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1、(10)授权公告号 CN 102220366 B (45)授权公告日 2013.12.04 CN 102220366 B *CN102220366B* (21)申请号 201110105392.4 (22)申请日 2011.04.27 C12N 15/75(2006.01) C12R 1/125(2006.01) (73)专利权人 南京农业大学 地址 210095 江苏省南京市卫岗 1 号 (72)发明人 陆兆新 曹国强 吕凤霞 别小妹 张充 钟蕾 (74)专利代理机构 南京经纬专利商标代理有限 公司 32200 代理人 张素卿 Helga Westers, et al.Genome Engi。
2、neering Reveals Large Dispensable Regions in Bacillus subtilis.Mol. Biol. Evol. .2003, 第 20 卷 ( 第 12 期 ),20762090. Guoqiang Cao, et al.A modified electro-transformation method for Bacillus subtilis and its application in the production of antimicrobial lipopeptides. Biotechnol Lett .2011, 第 33 卷 104。
3、71051. Guoqiang Cao, et al.A modified electro-transformation method for Bacillus subtilis and its application in the production of antimicrobial lipopeptides. Biotechnol Lett .2011, 第 33 卷 10471051. Michail M. Yakimov, et al. ComA-Dependent Transcriptional Activation of Lichenysin A Synthetase Promo。
4、ter in Bacillus subtilis cells.Biotechnol. Prog. .1997, 第 13 卷 757-761. (54) 发明名称 通过超量表达 comA 基因提高枯草芽孢杆菌 抗菌肽产量的方法 (57) 摘要 本发明涉及通过超量表达comA基因提高 枯草杆菌抗菌肽产量的方法， 属于生物技术领 域。本方法首先以枯草芽孢杆菌 ATCC9943 为出 发菌株， 以整合载体 pDK 为骨架构建一个基因超 量表达载体 pDK-ComA， 利用同源重组原理， 通过 双交换过程将comA基因整合到枯草芽孢杆菌 ATCC9943 基因组的方法构建了一个高产抗菌肽 菌株 FMB。
5、27。经过高效液相色谱分析， 确定改良菌 株产 surfactin 和 fengycin 的能力大大提高。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 徐莉 权利要求书 1 页 说明书 5 页 序列表 5 页 附图 3 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书1页 说明书5页 序列表5页 附图3页 (10)授权公告号 CN 102220366 B CN 102220366 B *CN102220366B* 1/1 页 2 1. 通过超量表达comA基因提高枯草芽孢杆菌抗菌肽产量的方法， 其特征在于 ： （1）comA基因整合载体 pDK-ComA 的构建 设。
6、计引物 EM-F 和 EM-R， 以 pMUTIN4 质粒 DNA 为模板 PCR 扩增红霉素抗性基因EM， 获得 850 bp 基因片段 ； 设计引物 ComA-F 和 ComA-R， 以枯草芽孢杆菌 ATCC 9943 基因组 DNA 为 模板 PCR 扩增comA基因， 获得 645 bp 基因片段 ； 扩增得到的两个基因分别克隆至 pMD19-T 载体， 转化大肠杆菌 （Escherichia coli） DH5a， 经验证、 测序正确后， 分别命名为 pEM-T、 pComA-T， 于 -20条件下保存备用 ； 名称序列酶切位点 ComA-F5 CCGGAATTCATGACCAGTC。
7、AGTCAATAAAAAATG3EcoRI ComA-R5 GCGGGATCCTTACTCTTCTTCCGTTCCCGG3BamHI EM-F5 CGATACGTATGATAGGTGGTATGTTTTCGC3SnaBI EM-R5 AAAAGTACTCATGTGTACATTCCTCTCTT3SacI pDK 用snaBI/SalI双酶切后获得的大片段， 与经过相同双酶切处理的 pMUTIN4 载体后 获得的包括Pspac启动子和多克隆位点MCS的片段， 用T4 DNA连接酶连接， 构建pDK-Pspac 载体， 酶切验证正确后于 -20条件下保存备用 ； pDK-Pspac 用SnaBI/sa。
8、cI双酶切后获得的大片段， 与经过相同双酶切处理的 pEM-T 载 体后获得的EM基因片段， 用 T4 DNA 连接酶连接， 构建 pDK-Pspac-EM 载体， 酶切验证正确后 于 -20条件下保存备用 ； pComA-T 用BamHI/EcoRI酶切后获得comA片段， 与经过相同酶切处理的 pDK-Pspac-EM 载体， 用 T4DNA 连接酶连接， 构建comA基因超量表达载体 pDK-ComA， 酶切验证正确后， 转化 大肠杆菌 DH5a， 用于下一步转化 ； （2） FMB 27 突变菌株的构建 以枯草芽孢杆菌 ATCC 9943 制备感受态细胞， 采用电转化方法， 将获得的c。
9、omA基因超 量表达载体 pDK-ComA 转化入枯草芽孢杆菌 ATCC 9943， 在基因组amyE位点发生双交换， 红 霉素平板上筛选得到红霉素抗性菌株， 命名为 FMB 27 ； 该菌株的amyE基因被Pspac-ComA 基因所取代， 成为超量表达comA基因的突变菌株， 即为所得到的菌株。 2. 权利要求 1 所述方法获得的超量表达comA基因菌株 FMB 27。 3、 权利要求 2 所述超量表达comA基因菌株 FMB 27 在生产枯草芽孢杆菌抗菌肽中的应 用。 权 利 要 求 书 CN 102220366 B 2 1/5 页 3 通过超量表达comA基因提高枯草芽孢杆菌抗菌肽产量。
10、的 方法 0001 一、 技术领域 0002 本发明涉及通过超量表达comA基因提高枯草芽孢杆菌抗菌肽产量的方法， 属于 生物技术领域。 0003 二、 背景技术 0004 枯草芽孢杆菌 （Bacillus subtilis） 是目前公认的安全微生物之一， 其抗菌代谢 产物丰富多样， 尤其是脂肽类抗菌物质， 不仅抗菌谱广而且还具有生物表面活性剂的功能， 因此不仅可以在农业上用于进行生物防治， 而且在工业和环境保护上也有着广泛的应用。 0005 枯草芽孢杆菌 （Bacillus subtilis） ATCC 9943 是一种可以分泌 surfactin， fengycin等抗菌肽物质的枯草芽孢杆。
11、菌 （Valrie Leclre, Romain Marti, Max Bchet. The lipopeptides mycosubtilin and surfactin enhance spreading of Bacillus subtilis strains by their surface-active properties. Arch Microbiol. (2006) 186: 475-483） 。其中， surfactin 作为一种生物表面活性剂， 与化学表面活性剂相比， 其具 有拥有生物降解能力， 低毒， 结构丰富的优点， 随着对工业原料的环境适应性要求的提高， 其应用于环境。
12、保护， 石油开采方面潜力将会越来越大。 但实际中， 其并未在工业以及环境保 护中广泛应用， 究其原因， 是因为它生产成本巨大， 所以提高其产量便成为降低其生产成本 的核心问题。 0006 目前， 世界范围内， 提高其产量的方法主要是筛选优良菌株， 以及优化发酵条件， 而很少采用分子生物学技术对菌种进行改良的方法来提高其产抗菌物质的产量。 但随着对 抗菌肽合成分泌研究的日益深入， 已经逐渐开始采用分子生物学技术， 通过改造其合成分 泌中信号通路等方法来对原始菌种进行基因改良， 从而提高其自身合成分泌抗菌肽能力。 0007 comA基因 （Gene ID: 126362990） ， 其表达产物枯草。
13、杆菌感受态因子 ComA 是枯草 杆菌中十分重要的调控蛋白之一， 在枯草芽孢杆菌各种生理代谢过程中发挥着重要的作 用， 相关研究表明， ComA 蛋白可以与 surfactin 合成酶基因启动子结合从而刺激其表达。 0008 本方法首先以枯草芽孢杆菌 ATCC 9943 为出发菌株， 以枯草杆菌整合载体 pDK 为 骨架构建一个基因整合载体 pDK-ComA， 利用同源重组原理， 通过双交换过程将 comA 基因整 合到枯草芽孢杆菌 ATCC 9943 基因组中使其超量表达的方法构建了一个高产抗菌肽菌株 FMB 27。 0009 三、 发明内容 0010 技术问题 0011 本发明的目的是利用。
14、分子生物学技术， 构建comA超量表达载体， 经过电转化通过 同源重组将 Pspac-comA 基因整合入枯草芽孢杆菌 ATCC 9943 基因组amyE位点， 从而构建 一种高产抗菌肽的枯草芽孢杆菌菌株 FMB 27。 0012 技术方案 0013 1、 通过超量表达comA基因提高枯草芽孢杆菌抗菌肽产量的方法， 其特征在于 ： 0014 （1）comA基因超量表达载体 pDK-ComA 的构建 说 明 书 CN 102220366 B 3 2/5 页 4 0015 根据红霉素抗性基因设计引物EM-F和EM-R， 以pMUTIN4质粒DNA为模板PCR扩增 红霉素抗性基因， 获得 850 b。
15、p 基因片段 ； 根据枯草芽孢杆菌comA基因设计引物 ComA-F 和 ComA-R， 以枯草芽孢杆菌ATCC 9943基因组DNA为模板PCR扩增comA基因， 获得645 bp基因 片段 ； 扩增得到的两个基因分别克隆至 pMD19-T 载体， 转化大肠杆菌 （Escherichia coli） DH5a， 经验证、 测序正确后， 分别命名为 pEM-T、 pComA-T， 于 -20条件下保存备用 ； 0016 名称序列酶切位点 ComA-F5 CCGGAATTCATGACCAGTCAGTCAATAAAAAATG3EcoRI ComA-R5 GCGGGATCCTTACTCTTCTTCC。
16、GTTCCCGG3BamHI EM-F5 CGATACGTATGATAGGTGGTATGTTTTCGC3SnaBI EM-R5 AAAAGTACTCATGTGTACATTCCTCTCTT3SacI 0017 PCR 扩增体系如下 ： 0018 10 x Pfu PCR buffer 10l 0019 10 上游引物 10l 0020 10M 下游引物 10l 0021 2.5mM dNTPs 8l 0022 枯草芽孢杆菌基因组 DNA 0023 或者 pMUTIN4 质粒 DNA 1l 0024 Pfu DNA 聚合酶 1l 0025 ddH2O 60l 0026 PCR 程序为 94 2mi。
17、n ； 34 个循环 ： 94 45s， 58 50s， 72 4min ； 72 10min ； 0027 pDK 用snaBI/SalI双酶切后获得的大片段， 与经过相同双酶切处理的 pMUTIN4 载 体后获得的包括 Pspac 启动子和多克隆位点 （MCS） 的片段， 用 T4 DNA 连接酶连接， 构建 pDK-Pspac 载体， 酶切验证正确后于 -20条件下保存备用 ； 0028 pDK-Pspac 用SnaBI/sacI双酶切后获得的大片段， 与经过相同双酶切处理的 pEM-T 载体后获得的EM基因片段， 用 T4 DNA 连接酶连接， 构建 pDK-Pspac-EM 载体， 。
18、酶切验 证正确后于 -20条件下保存备用 ； 0029 pComA-T 用BamHI/EcoRI酶 切 后 获 得comA片 段， 与 经 过 相 同 酶 切 处 理 的 pDK-Pspac-EM 载体， 用 T4 DNA 连接酶连接， 构建comA基因超量表达载体 pDK-ComA， 酶切验 证正确后， 转化大肠杆菌 DH5a， 用于下一步转化 ； 0030 （2） FMB-29 突变菌株的构建 0031 以枯草芽孢杆菌 ATCC 9943 制备感受态细胞， 采用电转化方法， 将获得的comA 基因超量表达载体 pDK-ComA 转化入枯草芽孢杆菌 ATCC 9943， 在基因组amyE位点。
19、发生 双交换， 红霉素平板上筛选得到红霉素抗性菌株， 命名为 FMB 27 ； 该菌株的amyE基因被 Pspac-ComA基因所取代， 成为超量表达comA基因的突变菌株， 即为所得到的菌株。 0032 所述超量表达comA基因的枯草芽孢杆菌菌株FMB 27可以在生产枯草杆菌抗菌肽 中应用， 生产枯草芽孢杆菌抗菌肽产品。 0033 有益效果 0034 枯草芽孢杆菌 （Bacillus subtilis） 在生长代谢过程中能够产生不同种类的抗菌 物质， 其中抗菌肽占主导地位。由于它广谱的抗菌活性、 生物降解和毒性低的特点 , 因此愈 说 明 书 CN 102220366 B 4 3/5 页 5。
20、 来愈受到人们的重视， 在植物病害生物控制、 食品防腐以及饲料添加剂等方面具有潜在的 应用前景。 特别针对目前农药残留、 化学食品和饲料添加剂对于食品安全的严重影响， 探索 天然的抗菌物质对于农产品安全生产有重要的现实意义。 0035 国内外针对实验室条件下抗菌肽的发酵工艺和分离技术已经开展大量研究。虽 然通过发酵工艺的优化能够提高抗菌肽生产水平， 但是发酵产量依然难于大规模工业化生 产。因此从分子生物学水平， 利用基因工程技术对菌种进行定向改良将成为一种新的提高 抗菌肽产量的手段。 0036 本发明通过分子生物学技术， 成功构建一株高产抗菌肽菌株 FMB 27。与原始 菌株 ATCC 994。
21、3 相比， 经过菌种改良的菌株 FMB 27 合成分泌抗菌肽能力大大提高， 其中 surfactin产量从777 mg/L提高到1605 mg/L， 提高了2.06倍 ； fengycin的产量从646 mg/ L 提高到 1835 mg/L， 提高了 2.84 倍。此外， 此发明还揭示了 ComA 蛋白对抗菌肽物质合成 分泌的有促进作用， 可以通过这种方法， 利用 pDK-ComA 载体对任何枯草芽孢杆菌进行基因 改良， 以获得相应的改良菌种， 达到提高抗菌肽产量的目的。 0037 四、 附图说明 0038 图 1. 技术方案 ； 0039 图 2. comA基因超量表达载体的构建 ； 00。
22、40 图 3. comA基因超量表达菌株的构建 ； 0041 图 4. comA基因超量表达菌株 PCR 验证 ； 0042 五、 具体实施方式 0043 本发明首先构建comA基因超量表达载体 pDK-ComA， 经过电转化将 pDK-ComA 载 体转化入枯草芽孢杆菌 （Bacillus subtilis） ATCC 9943（购自 The Global Bioresource Center） ， 经过双交换同源重组过程将其基因组内amyE基因用Pspac-comA基因代替， 达 到过量表达comA基因的目的， 从而构建一株高产抗菌肽的枯草芽孢杆菌菌株 FMB 27。通 过 PCR 方法对。
23、突变菌株进行鉴定 ； 利用高效液相色谱 （HPLC） 分析改良菌株 surfactin 和 fengycin 的产量。具体实施方式如下 ： 0044 （1）comA基因超量表达载体 pDK-ComA 的构建 0045 根据枯草芽孢杆菌comA基因 （Gene ID: 126362990） 设计引物 ComA-F 和 ComA-R， 以枯草芽孢杆菌 （Bacillus subtilis） ATCC 9943 基因组 DNA 为模板 PCR 扩增comA基因， 获得 645 bp 基因片段 ； 根据 pMUTIN4 的 DNA 中 EM 基因序列 （表 1） 设计引物 EM-F 和 EM-R， 以。
24、pMUTIN4质粒 （购自Bacillus Genetic Stock Center; BGSCID: ECE139） DNA为模板PCR 扩增红霉素抗性基因， 获得 850bp 基因片段。扩增得到的两个基因分别克隆至 pMD19-T 载 体 （购自 Takara 公司） ， 转化大肠杆菌 （Escherichia coli） DH5a ( 购自宝生物工程有限公 司 )， 经验证、 测序正确后， 分别命名为pEM-T、 pComA-T， 于 -20条件下保存备用 ； 0046 名称序列酶切位点 ComA-F5 CCGGAATTCATGACCAGTCAGTCAATAAAAAATG3EcoRI C。
25、omA-R5 GCGGGATCCTTACTCTTCTTCCGTTCCCGG3BamHI EM-F5 CGATACGTATGATAGGTGGTATGTTTTCGC3SnaBI EM-R5 AAAAGTACTCATGTGTACATTCCTCTCTT3SacI 0047 PCR 扩增体系如下 ： 说 明 书 CN 102220366 B 5 4/5 页 6 0048 10 x Pfu PCR buffer 10l 0049 10 上游引物 10l 0050 10M 下游引物 10l 0051 2.5mM dNTPs 8l 0052 枯草芽孢杆菌基因组 DNA 0053 或者 pMUTIN4 质粒 D。
26、NA 1l 0054 Pfu DNA 聚合酶 1l 0055 ddH2O 60l 0056 PCR 程序为 94 2min ； 34(94 45s ； 58 50s ； 72 4min) ； 72 10min。 0057 pDK（购自 Bacilluse Genetic Stock Center ID ： ECE143） 用snaBI/SalI双酶 切后获得的大片段， 与经过相同双酶切处理的 pMUTIN4 载体后获得的包括 Pspac 启动子和 多克隆位点 （MCS） 的片段， 用 T4 DNA 连接酶连接， 构建 pDK-Pspac 载体， 酶切验证正确后 于 -20条件下保存备用 ； 0。
27、058 pDK-Pspac 用SnaBI/sacI双酶切后获得的大片段， 与经过相同双酶切处理的 pEM-T 载体后获得的EM基因片段， 用 T4 DNA 连接酶连接， 构建 pDK-Pspac-EM 载体， 酶切验 证正确后于 -20条件下保存备用 ； 0059 pComA-T 用BamHI/EcoRI酶 切 后 获 得comA片 段， 与 经 过 相 同 酶 切 处 理 的 pDK-Pspac-EM 载体， 用 T4 DNA 连接酶连接， 构建comA基因超量表达载体 pDK-ComA， 酶切验 证正确后， 转化大肠杆菌 DH5a， 用于下一步转化 ； 0060 （2） FMB 27 突变。
28、菌株的构建 0061 以枯草芽孢杆菌 ATCC 9943（购自 The Global Bioresource Center） 制备感受 态细胞， 采用电转化方法， 将获得的comA基因超量表达载体pDK-ComA转化入枯草芽孢杆菌 ATCC 9943， 在基因组amyE位点发生双交换， 红霉素平板上筛选得到红霉素抗性菌株 5 株， 命名为 FMB 27 ； 该菌株的amyE基因被 Pspac-ComA 基因所取代， 成为超量表达comA基因的 突变菌株， 即为所得到的菌株。 0062 （3） 蛋白酶失活菌株的分子验证 0063 对枯草芽孢杆菌 FMB 27 突变菌是否构建成功进行分子验证。由于。
29、突变菌株具有 红霉素抗性， 所以我们根据 pMUTIN4 中红霉素抗性基因 （表 1） 设计引物 EMT-F/EMT-R， 以经 抗性筛选得到枯草芽孢杆菌 FMB27 基因组 DNA 为模板进行 PCR 扩增， 得到约 800 bp 基因片 段， 与预期结果一致。 （图 4， 第 2 泳道） 。经过分子生物学验证， 我们确实得到了超量表达 comA基因的改良枯草芽孢杆菌菌株 FMB 27。 0064 0065 （4） 改良枯草芽孢杆菌菌株 FMB 27 抗菌肽产量 HPLC 分析 0066 将枯草芽孢杆菌 FMB 27 种子液以 5% 浓度接种于 Landy 发酵培养基中， 在 33 C， 1。
30、80 rpm下培养36 h， 得抗菌物质发酵液。 发酵液11000g离心15 min除去菌体， 用6 M HCl 将上清液调节到 pH 2， 然后静止过夜， 11000g 离心收集沉淀， 加入甲醇后用 NaOH 中和至 pH 说 明 书 CN 102220366 B 6 5/5 页 7 7， 获得抗菌肽粗提物。 0067 经过 HPLC（Agilent 1100 Series） 的分析， 与原始菌株 ATCC 9943 相比， 改良菌 株 FMB27 中 surfactin 产量从 777 mg/L 提高到 1605 mg/L， 提高了 2.06 倍 ； fengycin 的 产量从 646 。
31、mg/L 提高到 1835 mg/L， 提高了 2.84 倍。 0068 0069 说 明 书 CN 102220366 B 7 1/5 页 8 SEQUENCE LISTING 南京农业大学 通过超量表达 comA 基因提高枯草芽孢杆菌抗菌肽产量的方法 说明书 7 PatentIn version 3.1 1 34 DNA 人工合成 ComA-F (1).(34) 1 ccggaattca tgaccagtca gtcaataaaa aatg 34 2 30 DNA 序 列 表 CN 102220366 B 8 2/5 页 9 人工合成 ComA-R (1).(30) 2 gcgggatcc。
32、t tactcttctt ccgttcccgg 30 3 30 DNA 人工合成 EM-F (1).(30) 3 cgatacgtat gataggtggt atgttttcgc 30 4 29 DNA 人工合成 EM-R 序 列 表 CN 102220366 B 9 3/5 页 10 (1).(29) 4 aaaagtactc atgtgtacat tcctctctt 29 5 29 DNA 人工合成 EMT-F (1).(29) 5 atgaacaaaa atataaaata ttctcaaaa 29 6 24 DNA 人工合成 EMT-R (1).(24) 序 列 表 CN 102220。
33、366 B 10 4/5 页 11 6 aattatttcc tcccgttaaa taat 24 7 790 DNA Bacillus subtilis 红霉素抗性基因序列 (1).(790) 7 tagaagcaaa cttaagagtg tgttgatagt gcagtatctt aaaattttgt ataataggaa 60 ttgaagttaa attagatgct aaaaatttgt aattaagaag gagtgattac atgaacaaaa 120 atataaaata ttctcaaaac tttttaacga gtgaaaaagt actcaaccaa ataata。
34、aaac 180 aattgaattt aaaagaaacc gataccgttt acgaaattgg aacaggtaaa gggcatttaa 240 cgacgaaact ggctaaaata agtaaacagg taacgtctat tgaattagac agtcatctat 300 tcaacttatc gtcagaaaaa ttaaaactga atactcgtgt cactttaatt caccaagata 360 ttctacagtt tcaattccct aacaaacaga ggtataaaat tgttgggagt attccttacc 420 tgattgttga 。
35、agaaggattc tacaagcgta ccttggatat tcaccgaaca ctagggttgc 480 tcttgcacac tcaagtctcg attcagcaat tgcttaagct gccagcggaa tgctttcatc 540 ctaaaccaaa agtaaacagt gtcttaataa aacttacccg ccataccaca gatgttccag 600 ataaatattg gaagctatat acgtactttg tttcaaaatg ggtcaatcga gaatatcgtc 660 序 列 表 CN 102220366 B 11 5/5 页 1。
36、2 aactgtttac taaaaatcag tttcatcaag caatgaaaca cgccaaagta aacaatttaa 720 gtaccgttac ttatgagcaa gtattgtcta tttttaatag ttatctatta tttaacggga 780 ggaaataatt 790 序 列 表 CN 102220366 B 12 1/3 页 13 图 1 说 明 书 附 图 CN 102220366 B 13 2/3 页 14 图 2 说 明 书 附 图 CN 102220366 B 14 3/3 页 15 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 102220366 B 15 。