北冬虫夏草多糖两阶段发酵合成工艺.pdf

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1、(10)授权公告号 CN 102154407 B (45)授权公告日 2014.03.05 CN 102154407 B (21)申请号 201110134499.1 (22)申请日 2011.05.24 C12P 19/04(2006.01) C12R 1/645(2006.01) (73)专利权人 河北科技大学 地址 050018 河北省石家庄市裕华东路 70 号 (72)发明人 崔建东 张思 孙立梅 CN CN1148623 A,1997.04.30, 全文 . 杜晓蒙等 . 培养基成分对冬虫夏草菌生长的 影响及其优化 . 中国酿造 .2011,( 第 3 期 ), 第 73 页第 1 。

2、节 . Qing-Hua Fang 等 .Two-Stage Culture Process for Improved Production of Ganoderic Acid by Liquid Fermentation of Higher Fungus Ganoderma lucidum. Biotechnol. Prog. .2002, 第 18 卷 ( 第 1 期 ), 第 51-54 页 . (54) 发明名称 北冬虫夏草多糖两阶段发酵合成工艺 (57) 摘要 本发明属微生物领域， 具体涉及一种北冬虫 夏草多糖两阶段发酵合成工艺， 本发明将北冬虫 夏草菌种接种在马铃薯斜面培养基上恒温。

3、培养后 接入含种子培养基的三角瓶中震荡培养， 然后接 入含发酵培养基的发酵罐中， 发酵过程如下 ： 恒 温通风搅拌条件下培养北冬虫夏草 4-5 天， 此阶 段主要是提供给适合北冬虫夏草菌体生长的培养 条件， 使北冬虫夏草大量的繁殖 ； 然后在恒温不 通风、 轻微搅拌条件下培养 2-3 天， 将培养液离 心， 获得的上清液中加入两倍体积的乙醇， 搅拌， 4过夜， 再次离心获得的沉淀物经过干燥获得北 冬虫夏草多糖， 本发明工艺设计合理， 操作简单， 适合大规模工业化生产， 能解决药源紧缺的局面， 效益显著。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 王航 权利要求书 2 页 说明书 5 页。

4、 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书2页 说明书5页 (10)授权公告号 CN 102154407 B CN 102154407 B 1/2 页 2 1. 一种北冬虫夏草多糖两阶段发酵合成工艺， 其特征是， 它包括以下步骤 ： a. 保存菌种 ： 将生长在马铃薯斜面培养基的北冬虫夏草菌种保存在 4冰箱中备用 ； b. 斜面菌种活化 ： 将上述步骤 a 中保存的北冬虫夏草菌种用灭菌后的接种铲转接到马铃薯斜面培养基， 在 25恒温箱中培养 7 天， 得到活化后的北冬虫夏草菌种， 备用 ； c.种子培养 ： 将上述步骤b活化后的北冬虫夏草菌种用灭菌的接种钩切1cm2带。

5、培养基 的斜面菌丝转入装有 50mL 种子培养基的 250mL 三角瓶中， 在摇床中 25、 150r/min 震荡培 养 4-5 天， 得到种子液备用 ； 所述种子培养基的营养成分及加入量如下 ： 按上述组分及加入量配成液体的种子培养基， 在 121， 0.1MPa 下加热灭菌 20 分钟后 冷却， 待用 ； d.发酵培养 ： 将上述步骤c培养好的种子液以10接种量接入含发酵培养基的发酵罐 中发酵， 发酵培养过程包括两个阶段 ： 第一阶段发酵条件包括 ： 发酵罐温度 25， 通风量 1vvm， 搅拌转速 100-150rpm， 发酵罐 压 0.05MPa 的条件下培养 4-5 天 ； 第二阶。

6、段发酵条件 ： 发酵罐罐温25， 通风量0vvm(不通气)， 搅拌转速30-50rpm条件 下培养 2-3 天， 得冬虫夏草菌体培养液 ； 所述发酵培养基的营养成分及加入量如下 ： 按上述组分及加入量配成液体的发酵培养基， 在 121， 0.1MPa 下加热灭菌 20 分钟后 冷却， 待用 ； e. 过滤分离菌体 ： 将上述步骤 d 发酵结束后的冬虫夏草菌体培养液用不锈钢板框过滤 机过滤冬虫夏草菌体， 得冬虫夏草菌体和上清液， 过滤收集的冬虫夏草菌体用蒸馏水冲洗 三次， 于 60-70干燥， 冬虫夏草菌体含水量控制在 7-8 ； f. 乙醇醇析 ： 将上述步骤 e 得到的上清液加入两倍体积的 。

7、95的乙醇醇析， 在磁力搅 拌机上以 200r/m 搅拌 30 分钟后， 在 4过夜 ； g.离心干燥 ： 将上述步骤f过夜后的液体进行12000rpm离心， 收集沉淀物， 在70-80 恒温烘箱烘干， 含水量控制在 7-8， 获得干燥的北冬虫夏草多糖 ； h 粉碎储存 ： 将上述步骤 g 干燥后的北冬虫夏草多糖粉碎过筛， 置于通风干燥处储存， 得产品北冬虫夏草多糖。 权 利 要 求 书 CN 102154407 B 2 2/2 页 3 2. 如权利要求 1 所述的一种北冬虫夏草多糖两阶段发酵合成工艺， 其特征是， 所述马铃薯斜面培养基的制备包括 ： 先将 200g 土豆去皮切成小块， 加入水。

8、 1.0L 煮沸 30min， 用 6 层布过滤， 取滤液， 获得马铃薯汁， 然后将制备好的马铃薯汁定容至 1.0L， 在 121灭菌 20 分钟备用 ； 之后再加入葡萄糖 20g 和琼脂 20g， 获得马铃薯斜面培养基。 权 利 要 求 书 CN 102154407 B 3 1/5 页 4 北冬虫夏草多糖两阶段发酵合成工艺 技术领域 0001 本发明涉及人工培养合成北冬虫夏草多糖工艺， 具体就是一种采用生物两阶段发 酵法合成北冬虫夏草多糖的方法。 背景技术 0002 北冬虫夏草菌 Cordyceps militaris( 通称蛹虫草 ) 是鳞翅目蝙蝠蛾科蝠蛾属 幼虫被中国被毛孢寄生后形成的虫。

9、菌复合体， 属国家二级保护的名贵药材， 与人参、 鹿茸并 列为中国的 “中药三大宝” 之一。它含有多种有效成分 ( 如虫草菌丝、 多糖、 虫草素等 )， 具 有增强免疫力、 抗肿瘤、 抗氧化及降血糖的作用， 市场需求极大。 0003 但是， 野生冬虫夏草生长周期过长， 而且由于对野生虫草的滥挖滥采， 不但严重破 坏生态环境， 而且造成天然虫草濒临灭绝。 因此， 必须找出既能满足市场需求又能不破坏野 生虫草资源的有效方法。目前， 对虫草的人工培养方法主要有人工栽培和液体深层培养两 种方法。人工栽培周期长， 获得的虫草产量低， 难以满足生产需求。液体深层培养具有周期 短， 设备利用率高等优点， 更。

10、有利于大规模工业化生产。但主要是生产菌体， 而生物活性物 质 ( 多糖 ) 产量相对较低。因此， 如果能开发一种既能获得大量动冬虫夏草菌体、 又能生产 大量生物活性物质(多糖)的培养方法， 将对于提高虫草生产效率， 开发高附加值的虫草产 品， 实现工业化大规模生产具有重要意义。 发明内容 0004 本发明要解决的技术问题是提供一种北冬虫夏草多糖两阶段发酵合成工艺， 它操 作工艺简单， 适合大规模工业化生产。 0005 为解决上述技术问题， 本发明采用以下技术方案予以实现 ： 0006 本发明一种北冬虫夏草多糖两阶段发酵合成工艺， 它包括以下步骤 ： 0007 a. 保存菌种 ： 将生长在马铃薯。

11、斜面培养基的北冬虫夏草菌种保存在 4冰箱中备 用。 0008 b. 斜面菌种活化 ： 0009 将上述步骤 a 中保存的北冬虫夏草菌种用灭菌后的接种铲转接到马铃薯斜面培 养基， 在 25恒温箱中培养 7 天得到活化后的北冬虫夏草菌种， 备用。 0010 c. 种子培养 ： 将上述步骤 b 活化后的北冬虫夏草菌种用灭菌的接种钩切约 1cm2 带培养基的斜面菌丝转入装有 50mL 种子培养基的 250mL 三角瓶中， 在摇床中 25、 150r/ min 震荡培养 4-5 天， 得到种子液备用。 0011 所述种子培养基的营养成分及加入量如下 ： 0012 说 明 书 CN 102154407 B。

12、 4 2/5 页 5 0013 按上述组分及加入量配成液体的种子培养基， 在 121， 0.1MPa 下加热灭菌 20 分 钟后冷却， 待用。 0014 d.发酵培养 ： 将上述步骤c培养好的种子液以10接种量接入含发酵培养基的发 酵罐中发酵， 发酵培养过程包括两个阶段 ： 0015 第一阶段发酵条件包括 ： 发酵罐温度 25， 通风量 1vvm， 搅拌转速 100-150rpm， 发 酵罐压 0.05MPa 的条件下培养 4-5 天。 0016 第二阶段发酵条件 ： 发酵罐罐温 25， 通风量 0vvm( 不通气 )， 搅拌转速 30-50rpm 条件下培养 2-3 天， 得冬虫夏草菌体培养。

13、液。 0017 所述发酵培养基的营养成分及加入量如下 ： 0018 0019 按上述组分及加入量配成液体的发酵培养基， 在 121， 0.1MPa 下加热灭菌 20 分 钟后冷却， 待用。 0020 e. 过滤分离菌体 ： 将上述步骤 d 发酵结束后的冬虫夏草菌体培养液用不锈钢板框 过滤机过滤冬虫夏草菌体， 得冬虫夏草菌体和上清液， 过滤收集的冬虫夏草菌体用蒸馏水 冲洗三次， 于 60-70干燥， 冬虫夏草菌体含水量控制在 7-8。 0021 f. 乙醇醇析 ： 将上述步骤 e 得到的上清液加入两倍体积的 95的乙醇醇析， 在磁 力搅拌机上以 200r/m 搅拌 30 分钟后， 在 4过夜。 。

14、0022 g. 离心干燥 ： 将上述步骤 f 过夜后的液体进行 12000rpm 离心， 收集沉淀物， 在 70-80恒温烘箱烘干， 含水量控制在 7-8， 获得干燥的北冬虫夏草多糖。 0023 h. 粉碎储存 ： 将上述步骤 g 干燥后的北冬虫夏草多糖粉碎过筛， 置于通风干燥处 储存， 得本发明产品北冬虫夏草多糖。 0024 所述的一种北冬虫夏草多糖两阶段发酵合成工艺， 所述马铃薯斜面培养基的制备 包括 ： 0025 先将 200g 土豆去皮切成小块， 加入水 1.0L 煮沸 30min， 用 6 层布过滤， 取滤液， 获 得马铃薯汁， 然后将制备好的马铃薯汁定容至1.0L， 在121灭菌2。

15、0分钟备用 ； 之后再加入 葡萄糖 20g 和琼脂 20g， 获得马铃薯斜面培养基。 0026 优选的， 所述的一种北冬虫夏草多糖两阶段发酵合成工艺， 0027 所述发酵培养基的营养成分及加入量如下 ： 0028 说 明 书 CN 102154407 B 5 3/5 页 6 0029 优选的， 所述的一种北冬虫夏草多糖两阶段发酵合成工艺， 所述发酵培养过程 中， 种子液以 5接种量接入含发酵培养基的发酵罐中， 发酵培养过程包括两个阶段 ： 第 一阶段发酵条件包括 ： 发酵罐温度 25， 通风量 1vvm， 搅拌转速 100-150rpm， 发酵罐压 0.05MPa 的条件下培养 6-7 天 ；。

16、 第二阶段发酵条件 ： 发酵罐罐温 25， 通风量 0vvm， 搅拌转 速 20-30rpm 条件下培养 1-2 天。 0030 所用北冬虫夏草菌是保藏于 “中国工业微生物菌种保藏管理中心” ， 保藏登记号 为 ： CICC 14015 ； 分类命名 ： Cordyceps militaris。 0031 本发明将北冬虫夏草菌种接种在马铃薯斜面培养基上恒温培养 7 天后接入含种 子培养基的三角瓶中震荡培养 4-5 天。然后接入含发酵培养基的发酵罐中， 发酵过程如下 ： 恒温通风搅拌条件下培养北冬虫夏草 4-5 天， 此阶段主要是提供给适合北冬虫夏草菌体 生长的培养条件， 使北冬虫夏草大量的繁殖。

17、 ； 然后在恒温不通风， 轻微搅拌条件下培养 2-3 天， 此过程是为了使北冬虫夏草大量合成多糖 ； 培养液离心， 获得的上清液中加入两倍体积 的乙醇， 搅拌 4过夜， 再次离心获得的沉淀物经过干燥获得北冬虫夏草多糖。 0032 所用北冬虫夏草菌是斜面菌株特征 ： 在马铃薯斜面培养基上， 培养三天可以见到 白色绒毛状菌体， 培养七天基本长满斜面， 本发明给出的方法所生产的北冬虫夏草多糖药 用价值和营养价值均与天然北冬虫夏草相同， 该工艺可显著缓解对冬虫夏草药用资源紧张 的局面。 0033 本发明与现有技术相比具有的有益效果为 ： 0034 本发明根据北冬虫夏草生长和代谢特征设计了两阶段发酵培养。

18、工艺合成多糖， 利 用本发明工艺既能获得大量北冬虫夏草菌体， 又能够获得高产量的北冬虫夏草多糖。 因此， 本发明的两阶段液体深层发酵工艺合成虫草多糖的效率远高于传统的液体深层发酵工艺。 比传统液体深层培养工艺北冬虫夏草多糖产量提高 75。 0035 此外， 本发明工艺设计合理， 操作简单， 适合大规模工业化生产， 能解决药源紧缺 的局面， 满足市场需求， 效益显著。 具体实施方式 0036 下面对本发明作进一步的详细说明。 0037 实施例一 0038 本发明一种北冬虫夏草多糖两阶段发酵合成工艺， 它包括以下步骤 ： 0039 a. 保存菌种 ： 将生长在马铃薯斜面培养基的北冬虫夏草菌种保存在。

19、 4冰箱中备 用。 0040 b. 斜面菌种活化 ： 说 明 书 CN 102154407 B 6 4/5 页 7 0041 菌种活化 ： 将上述步骤 a 中保存的北冬虫夏草菌种用灭菌后的接种铲转接到马铃 薯斜面培养基， 在 25恒温箱中培养 7 天得到活化后的北冬虫夏草菌种， 备用。 0042 c. 种子培养 ： 将上述步骤 b 活化后的北冬虫夏草菌种用灭菌的接种钩切约 1cm2 带培养基的斜面菌丝转入装有 50mL 种子培养基的 250mL 三角瓶中， 在摇床中 25、 150r/ min 震荡培养 4-5 天， 得到种子液备用。 0043 所述种子培养基的营养成分及加入量如下 ： 004。

20、4 0045 按上述组分及加入量配成液体的种子培养基， 在 121， 0.1MPa 下加热灭菌 20 分 钟后冷却， 待用。 0046 d.发酵培养 ： 将上述步骤c培养好的种子液以10接种量接入含发酵培养基的发 酵罐中发酵， 发酵培养过程包括两个阶段 ： 0047 第一阶段发酵条件包括 ： 发酵罐温度 25， 通风量 1vvm， 搅拌转速 100-150rpm， 发 酵罐压 0.05MPa 的条件下培养 4-5 天。 0048 第二阶段发酵条件 ： 发酵罐罐温 25， 通风量 0vvm( 不通气 )， 搅拌转速 30-50rpm 条件下培养 2-3 天。 0049 所述发酵培养基的营养成分及。

21、加入量如下 ： 0050 0051 0052 按上述组分及加入量配成液体的发酵培养基， 在 121， 0.1MPa 下加热灭菌 20 分 钟后冷却， 待用。 0053 e 过滤分离菌体 ： 将上述步骤 d 发酵结束后的冬虫夏草菌体培养液用不锈钢板框 过滤机 (SHXBCRA150-10C， 上海信步科技有限公司生产的 ) 过滤冬虫夏草菌体， 得冬虫夏草 菌体和上清液， 过滤收集的冬虫夏草菌体用蒸馏水冲洗三次， 于 60-70干燥， 冬虫夏草菌 体含水量控制在 7-8。 0054 f乙醇醇析 ： 将上述步骤e得到的上清液加入两倍体积的95的乙醇醇析， 在磁力 搅拌机上以 200r/m 搅拌 30。

22、 分钟后， 在 4过夜。 0055 g离心干燥 ： 将上述步骤f过夜后的液体进行12000rpm离心(SS600， 12000rpm， 沈 阳化工学院机械厂生产的离心机 )， 收集沉淀物， 在 70-80恒温烘箱烘干， 含水量控制在 7-8， 获得干燥的北冬虫夏草多糖。 0056 h 粉碎储存 ： 上述步骤 g 干燥后的北冬虫夏草多糖粉碎过筛， 置于通风干燥处储 说 明 书 CN 102154407 B 7 5/5 页 8 存， 得本发明产品北冬虫夏草多糖。 0057 实施例 2 0058 本实施例的两阶段发酵培养工艺方法， 与实施例 1 的不同之处在于所述发酵培养 基的营养成分及加入量如下 。

23、： 0059 0060 实施例 3 0061 本实施例的两阶段发酵培养工艺方法， 与实施例 1 的不同之处在于发酵培养过 程中， 种子液以 5接种量接入含发酵培养基的发酵罐中， 发酵培养过程包括两个阶段 ： 第一阶段发酵条件包括 ： 发酵罐温度 25， 通风量 1vvm， 搅拌转速 100-150rpm， 发酵罐压 0.05MPa 的条件下培养 6-7 天 ； 第二阶段发酵条件 ： 发酵罐罐温 25， 通风量 0vvm( 不通 气 )， 搅拌转速 20-30rpm 条件下培养 1-2 天。 0062 本发明与现有技术相比具有的优点为 ： 本发明根据北冬虫夏草生长和代谢特征， 设计建立了两阶段发。

24、酵培养工艺合成北冬虫夏草多糖， 利用本发明工艺既能获得大量北冬 虫夏草菌体， 又能够获得高产量的北冬虫夏草多糖。 在发酵培养过程的第一阶段， 由于通风 和搅拌作用， 发酵液中溶解氧供应充足， 北冬虫夏草菌体生长快， 接菌 4 天后葡萄糖基本被 耗净， 在此阶段， 北冬虫夏草菌体快速生长， 但此北冬虫夏草多糖合成较慢。 在第二阶段， 此 阶段培养基中的葡萄糖被大量消耗， 北冬虫夏草菌体基本进入稳定期， 此时停止通风， 并将 搅拌转速降低， 使发酵液中的溶解氧下降， 北冬虫夏草菌体在此阶段不再生长， 开始大量合 成胞外北冬虫夏草多糖， 而发酵液中低的溶解氧环境又有利于北冬虫夏草多糖的合成， 因 此， 本发明的两阶段液体深层发酵工艺合成北冬虫夏草多糖的效率远高于传统的液体深层 发酵工艺。 比传统液体深层培养工艺北冬虫夏草多糖产量提高75。 本发明与传统液体深 层培养北冬虫夏草多糖工艺比较见下表。 0063 表 1 两阶段液体深层培养北冬虫夏草多糖与传统液体深层培养工艺的比较 0064 说 明 书 CN 102154407 B 8 。