内加工定量标准核酸。它必须在存在或没有靶核酸的 这两种情况中都直接或间接地生成可检测的信号。出于此目的，在每种测试 中必须仔细优化定量标准核酸的浓度，以便不干扰灵敏度，而且例如在非常 高的靶物浓度也生成可检测的信号。就相应测定法的检测限(LOD，见下文) 而言，优选地，“定量标准核酸”的浓度范围是20-5000倍LOD，更优选地 20-1000倍LOD，最优选地20-5000倍LOD。反应混合物中定量标准核酸的终 浓度取决于实现的定量测量范围。定量标准核酸可以是例如DNA、RNA或 PNA、装甲(armored)DNA或RNA及其经修饰形式。
“检测限”或“LOD”意指样品中可检测的最低核酸量或浓度。低“LOD” 对应于高灵敏度，反之亦然。“LOD”通常依靠单位“cp/ml”(特别是在核酸 是病毒核酸时)，或者以IU/ml表示。“cp/ml”意指“每毫升的拷贝”，其中“拷 贝”是相应核酸的拷贝。IU/ml代表“国际单位/ml”，指WHO标准。
一种用于计算LOD的广泛使用的方法是“Probit(概率单位)分析”，其是 一种分析刺激物(剂量)和可数性(quantal)(全有或全无)响应之间关系的方法。 在典型的可数性响应实验中，对动物组给予不同剂量的药物。记录每个剂量 水平的百分比濒死。然后，可以使用Probit分析来分析这些数据。Probit模型 假定百分比响应与对数剂量的关系呈累积正态分布。也就是说，可以使用对 数剂量作为变量来从累积法线(cumulative normal)中读出百分比濒死。使用正 态分布而不是其它概率分布，影响在可能的剂量的高和低末端处的预测响应 率，但是接近中间具有很少的影响。
Probit分析可以以独特的“命中率”应用。如本领域中已知的，“命中率” 通常以百分比[%]表示，并且指示在特定浓度的分析物时阳性结果的百分比。 因此例如，LOD可以以95%命中率测定，这意味着对95%有效结果呈阳性的 背景计算LOD。
在一个优选的实施方案中，依照本发明的方法提供1-100cp/ml或0.5-50 IU/ml，更优选地1-75cp/ml或0.5-30IU/ml，更优选地1-25cp/ml或1-20IU/ml 的LOD。
就来自某些病毒的可能的靶核酸的一些例子而言，优选地，依照本发明 的方法提供下列LOD：
·HIV：多至60cp/ml，更优选地多至50cp/ml，更优选地多至40cp/ml， 更优选地多至30cp/ml，更优选地多至20cp/ml，更优选地多至15cp/ml
·HBV：多至10IU/ml，更优选地多至7.5IU/ml，更优选地多至5IU/ml
·HCV：多至10IU/ml，更优选地多至7.5IU/ml，更优选地多至5IU/ml
·WNV I：多至20cp/ml，更优选地多至15cp/ml，更优选地多至10cp/ml ·WNV II：多至20cp/ml，更优选地多至15cp/ml，更优选地多至10cp/ml， 更优选地多至5cp/ml
·JEV：多至100cp/ml，更优选地多至75cp/ml，更优选地多至50cp/ml， 更优选地多至30cp/ml
·SLEV：多至100cp/ml，更优选地多至75cp/ml，更优选地多至50cp/ml， 更优选地多至25cp/ml，更优选地多至10cp/ml。
在下文中描述了如何基于定量标准核酸在TaqMan形式中实施定量结果 计算的例子：从来自整个PCR运行的、经仪器校正的荧光值的输入数据计算 滴度。含有靶核酸和充当定量标准核酸的对照核酸的一组样品在使用规定温 度概况的热循环仪上经历PCR。在PCR概况期间的选定温度和时间，通过过 滤光照明样品，并且对每份样品针对靶核酸和定量标准核酸收集过滤荧光数 据。在完成PCR运行后，处理荧光读数以产生定量标准核酸的一组染料浓度 数据和靶核酸的一组染料浓度数据。以相同方式处理每组染料浓度数据。在 数次似真性检查后，对定量标准核酸和靶核酸计算肘值(elbow value)(CT)。 肘值定义为靶核酸或定量标准核酸的荧光与预定阈值(荧光浓度)相交的点。 滴度测定基于如下的假定，即靶核酸和定量标准核酸以相同的效率扩增，且 在计算的肘值，扩增并检测相等量的靶核酸和定量标准核酸扩增子拷贝数。 因此，(CTQS–CT靶物)对对数(靶物浓度/QS浓度)呈线性，其中“QS”代表 内部定量标准核酸。然后，可以例如通过使用如下述等式中的多项式校正式 计算滴度T：
T’=10(a(CTQS–CT靶物)2+b(CTQS–CT靶物)+c)
已知多项式常数和定量标准核酸的浓度，因此该等式中唯一的变量是差 (CTQS–CT靶物)。
在仅检测流体样品中靶核酸的存在或缺乏外，测定所述核酸的量也经常 是重要的。举例而言，病毒性疾病的阶段和严重性可以基于病毒载量评估。 此外，任何疗法的监测需要关于个体中存在的病原体量的信息以估计疗法的 成功与否。
考虑上文提及的内容，本发明的一个优选的方面是上文所描述的方法， 其进一步包括在步骤f.后测定靶核酸的量的步骤。
此外，在本发明的意义中，一种或多种对照核酸可以充当“定性内部对 照核酸”。“定性内部对照核酸”对于确定定性检测测定法的测试结果的有效 性是特别有用的：即使在阴性结果的情况中，也必须检测出定性内部对照， 否则认为该测试自身是无效的。然而，在定性设置中，在阳性结果的情况中 没有必要必须检出定性内部对照。因此，它的浓度必须相对较低。必须注意 使其适应相应的测定法及其灵敏度。优选地，定性内部核酸，即第二对照核 酸的浓度范围会包含每个反应1个拷贝至每个反应1000个拷贝的范围。就相 应测定法的检测限(LOD)而言，优选地，其浓度在测定法的LOD和LOD的25 倍数值之间，更优选地在LOD和10倍LOD之间。更优选地，其在2倍和10倍 LOD之间。甚至更优选地，其在5倍和10倍LOD之间。最优选地，其为5倍或 10倍LOD。
上文所描述的结果可以是掺杂的，并且例如包括假阳性(在与来自与流 体样品不同的来源的核酸交叉污染的情况中)。特别地，前者实验的扩增物 可以促成这类不期望的效果。一种用于使核酸扩增的交叉污染的效应最小化 的具体方法记载于美国专利号5,035,996中。该方法牵涉将非常规的核苷酸碱 基诸如dUTP引入扩增产物中，并将遗留产物暴露于酶和/或物理化学处理以 使产物DNA不能充当后续扩增的模板。用于这类处理的酶是本领域中已知 的。例如，尿嘧啶DNA糖基化酶(也称为尿嘧啶-N-糖基化酶或UNG)会从含 有所述碱基的PCR产物中除去尿嘧啶残基。酶处理导致对污染性遗留PCR产 物的降解，并且用来使扩增反应“绝育”。
因此，本发明的一个优选的方面是上文所描述的方法，其在步骤d.和步 骤e.之间进一步包括下列步骤
·在一定条件下用酶处理流体样品，其中酶促降解来自自其它样品扩增交 叉污染性核酸的产物；
·将所述酶失活。
优选地，所述酶是尿嘧啶-N-糖基化酶。
在依照本发明的方法中，优选的是所有步骤都是自动化的。“自动化” 意味着方法的步骤适合于用仪器或机器实施，所述仪器或机器能够在很少或 没有人为外部控制或影响的情况中运行。仅可能必须手动完成该方法的制备 步骤，例如必须将贮存容器充满并放好位置，样品的选择必须人为实施以及 本领域技术人员已知的其它步骤，例如控制计算机的操作。仪器或机器可以 例如自动添加液体，混合样品或于特定温度实施温育步骤。典型地，这类机 器或仪器是由计算机控制的机器人，该计算机实施规定单一步骤和命令的程 序。
本发明的另一个方面是用于分离和同时扩增可能存在于流体样品中的 至少两种靶核酸的分析系统(440)，所述分析系统包含下列模块：
·包含固体支持材料的分离站(230)，所述分离站构建并排列为分离并纯化 流体样品中包含的靶核酸
·包含至少两个反应容器的扩增站(405)，所述反应容器包含扩增试剂、在 至少第一反应容器中的至少第一纯化的靶核酸和在至少第二反应容器 中的至少第二纯化的靶核酸(其中所述第二靶核酸不存在于所述第一反 应容器中)，以及具有逆转录酶活性的聚合酶，所述聚合酶相对于相应 的野生型聚合酶进一步包含如下的突变，该突变赋予改善的核酸延伸速 率和/或改善的逆转录酶活性。
“分析系统”是以分析给定的样品为最终目的，彼此相互作用的组件诸 如仪器的排列。
本发明的分析系统(440，图11)是包含用于分离和/或纯化分析物的模块 (401)的系统(440)。此外，系统(440)另外包含用于分析所述分析物以获得可 检测信号的模块(403)。可以在相同模块(401、402、403)中或者备选地在分 开模块中检测可检测信号。如本文中使用的，术语“模块”指分析仪(400) 内的任何空间限定位置。两个模块(401、403)可以以壁分开，或者可以处于 开放关系。任一个模块(401、402、403)可以自主控制，或者模块(401、402、 403)的控制可以与其它模块共享。优选地，中央控制所有模块。模块(401、 402、403)间的转移可以是手动的，但是优选是自动的。因此，本发明涵盖 自动化分析仪(400)的许多不同实施方案。
“分离站”在上文有描述。
“扩增站”包含用于温育至少两个反应容器的内容物的温度受控型恒温 箱。其进一步包含多个反应容器如管或板，其中发生用于样品分析的反应诸 如PCR。这类容器的外部界限或壁是化学惰性的，使得其不干扰之内发生的 扩增反应。为了易于操作并促进自动化，优选的是，将至少两个反应容器在 整体排列中组合，因此可以对它们一起操作。
因此，本发明的一个优选的方面是上文描述的分析系统，其中所述至少 两个反应容器在整体排列中组合。
整体排列可以是例如可逆或不可逆地彼此附着或在架中排列的管形瓶 或管。优选地，所述整体排列是多孔板。
优选地，所述多孔板在固定站(holding station)中容纳。在一个更优选的 实施方案中，一个输送装置将多孔容器从固定站运输到气锁(air-lock)(460)， 而第二输送装置将所述多孔板从所述气锁运输到所述扩增站，其中这两个输 送装置通过形式锁定相互作用与所述多孔板相互作用。
在一个优选的实施方案中，分析系统是全自动化的。
在一个实施方案中，在系统的各站间运输整体排列中组合的至少两个反 应容器。
在第二个实施方案中，将纯化的靶核酸从所述分离站转移到所述扩增 站。优选地，用包含附着有移液管尖端的移液管的移液器转移包含纯化的核 酸的液体。
在第三个实施方案中，将纯化的核酸从所述分离站转移到固定站中容纳 的整体排列中的反应容器。优选地，然后，将整体排列中的所述反应容器从 所述固定站转移到所述扩增站。
优选地，依照本发明的分析系统进一步包含移液单元。所述移液单元包 含至少一个移液管，优选地多个移液管。在一个优选的实施方案中，所述多 个移液管在一个或多个整体排列中组合，优选地，在所述整体排列内可以个 别操作移液管。优选地，在本发明的上下文中使用的移液管是包含移液管尖 端的移液管，如上文描述的。在另一个优选的实施方案中，所述移液管是移 液针。
或者，可以将用于分离站中样品制备并含有包含纯化的靶核酸的流体的 反应容器或反应容器排列从分离站转移到扩增站。
为此目的，优选地，依照本发明的分析系统进一步包含转移单元，优选 地，所述转移单元包含机器人装置，优选地，所述装置包含输送装置。
出于上文在依照本发明的方法的背景中提出的原因，以下是本发明进一 步优选的方面：
·上文描述的分析系统(440)，其中至少一个反应容器包含RNA靶核酸和 DNA靶核酸。
·上文描述的分析系统(440)，其中至少一个反应容器包含RNA靶核酸，而 至少一个另一反应容器包含DNA靶核酸。
优选地，上文描述的分析系统(440)进一步包含一个或多个选自下组的元 件：
·用于检测由分析物引起的信号的检测模块(403)
·密封器(410)
·用于试剂和/或一次性用品的贮存模块(1008)。
·用于控制系统组件的控制单元(1006)。
“检测模块”(403)可以例如是用于检测扩增规程结果或效果的光学检测 单元。光学检测单元可以包含光源，例如氙气灯，用于引导和过滤光的光学 镜诸如镜、透镜、光学滤光片、纤维光学镜，一个或多个参照通道，或CCD 照相机或不同的照相机。
“密封器”(410)构建并排列为密封与依照本发明的分析系统结合使用的 任何容器。这类密封器可以例如用合适的盖密封管，或用箔或其它合适的密 封材料密封多孔板。
“贮存模块”(1008)贮存对于引起对分析流体样品重要的化学或生物学 反应必需的试剂。其还可以包含对本发明的方法有用的其它组分，例如一次 性用品诸如移液管尖端或在分离站和/或扩增站内要用作反应容器的容器。
优选地，依照本发明的分析系统进一步包含用于控制系统组件的控制单 元。
这类“控制单元”(1006)可以包含用于确保所述分析系统的不同组件正 确且以正确的时机工作并相互作用(例如以协调方式移动并操作组件诸如移 液管)的软件。控制单元还可以包含运行实时操作系统(RTOS)(其是意图用于 实时应用的多任务操作系统)的处理器。换言之，该系统处理器能够管理实 时约束，即从事件到系统应答的操作最后期限(与系统加载无关)。其以实时 控制系统内的不同单元依照给定的指令正确运行并应答。
在一个优选的实施方案中，本发明涉及用于处理分析物的分析系统 (440)，其包含
a.第一位置，该第一位置包含以线性排列且包含流体样品(1010)的第一 接受器(receptacle)(1001)、包含以nxm排列且用于容纳流体样品(1011)的接受 器(103)的加工板(101)、包含线性排列的至少两个移液单元(702)的第一移液 装置(700)(其中所述移液单元(702)与移液管尖端(3、4)偶联)、以及包含以 ax(nxm)排列的移液管尖端(3、4)的尖端架(70)；
b.第二位置，该第二位置包含用于所述加工板(101)的固定器(201、128)、 用于多孔板的固定器(330)、用于所述尖端架(70)的固定器(470)和第二移液装 置(35)，所述第二移液装置(35)包含以nxm排列且与移液尖端(3、4)偶联的移 液单元(702)(图12)。如本文中使用的，术语“固定器”指任何能够接受架或 加工板的排列。
本发明的分析系统(440)的优点如上文对本发明的方法所描述的。
优选地，第一移液装置(700)的所述移液单元(702)的位置是可变的。所 述第一移液装置(700)的优选实施方案在下文中进行描述。
在一个实施方案中，所述尖端架(70)包含以ax(nxm)排列的移液管尖端 (3、4)。优选地，尖端架(70)中包含第一类(4)和第二类(3)移液管尖端。在此 实施方案中，第一类移液管尖端(4)以nxm排列形式排列，而第二类移液管尖 端(3)以nxm排列形式排列。在此背景中，“n”指行数，而m指列数，其中优 选地，n是6，且优选地，m是8。更优选地，第一类移液管尖端(4)与第二类 移液管尖端(3)具有不同体积，最优选地，第一类移液管尖端(4)的体积超过 500ul，而第二类移液管尖端(3)的体积小于500ul。在此实施方案中，a=2。然 而，本发明中还包括具有超过两类移液管尖端，并且因此a>2的本发明实施 方案。
在一个方面，本发明的分析系统(440)包含用于向所述加工板(101)各个 位置分配样品类型和各个测试的控制单元(1006)。优选地，所述位置是分开 的室(401、402)。
在本发明的一个方面，所述系统另外包含转移系统(480)，其用于在所述 第一(402)和第二(401)位置之间转移所述加工板(101)和所述架(70)。所述转移 系统(480)的优选实施方案是传送带，或更优选地，一个或多个输送装置。
此外，优选地，所述第二移液装置(35)的所述移液管单元与在第一位置 (402)中使用的移液管尖端(3、4)衔接。
另外，本发明的系统(440)的一个优选实施方案包含第三站(403)，所述 第三站包含温度受控型温育箱，其用于将所述分析物与获得可检测信号必需 的试剂一起温育。此系统的进一步优选的实施方案在下文中描述。
用第一处理器(1004)和第二处理器(1005)对nxm排列实现样品和测试定 位的更加优化控制，所述第一处理器(1004)包含在所述第一位置(402)中且所 述控制单元(1006)对其转移指令，该指令关于将样品类型和各个测试分配到 加工板(101)的nxm排列的容器(103)中的特定位置，所述第二处理器(1005)包 含在所述第二位置(401)中且所述控制单元(1006)对其转移指令，该指令关于 将样品类型和各个测试分配到加工板的nxm排列的容器(103)中的特定位置。
优选地，另外，所述系统包含位于所述第一位置中的第一处理器，和位 于所述第二位置中的第二处理器。
更优选地，所述第一处理器(1004)控制所述第一移液装置(700)，而所述 第二处理器(1005)控制所述第二移液装置(35)。
依照本发明的分析系统的所有其它优选实施方案和实施方案的具体描 述是那些对依照本发明的方法提述的。
附图简述
图1：
如本发明的一个实施方案中使用的样品制备工作流的示意图。
朝下的箭表示向上文提及的深孔板的每个相应孔添加组分或试剂，朝上 的箭表示其相应的除去。这些动作在步骤2、3、4、21和22中手动实施，在 步骤10、14、16、18和24中通过装置的加工头(process head)实施，以及在步 骤5、6、7、11、15和19中通过装置的试剂头(reagent head)实施。
必须理解的是，可以在本发明的精神内灵活调节使用的体积，优选地， 至少约多至公开值的30%。具体地，在步骤2的情况中，优选地，样品体积 是可变的，从而考虑到不同类型的流体样品，其可以需要或多或少的起始材 料来获得正确的结果，如技术人员已知的。优选地，范围是约100ul至约850ul。 更优选地，其是约100ul、约500ul或约850ul。优选地，在步骤3中用稀释剂 将相应容器中的体积调节至相同总体积。优选地，如在图1中显示的方案中， 总体积合计多至约850ul。
图2：
如实施例1中描述的，在LightCycler480(Roche Diagnostics GmbH, Mannheim,DE)上实施扩增自HIV、HBV和CT衍生的靶核酸的增长曲线。y 轴上标示的“信号”是标准化的荧光信号。x轴显示相应PCR循环的数目。
与相应的内部对照核酸的增长曲线一起显示HIV和HBV的增长曲线。相 应的靶核酸曲线以直线表示，对照核酸曲线以点线表示。
图2a：定性HIV测定法，其在用于检测靶探针的通道中测量。
图2b：定性HIV测定法，其在用于检测对照探针的通道中测量。
图2c：定量HIV测定法，其在用于检测靶探针的通道中测量。
图2d：定量HIV测定法，其在用于检测对照探针的通道中测量。
图2e：定量HBV测定法，其在用于检测靶探针的通道中测量。
图2f：定量HBV测定法，其在用于检测对照探针的通道中测量。
图2g：CT测定法，其在用于检测靶探针的通道中测量。
图3：
加工板的透视图。
图4：
从对角看，加工板的透视图。
图5：
加工板的俯视图。
图6：
沿加工板较长侧的横截面视图。
图7：
横截面视图的局部视图。
图8：
加工板较长侧的透视图。
图9：
a)至d)显示磁性分离站的第二个实施方案的不同视图。
图10：
(a)至(c)显示容纳加工板的磁性分离站的第一个实施方案的视图，第一类 磁体在最高的Z位置中，而第二类磁体在最低的Z位置中。
图11：
包含不同站、模块或室的分析仪的示意图。
图12：
显示本发明的分析系统。
图13：
依照实施例2中的数据，EDTA血浆中定量HBV测定法的线性。
图14：
依照实施例2中的数据，血清中定量HBV测定法的线性。
图15：
依照实施例2中的数据，EDTA血浆中定量HCV测定法的线性。
图16：
依照实施例2中的数据，血清中定量HCV测定法的线性。
图17：
依照实施例2中的数据，EDTA血浆中定量HIV测定法的线性。
实施例
以下实施例描述了可以运行本发明的实施方案。本领域技术人员清楚的 是，这些实施例并非限制性的，并且可以在不背离本发明的精神的情况中修 改。
实施例1：
本实施例描述了一种用于分离和同时扩增至少第一和第二靶核酸的方 法，其使用单一通用内部对照核酸。
简言之，在描述的实施方案中，对一组数种不同靶物同时且在相同条件 下实施实时PCR，所述靶物包含细菌(沙眼衣原体，CT)以及DNA病毒(HBV) 和RNA病毒(HIV)。所有样品分别在同一实验内，即在同一深孔板(用于样品 制备)或多孔板(用于扩增和检测)上加工并分析。
制备下列样品，随后分析：
熟练技术人员可获得合适的标准品或其它类型的靶物。
依照相应制造商的用法说明书使用下表中列出的仪器：
仪器 制造商 Hamilton Star Hamilton Medical AG(Bonaduz,CH) Light Cycler480 Roche Diagnostics GmbH(Mannheim,DE) Chameleon密封器 K biosystems(Essex,UK) 压缩器 K biosystems(Essex,UK)
对于样品制备，使用下列试剂作为稀释剂：
试剂 制造商： PreservCyt Thin Prep K3EDTA血浆，PCR阴性 Roche
预先制备下列稀释物，并贮存过夜(血浆稀释物于-60至-90°C，PreservCyt 稀释物于2-8°C)：
将每份相应的样品(500ul)和每份相应的标本稀释剂(350ul)手动移液入 深孔板中，其中将每份样品添加至三个不同的孔，用于一式三份分析。对每 个含有HIV或HBV样品的孔，手动添加50ul内部对照核酸。对于定性HIV测 定法，添加充当定性对照的RNA(100个装甲颗粒/样品)。对于定量HIV测定 法，添加充当定量标准品的RNA(500个装甲颗粒/样品)。对于定量HBV测定 法，添加充当定量标准品的DNA(1E4个拷贝/样品)。所述对照核酸的序列在 所有情况中是相同的，并且选自SEQ ID NO45-48的组。
将相应的对照核酸在下列缓冲液中贮存：
IC/IQS–贮存缓冲液 浓度或pH Tris(mM) 10 EDTA(mM) 0.1
叠氮化钠(w/v,%) 0.05 多聚rA RNA(mg/l) 20 pH 8
遵循依照图1中描述的方案的工作流并使用下列试剂在Hamilton Star (Hamilton,Bonaduz,CH)上实施样品制备：
蛋白酶试剂 浓度或pH Tris(mM) 10 EDTA(mM) 1 氯化钙(mM) 5 醋酸钙(mM) 5 Esperase(mg/ml) 80 甘油(w/v,%) 50 pH 5.5
MGP试剂 浓度或pH MPG粉末(mg/ml) 60 Tris(mM) 30 对羟基苯甲酸甲酯(w/v,%) 0.1 叠氮化钠(w/v,%) 0.095 pH 8.5
裂解试剂 浓度或pH 硫氰酸胍(M) 4 柠檬酸钠(mM) 50 聚多卡醇(w/v,%) 5 二硫苏糖醇(w/v,%) 2 pH 5.8
清洗缓冲液 浓度或pH 柠檬酸钠(mM) 7.5
对羟基苯甲酸甲酯(w/v,%) 0.1 pH 4.1
洗脱缓冲液 浓度或pH Tris(mM) 30 对羟基苯甲酸甲酯(w/v,%) 0.2 pH 8.5
在最终步骤后，Hamilton Star装置的加工头将含有扩增试剂的相应主混 合物(mastermix)(Mmx)添加至每孔，将含有分离的核酸的流体与Mmx混合， 并将每种所得的混合物转移到实施扩增的深孔板的相应孔。
使用下列主混合物(各由两种试剂R1和R2组成)：
对于HIV：
R1试剂 浓度/50μl-PCR[μM] 水(PCR级) Mn(Ac)2*4H2O(用乙酸调节为pH6.1) 3’000 NaN3/Ri，用10mM Tris(pH7)缓冲[%] 0.018 R2试剂 浓度/50μl-PCR[μM] DMSO[%] 5.000% NaN3/Ri，用10mM Tris(pH7)缓冲[%] 0.027% 乙酸钾pH7.0 110’000 甘油[%] 3.000% Tricine pH8.0 50’000 Igepal[%] 0.024% dGTP 337.5 dATP 337.5 dCTP 337.5 dUTP 675 选自SEQ ID NO1-35的引物/探针 0.1-0.15 SEQ ID NO42 0.1
SEQ ID NO43 0.1 SEQ ID NO44 0.1 尿嘧啶-N-糖基化酶 10(U/反应) Z05-D聚合酶 40(U/反应) NTQ21-46A–适体 0.222 水
对于HBV：
H2O 100 % MgOAc 2.5 mM MnOAc pH6.1 2.5 mM 叠氮化钠 0.018 %(m/v)
对于CT：
R1试剂 浓度/50μl-PCR 水(PCR级) Mn(Ac)2(在0.002%(V/V)冰醋酸中pH6.5) 2.7mM NaN3 0.0135%(W/V) R2试剂 浓度/50μl-PCR NaN3/Ri，用10mM Tris(pH7)缓冲[%] 0.0315% 乙酸钾 112.4mM 甘油[%] 3.5% Tricine 61mM 氢氧化钾 28.4mM dGTP 525uM dATP 525uM dCTP 525uM dUTP 1.05mM SEQ ID NO39 750nM SEQ ID NO40 600nM SEQ ID NO41 116nM 适体NTQ-46A 175nM 尿嘧啶-N-糖基化酶 5U/反应 Z05-D聚合酶 31U/反应
对于扩增和检测，将微孔板用自动化板密封器(见上文)密封，并将板转 移到LightCycler480(见上文)。
使用下列PCR概况：
热循环概况
检测形式(手动)
预PCR程序包含起始变性和于55、60和65°C温育以逆转录RNA模板。于 三个温度温育组合如下的有利效果，即于较低的温度，也转录略有错配的靶 序列(诸如生物体的遗传变体)，而于较高的温度，抑制RNA二级结构的形成， 如此导致更有效的转录。
将PCR循环分成两次测量，其中两次测量都应用一步设置(组合退火和延 伸)。于55°C的前5个循环通过预扩增略有错配的靶序列允许升高的包容性， 而第二次测量的45个循环通过使用58°C的退火/延伸温度提供升高的特异 性。
对上文提及的微孔板上包含的所有样品使用此概况，在所有样品中都实 现了扩增和检测，如图2中描绘的。这显示也成功实施了扩增前的样品制备。
为了清楚，在图2中分开描绘了定性和定量HIV内部对照以及定量HBV 内部对照的结果。可以看到的是，在所有情况中也成功扩增了对照。通过与 充当定量标准的内部对照核酸比较来计算定量设置中HIV和HBV靶物的定 量。
实施例2：
在分开的实验中，但在相同的条件下对多种不同靶核酸实施上文中描述 的通用扩增方法。如在实施例1下描述的，实施相应核酸的分离。
相应的通用内部对照核酸选自SEQ ID NO45-49，并且是装甲RNA(对于 RNA靶物)和λ包装的DNA(对于DNA靶物)。对于定性RNA测定法，每份样品 添加300个颗粒，对于定量RNA测定法，每份样品添加3000个颗粒，而对于 所有DNA测定法，每份样品添加500个颗粒。
对所有靶物使用下列PCR概况：
名称 循环 预PCR 1 第一次测量 5 第二次测量 45 冷却 1
详细地，实施以下实验：
1.对HBV、HCV和HIV的定性多重分析
a.主混合物
R1：
50ul-PCR中的浓度(uM) Mn(Ac)2*4H2O(用乙酸调节为pH6.1) 3’300 NaN3/Ri，用10mM Tris(pH7)缓冲 0.018 pH：6.41
R2：
试剂 50ul-PCR中的浓度(uM) DMSO(%) 5.4 NaN3/Ri，用10mM Tris(pH7)缓冲 0.027 KOAc(pH7.0) 120’000 甘油(%) 3 Tween20(%) 0.015 Tricine pH8.0 60’000 NTQ21-46A–适体 0.2222 尿嘧啶-N-糖基化酶(U/uL) 0.2 dGTP 400.0 dATP 400.0 dCTP 400.0 dUTP 800.0 ZO5-D聚合酶(U/ul)* 0.9 选自SEQ ID NO1-35的引物/探针 0.125-0.3 SEQ ID NO36 0.100 SEQ ID NO37 0.100 SEQ ID NO38 0.150 选自SEQ ID NO60-76的引物/探针 0.050-0.250 SEQ ID NO42 0.200 SEQ ID NO43 0.200
SEQ ID NO44 0.100
分析灵敏度/LOD
对于每种检测的病毒(HIV-1M组、HIV-1O组、HIV-2、HBV和HCV)， 对于EDTA-血浆，于处于预期LOD及其左右的数个浓度/水平。以每个浓度至 少20个有效重复，每个病毒和浓度测试一个组。通过Probit分析测定LOD(参 见表1-5)。
HIV
表1：来自单个组的HIV-1M组命中率和Probit LOD
将HIV-1M组的WHO标准的滴度转化为IU/mL。
因此，HIV-1M组LOD(以IU/mL计)是
通过Probit分析(95%命中率)得到的LOD：6.77IU/mL
通过Probit分析得到的LOD的95%置信区间：4.75-15.4IU/mL
表2：来自单个组的HIV-1O组命中率和Probit LOD
将HIV-1O组的一级标准品的滴度再分配给CBER HIV-1O组的组；计算 因子是0.586。
因此，HIV-1O组LOD是
通过Probit分析(95%命中率)得到的LOD：8.8cp/mL
通过Probit分析得到的LOD的95%置信区间：6.4-18.5cp/mL
表3：来自单个组的HIV-2命中率和Probit LOD
将HIV-2的一级标准品的滴度再分配给CBER HIV-2组；计算因子是26.7。
因此，HIV-2LOD是
通过Probit分析(95%命中率)得到的LOD：34.44cp/mL
通过Probit分析得到的LOD的95%置信区间：21.89-83.04cp/mL
HBV
表4：来自单个组的HBV命中率和Probit LOD
HCV
表5：来自单个组的HCV命中率和Probit LOD
2.对WNV的定性分析
主混合物
R1：
试剂 50ul-PCR中的浓度(uM) Mn(Ac)2*4H2O(用乙酸调节为pH6.1) 3’300 NaN3/Ri，用10mM Tris(pH7)缓冲 0.018
pH：6.41
R2：
试剂 50ul-PCR中的浓度(uM) DMSO(%) 5.4 NaN3/Ri，用10mM Tris(pH7)缓冲 0.027 乙酸钾pH7.0 120’000 甘油(%) 3 Tween20(%) 0.015 Tricine pH8.0 60’000 NTQ21-46A-适体 0.2222 尿嘧啶-N-糖基化酶(U/uL) 0.2 dGTP 400.0 dATP 400.0 dCTP 400.0 dUTP 800.0 ZO5-D聚合酶(U/ul)* 0.9 选自SEQ ID NO53-59的引物/探针 0.08-0.4 SEQ ID NO42 0.150 SEQ ID NO43 0.150 SEQ ID NO44 0.100
分析灵敏度/LOD
对于病毒(WNV、SLEV和JEV)，以相应标准品的稀释系列制备独立组， 包括处于预期LOD及其左右的数种浓度/水平。以每个浓度至少20个有效重 复，每个病毒和浓度测试一个组。通过Probit分析测定LOD。
表6：来自单个组的WNV命中率和Probit LOD
表7：来自单个组的SLEV命中率和Probit LOD
表8：来自单个组的JEV命中率和Probit LOD
3.对HBV的定量分析
主混合物
R1：
试剂 50ul-PCR中的终浓度(uM) Mn(Ac)2*4H2O(用乙酸调节为pH6.1) 3’300 NaN3/Ri，用10mM Tris(pH7)缓冲 0.018 pH：6.41
R2：
试剂 50ul-PCR中的终浓度(uM) 甘油(%,w/v) 3% Tricine 60mM DMSO(%,v/v) 5.4% KOAc 120mM Tween20(v/v) 0.015% 适体NTQ21-46A 0.222μM ZO5D聚合酶 0.9U/μL(45U/rxn) 尿嘧啶-N-糖基化酶 0.2U/μL(10U/rxn) 叠氮化钠(w/v) 0.027% dCTP 400μM dGTP 400μM dATP 400μM dUTP 800μM SEQ ID NO36 1.2μM SEQ ID NO37 1.2μM SEQ ID NO50 0.6μM SEQ ID NO51 0.6μM SEQ ID NO38 0.1μM SEQ ID NO52 M
分析灵敏度/LOD
用HBV二级标准品(代表基因型A)制备四个稀释组，即在HBV阴性血清 中两个(对于200μL和500μL的样品输入体积)，以及在HBV阴性EDTA-血浆中 两个(对于200μL和500μL的样品输入体积)。每组包括处于预期LOD及其左右 的7个浓度水平。以每个浓度水平≥21个重复，每个基质测试一个组。至少20 个重复需要是有效的。通过于95%命中率的Probit分析以及通过≥95%命中率 分析测定LOD。
表9：对EDTA血浆中200μL输入体积的LOD分析。*
*测试额外的重复以使观察到的95%置信区间变窄。
表10：对EDTA血浆中500μL输入体积的LOD分析
表11：对血清中200μL输入体积的LOD分析
表12：对血清中500μL输入体积的LOD分析
汇总的LOD：
EDTA-血浆：对于EDTA血浆，于95%命中率的Probit分析产生8.2IU/mL (对于200μL样品输入体积)和2.3IU/mL(对于500μL样品输入体积)的LOD。
这些浓度的95%置信区间范围是4.8-26.0IU/mL(对于200μL样品输入体 积)和1.6-4.2IU/mL(对于500μL样品输入体积)。
血清：对于血清，于95%命中率的Probit分析产生9.02IU/mL(对于200μL 样品输入体积)和4.1IU/mL(对于500μL样品输入体积)的LOD。
这些浓度的95%置信区间范围是6.2-19.0IU/mL(对于200μL样品输入体 积)和2.4-10.0IU/mL(对于500μL样品输入体积)。
线性
通过使用HBV基因型A(由RMD Research Pleasanton提供，线性化质粒， pHBV-PC_ADW2)制备一个EDTA血浆组和一个血清组。以12个浓度水平分 析每组以测定测定法的预期动力学范围(4-2E+09IU/mL)。所有浓度水平/组 成员(PM)都以21个重复测试。
用500μL样品输入体积完成此研究。如下选择浓度水平：一个水平低于 预期的定量下限(LLOQ)，一个处于预期的LLOQ，一个高于预期的LLOQ， 数个浓度处于中间水平，处于预期的定量上限(ULOQ)，而一个高于预期的 ULOQ：
PM12-2.0E+09IU/mL-高于预期的ULOQ
PM11-1.0E+09IU/mL-处于预期的ULOQ
PM10-1.0E+08IU/mL-低于预期的ULOQ
PM9-1.0E+07IU/mL-中间浓度水平
PM8-1.0E+06IU/mL-中间浓度水平
PM7-1.0E+05IU/mL-中间浓度水平
PM6-1.0E+04IU/mL-中间浓度水平
PM5-1.0E+03IU/mL-中间浓度水平
PM6a-2.0E+02IU/mL-中间浓度水平(将PM6稀释到2.0E+02IU/mL， 用于血清组的滴度分配)
PM4-1.0E+02IU/mL-中间浓度水平(也用于血浆组的滴度分配)
PM3-5.0E+01IU/mL-高于预期的LLOQ
PM2-1.0E+01IU/mL-处于预期的LLOQ
PM1-4.0E+00IU/mL-低于预期的LLOQ
对于线性组的每份有效样品，将观察到的HBV DNA滴度转化为log10滴 度，并且对每个浓度水平计算均值log10滴度。
表13：EDTA血浆中的线性
在图13中显示了此结果的图形。
表14：血清中的线性
在图14中显示了此结果的图形。
汇总的线性：
线性范围(其定义为均值log10观察到的滴度的log10偏差在log10名义滴 度±0.3内的浓度范围)测定为：对于EDTA-血浆为3.5E+00IU/mL–1.7E+09 IU/mL，而对于血清为3.3E+00IU/mL–1.7E+09IU/mL。发现定量下限为： 对于EDTA-血浆和血清为4.0E+00IU/mL。
4.对HCV的定量分析
主混合物
R1：
试剂 50ul-PCR中的终浓度(uM) Mn(Ac)2*4H2O(用乙酸调节为pH6.1) 3’300 NaN3/Ri，用10mM Tris(pH7)缓冲 0.018 pH：6.41
R2：
试剂 50ul-PCR中的终浓度 甘油(%,w/v) 3% Tricine 60mM DMSO(%,v/v) 5.4% KOAc 120mM 吐温20(v/v) 0.015% NTQ21-46A 0.222μM ZO5D 0.9U/μL(45U/rxn) UNG 0.2U/μL(10U/rxn) 叠氮化钠(w/v) 0.027 dCTP 400μM dGTP 400μM dATP 400μM dUTP 800μM 选自SEQ ID NO60-76的引物/探针 0.1μM SEQ ID NO42 0.3μM SEQ ID NO43 0.3μM SEQ ID NO44 μM
分析灵敏度/ LOD
使用200μL和500μL的样品输入体积，在HCV阴性EDTA血浆和血清中用 Roche HCV二级标准品制备稀释组。以21个重复测试每个浓度水平。至少≥ 20 个重复必须是有效的。通过于95%命中率的Probit分析及通过≥ 95%命中率分 析测定LOD。
表15：在EDTA血浆的200μL样品加工输入体积情况中的命中率和Probit
表16：在EDTA血浆的500μL样品加工输入体积情况中的命中率和Probit
表17：在血清的200μL样品加工输入体积情况中的命中率和Probit
表18：在血清的500μL样品加工输入体积情况中的命中率和Probit
汇总的LOD：
1.对于EDTA血浆，于95%命中率的Probit分析产生17.4IU/mL(对于 200μL样品加工输入体积)和9.0IU/mL(对于500μL样品加工输入体积)的 LOD。这些浓度的95%置信区间是12.1-34.3IU/mL(对于200μL样品加工输入 体积)和5.5-25.4IU/mL(对于500μL样品加工输入体积)。
2.对于血清，于95%命中率的Probit分析值是20.2IU/mL(对于200μL样 品加工输入体积)和8.2IU/mL(对于500μL样品加工输入体积)。这些浓度的 95%置信区间是14.0-39.3IU/mL(对于200μL样品加工输入体积)和5.8-15.0 IU/mL(对于500μL样品加工输入体积)。
线性
分析起源于HCV WHO标准品的HCV aRNA的EDTA-血浆组的制备物和 血清组的制备物。通过连续稀释制备线性组，并在10个不同浓度分析。用 500μL样品加工输入体积完成该研究。如下选择浓度：一个水平低于预期的 量化下限(LLoQ)，一个处于LLoQ，一个高于LLoQ，数个浓度处于中间水平， 处于预期的量化上限(ULoQ)，而一个处于或高于ULoQ。对于所有浓度，测 试21个重复。
PM1-2.0E+08IU/mL-高于预期的ULoQ
PM2-1.0E+08IU/mL-处于预期的ULoQ
PM3-1.0E+07IU/mL-低于预期的ULoQ
PM4-1.0E+06IU/mL-中间浓度水平
PM5-1.0E+05IU/mL-中间浓度水平
PM6-1.0E+04IU/mL-用于滴度分配的中间浓度水平
PM7-1.0E+03IU/mL-中间浓度水平
PM8-1.0E+02IU/mL-高于预期的LLoQ
PM9-1.0E+01IU/mL-处于预期的LLoQ
PM10-8.0E+00IU/mL-低于预期的LLoQ
表19：EDTA血浆中的线性
在图15中显示了此结果的图形。
表20：血清中的线性
在图16中显示了此结果的图形。
汇总的线性：
线性范围(其定义为均值log10观察到的滴度的log10偏差在log10名义滴 度±0.3内的浓度范围)测定为：对于EDTA-血浆为4.87E+00IU/mL–1.22E+08 IU/mL，而对于血清为3.90E+00IU/mL–9.92E+07IU/mL。
5.对HIV的定量分析
主混合物
R1：
试剂 50ul-PCR中的终浓度(uM) Mn(Ac)2*4H2O(用乙酸调节为pH6.1) 3’300 NaN3/Ri，用10mM Tris(pH7)缓冲 0.018 pH：6.41
R2：
试剂 50ul-PCR中的终浓度 甘油(%,w/v) 3%
Tricine 60mM DMSO(%,v/v) 5.4% KOAc 120mM Tween20(v/v) 0.02% 适体NTQ21-46A 0.222μM ZO5D聚合酶 0.9U/μL(45U/rxn) UNG 0.2U/μL(10U/rxn) 叠氮化钠(w/v) 0.027 dCTP 400μM dGTP 400μM dATP 400μM dUTP 800μM 选自SEQ ID NO1-35的引物/探针 0.1μM-0.3μM SEQ ID NO50 0.3μM SEQ ID NO51 0.3μM SEQ ID NO52 μM
分析灵敏度/LOD
对于200μL和500μL样品输入体积，在HIV-1阴性EDTA血浆中用HIV-1M 二级标准品制备稀释组。以21个重复测试每个浓度水平。至少≥20个重复必 须是有效的。通过于95%命中率的Probit分析及通过≥95%命中率分析测定 LOD。
表21：对EDTA-血浆中200μL输入体积的LOD分析
表22：对500μL输入体积的LOD分析
汇总的LOD：
1.于95%命中率的Probit分析产生41.8cp/mL(对于200μL输入体积)和 18.9cp/mL(对于500μL输入体积)的LOD。
2.这些浓度的95%置信区间是30.9-74.9cp/mL(对于200μL输入体积)和 14.9-29.4cp/mL(对于500μL输入体积)。
线性
在线性/动力学范围/准确度研究中使用的样品由HIV-1细胞培养物上清 液材料HIV-1M组B亚型的稀释组组成。
通过连续稀释制备线性组。在10个浓度水平分析此组。
如下选择浓度：一个水平低于预期的定量下限(LLoQ)，一个处于LLoQ， 一个高于LLoQ，数个浓度处于中间水平，处于预期的定量上限(ULoQ)，而 一个高于ULoQ。对于所有浓度，测试21个重复。用500μL输入体积完成该线 性研究：
PM1-2.0E+07cp/mL-高于预期的ULoQ
PM2-1.0E+07cp/mL-处于预期的ULoQ
PM3-1.0E+06cp/mL-低于预期的ULoQ
PM4-1.0E+05cp/mL-中间浓度水平
PM5-3.0E+04cp/mL-用于滴度分配的中间浓度水平
PM6-1.0E+04cp/mL-中间浓度水平
PM7-1.0E+03cp/mL-中间浓度水平
PM8-1.0E+02cp/mL-中间浓度水平
PM9-5.0E+01cp/mL-高于预期的LLoQ
PM10-2.0E+01cp/mL-处于预期的LLoQ
PM11-1.5E+01cp/mL-低于预期的LLoQ
表23：EDTA血浆中的线性
在图17中显示了此结果的图形。
汇总的线性
线性范围(其定义为均值log10观察到的滴度的log10偏差在log10名义滴 度±0.3内的浓度范围)测定为1.5E+01cp/mL–2.0E+07cp/mL。