枯草芽孢杆菌与丁酸梭菌复合菌制剂的制备及其应用.pdf

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1、(10)授权公告号 CN 102220261 B (45)授权公告日 2012.10.03 CN 102220261 B *CN102220261B* (21)申请号 201110110362.2 (22)申请日 2011.04.29 C12N 1/20(2006.01) C12R 1/125(2006.01) C12R 1/145(2006.01) (73)专利权人 济南海华生物科技有限公司 地址 250100 山东省济南市历城区花园路 101 号海蔚广场 5 号楼 802 室 (72)发明人 丛晓燕 朱小玲 位宾 张杰 (74)专利代理机构 济南舜源专利事务所有限公 司 37205 代理人。

2、 曲志波 (54) 发明名称 枯草芽孢杆菌与丁酸梭菌复合菌制剂的制备 及其应用 (57) 摘要 一种枯草芽孢杆菌与丁酸梭菌复合菌制 剂的制备方法， 其特征是它包括如下步骤 ： （1）制作种子培养液， 分别制作含丁酸梭菌和 枯草芽孢杆菌的种子液， 其中菌液浓度均为 0.5108-1.0108CFU/ml ；（2） 制作联合培养基 ； （3）将步骤 （1）中的枯草芽孢杆菌种子液按 2% 的比例加入到联合培养基， 利用 10% 的稀盐酸或 10% 的氢氧化钠自动调控 pH 值在 6.5-7.0， 通气， 搅拌， 控制溶氧 20-50%， 37培养 18-20 小时， 之 后停止通气， 继续搅拌培养 。

3、2-4 小时 ；（4） 将步骤 （1） 中的丁酸梭菌种子液按照 2% 的比例利用蠕动 泵加入到联合培养基中， 35静置培养 24-28 小 时得到枯草芽孢杆菌与丁酸梭菌复合菌制剂。将 得到的微生态制剂与饲料按照 0.5% 混合， 直接饲 喂畜禽， 有效降低畜禽的腹泻率及畜禽的死亡率， 提高了产能并节约用药成本。 (51)Int.Cl. 审查员 王莉 权利要求书 1 页 说明书 5 页 附图 1 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 说明书 5 页 附图 1 页 1/1 页 2 1. 一种枯草芽孢杆菌与丁酸梭菌复合菌制剂的制备方法， 其特征是它包括如下步。

4、骤 ： （1） 制作种子培养液， 分别制作含丁酸梭菌和枯草芽孢杆菌的种 子液， 其中菌液浓度均为 0.5108-1.0108CFU/ml ； （2） 制作联合培养基， 具体为 ： 高温豆饼粉 1.8-3.5%、 尿素 0.1-0.3%、 玉米浆 0.1-0.5%、 玉米淀粉 0.5-1.0%、 磷酸氢二钾 0.1-0.5%、 磷酸二氢钾 0.1-0.5%、 硫酸镁 0.1-0.3%、 硫酸锰 0.01-0.05% ； （3） 将步骤 （1） 中的枯草芽孢杆菌种子液按 2% 的比例加入到联合培养基， 利用 10% 的 稀盐酸或 10% 的氢氧化钠自动调控 ph 值在 6.5-7.0， 通气， 搅。

5、拌， 控制溶氧 20-50%， 37培 养 18-20 小时， 之后停止通气， 继续搅拌培养 2-4 小时 ； （4） 将步骤 （1） 中的丁酸梭菌种子液按照 2% 的比例利用蠕动泵加入到联合培养基中， 35静置培养 24-28 小时得到枯草芽孢杆菌与丁酸梭菌混合培养物。 2. 根据权利要求 1 所述的枯草芽孢杆菌与丁酸梭菌复合菌制剂的制备方法， 其特征 是将枯草芽孢杆菌与丁酸梭菌混合培养物利用管式离心机离心， 加入载体玉米芯， 菌泥在 40以下通风干燥， 水分控制在 5%， 粉碎过 100 目钢筛得到枯草芽孢杆菌与丁酸梭菌复合 菌制剂。 3. 根据权利要求 1 所述的枯草芽孢杆菌与丁酸梭菌复。

6、合菌制剂的制备方法， 其特 征是步骤 （3）培养结束后， 联合培养基中的溶氧为零， 包括芽孢在内的活菌总数保证在 0.5109-2.5109CFU/ml。 4. 根据权利要求 1 所述的枯草芽孢杆菌与丁酸梭菌复合菌制剂的制备方法， 其特征是 步骤 （4） 联合培养培养结束后， 取样检测活菌总数， 保证在 1.0109-5.0109CFU/ml， 观察 菌体生长情况， 以 98% 以上菌体转化成芽孢为宜。 权 利 要 求 书 CN 102220261 B 2 1/5 页 3 枯草芽孢杆菌与丁酸梭菌复合菌制剂的制备及其应用 技术领域 0001 本发明涉及枯草芽孢杆菌与丁酸梭菌复合菌制剂的制备及其在。

7、畜禽养殖上的应 用， 具体涉及一种以枯草芽孢杆菌、 丁酸梭菌两种菌种为原料， 利用二者在发酵过程中的协 同关系， 采用一次性发酵获得枯草芽孢杆菌与丁酸梭菌复合益生菌制剂的联合制备方法及 其在预防畜禽腹泻上的应用。 背景技术 0002 枯草芽孢杆菌属革兰氏阳性好氧菌， 在生长过程中迅速消耗环境中的游离氧， 造 成肠道低氧， 促进有益厌氧菌生长， 并产生乳酸等有机酸类， 降低肠道 PH 值， 间接抑制其它 致病菌生长 ； 另外， 枯草芽孢杆菌菌体自身合成 - 淀粉酶、 蛋白酶、 脂肪酶、 纤维素酶等酶 类， 在消化道中与机体内的消化酶类一同发挥作用。 文献报道， 枯草芽孢杆菌孢子能够在肠 道内复活。

8、， 生长过程大量消耗周围环境中的氧气， 促进肠道内益生菌 （乳酸菌、 双歧杆菌及 丁酸梭菌等） 的生长， 同时抑制大肠杆菌、 沙门氏菌等条件性病原菌。专利 201010287464.7 公开了一种抑制致病性大肠杆菌生长的复合微生态制剂及其制备方法， 该方法是将枯草芽 孢杆菌、 乳酪杆菌和异常汉逊酵母菌分别培养， 然后按一定比例混合。 该方法的缺点是三种 菌的发酵培养基需要单独灭菌， 增加了能耗， 而且降低了设备的利用率。 由于对发酵过程对 氧需求的差异， 导致枯草芽孢杆菌与厌氧益生菌 （如乳酸杆菌、 双歧杆菌及丁酸梭菌等） 的 同时高效培养难以实现。专利 200510136003.9 公开了一。

9、种复合枯草芽孢杆菌和乳酸菌微 生物制剂的制备方法， 该方法将枯草芽孢杆菌及乳酸菌菌种同时置于联合培养基微好氧发 酵， 虽然该方法实现了好氧与厌氧菌的同时培养， 但缺点是由于枯草芽孢杆菌是好氧菌， 而 乳酸菌是厌氧菌， 微好氧对二者都是非最佳状态， 不利于细菌的增值， 影响最终产品的细菌 含量， 降低了生产效率， 而且两种微生物同时培养， 两者在最终产品的各自数量难于控制。 0003 丁酸梭菌为革兰氏阳性厌氧杆菌， 丁酸梭菌是调节肠道微生态平衡的有益菌， 其 主要生物特性表现为 ： 促进肠道有益菌群 ( 双歧杆菌， 乳酸杆菌 ) 的增殖和发育， 抑制 肠道内有害菌和腐败菌的生长、 繁殖， 纠正肠。

10、道菌群紊乱， 减少肠毒素的发生 ； 在肠道内 能产生 B 族维生素、 维生素 K 等物质， 对机体具有保健作用 ； 丁酸梭菌的主要代谢产物丁 酸是肠道上皮组织细胞的再生和修复主要营养物质， 提高畜禽的饲料消化吸收率 ； 丁酸 梭菌是厌氧芽孢杆菌， 稳定性好， 在机体内不受胃酸、 胆汁酸等影响， 在体外 （芽孢状态） 室 温下能保存三年以上。 丁酸梭菌制剂被用作兽医药品， 用来治疗畜禽肠道菌丛紊乱， 提高生 产力， 取得了良好的效果。 0004 目前已公开了多种丁酸梭菌的培养方法， 但是， 这些方法存在或者生产成本高、 设 备要求高， 或者生产周期长， 孢子转化率低等问题。 首先， 由于丁酸梭菌。

11、是一种厌氧菌， 多数 生产方法均需要在石蜡油、 氮气或二氧化碳维持的厌氧环境中进行， 仪器设备复杂昂贵， 专 利 200610125586.X 公开了一种丁酸梭菌活菌剂的生产方法， 培养基需经过高压灭菌后经 石蜡油维持厌氧环境 45-60 小时。专利 200410068185.6 公开了以蛋白胨、 酵母浸膏粉及葡 萄糖为主要成分的培养基培养嗜酸乳杆菌、 粪肠球菌及丁酸梭菌， 经混合后制成饲料添加 说 明 书 CN 102220261 B 3 2/5 页 4 剂用于畜禽养殖， 其培养基消耗量大， 成本昂贵。专利 200610107225.2 对丁酸梭菌与乳酸 菌联合培养条件进行了研究， 该工艺是。

12、将分别培养的种子培养液加到联合培养基中共同培 养， 由于涉及的两种微生物都是厌氧菌， 因此操作比较简单， 但采用葡萄糖作为培养基的主 要碳源， 同样存在价格昂贵的问题。如前所述， 至于丁酸梭菌与好氧菌 （如枯草芽孢杆菌） 的 联合培养方法更是鲜有报道。 0005 枯草芽孢杆菌与丁酸梭菌虽然在同时培养过程中由于对氧需求的差异性， 导致培 养难以实现， 但是此种矛盾关系却为二者在体内协同发挥作用提供了基础。复合菌制剂进 入消化道以后， 一方面枯草芽孢杆菌消耗氧气为丁酸梭菌及其他厌氧益生菌提供厌氧环 境， 促进其生长和发挥功能 ； 另一方面丁酸梭菌不仅如同一般厌氧益生菌通过产酸改善胃 肠道 Ph 值。

13、， 改善胃肠道微生态平衡， 而且能进一步通过促进小肠绒毛发育提高畜禽胃肠道 的消化吸收功能。因此， 枯草芽孢杆菌与丁酸梭菌复合菌制剂比一般的益生菌菌剂更有利 于维持畜禽胃肠道微生态平衡、 促进其消化吸收功能及提高饲料消化吸收利用率。 另外， 枯 草芽孢杆菌与丁酸梭菌都属于芽孢杆菌， 其芽孢具有耐高温及挤压等的特性， 因此该复合 菌剂能够耐受饲料高温制粒过程的高温及挤压等， 可以直接添加于颗粒饲料中并且保证微 生物的活性不受影响。 发明内容 0006 本发明的目的在于克服现有技术中存在的不足 （如多菌单独培养， 最后混合， 多次 灭菌导致能耗增加或者多菌以非最佳条件同时联合培养导致生长速度受限等。

14、） 而提供一 种将好氧菌与厌氧菌联合发酵培养， 以达到简化生产工艺， 降低生产成本， 提高发酵活菌总 数， 增强临床使用效果， 进一步扩大使用用途的枯草芽孢杆菌与丁酸梭菌联合培养方法， 本 发明的二菌联合发酵工艺， 是一次性发酵获得复合益生菌， 避免了生产中多次灭菌及混合 的麻烦， 减少了杂菌污染环节， 降低了生产成本。 所用菌株枯草芽孢杆菌来自中国普通微生 物菌种保藏管理中心， 其保藏编号是 ： 枯草芽孢杆菌 CGMCC NO. 1.884 ； 丁酸梭菌来自中国 工业微生物菌种保藏管理中心 CICC 其保藏编号是 ： 丁酸梭菌 NO. 10350， 但不仅限于此菌 株。 0007 本发明的另。

15、一个目的是提供一种在畜禽饲养领域具有重要应用的枯草芽孢杆菌 与丁酸梭菌复合菌制剂。 0008 发明的目的是这样实现的 ： 0009 本发明的具体工艺如下 ： 0010 第一步， 分别制作枯草芽孢杆菌与丁酸梭菌的种子培养液， 其中菌液浓度均为 0.5108-1.0108CFU/ml。 0011 第二步， 制作联合培养基， 具体为 ： 高温豆饼粉 1.8-3.5%、 尿素 0.1-0.3%、 玉米 浆 0.1-0.5%、 玉米淀粉 0.5-1.0%、 磷酸氢二钾 0.1-0.5%、 磷酸二氢钾 0.1-0.5%、 硫酸镁 0.1-0.3%、 硫酸锰 0.01-0.05%。 0012 第三步， 将枯。

16、草芽孢杆菌种子液按 2% 的比例加入到联合培养基， 利用 10% 的稀盐 酸或 10% 的氢氧化钠自动调控 ph 值在 6.5-7.0， 通气， 搅拌， 控制溶氧 20-50%， 37培养 18-20 小时， 之后停止通气， 继续搅拌培养 2-4 小时。 0013 第四步， 将丁酸梭菌种子液按照 2% 的比例利用蠕动泵加入到联合培养基中， 静置 说 明 书 CN 102220261 B 4 3/5 页 5 培养 24-28 小时。取样检测活菌总数， 保证在 1.0109-5.0109CFU/ml， 观察菌体生长情 况， 以芽孢率达 98% 以上为标准。 0014 第五步， 将发酵液利用管式离心。

17、机离心， 加入载体玉米芯， 菌泥在 40以下通风干 燥， 水分控制在 5%， 粉碎过 100 目钢筛， 检测合格后， 包装入库。 0015 第六步， 将得到的复合微生态制剂与饲料按照 0.5% 的比例混合， 直接饲喂畜禽。 0016 本发明具有如下积极效果 ： 0017 1、 联合培养与单独培养相比， 只需对联合培养基进行一次灭菌， 不必像单独培养 那样需要分别进行灭菌， 这样便会降低能耗且提高发酵装置的使用效率。 0018 2、 联合培养第一阶段枯草芽孢杆菌发酵末期， 在停止通气的情况下， 枯草芽孢杆 菌会迅速耗尽培养基中残存的氧， 为厌氧丁酸梭菌提供无氧环境， 大大节约了用氮气或二 氧化碳。

18、驱氧的原料及能耗成本。同时， 枯草芽孢杆菌体内好氧过程能促进丁酸梭菌的生长 和定植。 0019 3、 由于枯草芽孢杆菌在发酵过程中产生淀粉酶， 因此我们可以选择相对廉价的淀 粉作为联合培养基的碳源， 这样便会降低生产成本。 0020 4、 通过联合培养， 两株菌有足够的时间进行适用， 互生共生， 便于两株菌进入肠道 之后协同发挥医疗作用。 0021 5、 枯草芽孢杆菌与丁酸梭菌都属于芽孢杆菌， 其芽孢具有耐高温及挤压等的特 性， 因此该复合菌剂能够耐受饲料高温制粒过程的高温及挤压等， 可以直接添加于颗粒饲 料中并且保证微生物的活性不受影响。 0022 本发明通过枯草芽孢杆菌与丁酸梭菌的联合发酵。

19、工艺， 提高了发酵单位， 缩短了 发酵时间， 降低了生产成本， 增强了其在畜禽养殖上的效果， 使产品具有更强竞争力。 附图说明 0023 图 1 为本发明的工艺流程图。 具体实施方式 0024 实施例 1 0025 1、 分别制作枯草芽孢杆菌与丁酸梭菌的种子培养液， 其中菌液浓度均为 5.0108CFU/ml。 0026 2、 制作联合培养基， 具体为 ： 高温豆饼粉 1.8%、 尿素 0.1%、 玉米浆 0.1%、 玉米淀粉 0.5%、 磷酸氢二钾 0.1%、 磷酸二氢钾 0.1%、 硫酸镁 0.1%、 硫酸锰 0.01%。 0027 3、 将步骤 1 中的枯草芽孢杆菌种子液按 2% 的比例。

20、加入到联合培养基， 利用 10% 的 稀盐酸或 10% 的氢氧化钠自动调控 ph 值在 7.0， 通气， 搅拌， 控制溶氧 20%， 37培养 20 小 时， 之后停止通气， 继续搅拌培养 2 小时。 0028 4、 将步骤 1 中的丁酸梭菌种子液按 2% 的比例利用蠕动泵加入到联合培养基中， 35静置培养 28 小时。取样检测活菌总数， 活菌总数为 2.70109CFU/ml， 芽孢率为 100%。 0029 5、 将发酵液利用管式离心机离心， 加入载体玉米芯， 在 40以下通风干燥， 水分控 制在 5%， 粉碎过 100 目钢筛， 检测合格后， 包装入库。 0030 实施例 2 说 明 书。

21、 CN 102220261 B 5 4/5 页 6 0031 1、 分别制作枯草芽孢杆菌与丁酸梭菌的种子培养液， 其中菌液浓度均为 1.0108CFU/ml。 0032 2、 制作联合培养基， 具体为 ： 高温豆饼粉 2.5%、 尿素 0.2%、 玉米浆 0.3%、 玉米淀粉 0.7%、 磷酸氢二钾 0.3%、 磷酸二氢钾 0.3%、 硫酸镁 0.2%、 硫酸锰 0.02%。 0033 3、 将步骤 1 中的枯草芽孢杆菌种子液按 2% 的比例加入到联合培养基， 利用 10% 的 稀盐酸或 10% 的氢氧化钠自动调控 ph 值在 6.8， 通气， 搅拌， 控制溶氧 30%， 37培养 20 小 。

22、时， 之后停止通气， 继续搅拌培养 2 小时。 0034 4、 将步骤 1 中的丁酸梭菌种子液按 2% 的比例利用蠕动泵加入到联合培养基中， 35静置培养26小时。 取样检测活菌总数， 活菌总数为3.18109CFU/ml， 芽孢率为99.1%。 0035 5、 将发酵液利用管式离心机离心， 加入载体玉米芯， 在 40以下通风干燥， 水分控 制在 5%， 粉碎过 100 目钢筛， 检测合格后， 包装入库。 0036 实施例 3 0037 1、 分别制作枯草芽孢杆菌与丁酸梭菌的种子培养液， 其中菌液浓度均为 0.5108CFU/ml。 0038 2、 制作联合培养基， 具体为 ： 高温豆饼粉 3。

23、.5%、 尿素 0.3%、 玉米浆 0.5%、 玉米淀粉 1.0%、 磷酸氢二钾 0.5%、 磷酸二氢钾 0.5%、 硫酸镁 0.3%、 硫酸锰 0.05%。 0039 3、 将步骤 1 中的枯草芽孢杆菌种子液按 5% 的比例加入到联合培养基， 利用 10% 的 稀盐酸或 10% 的氢氧化钠自动调控 ph 值在 6.5， 通气， 搅拌， 控制溶氧 20%， 37培养 18 小 时， 之后停止通气， 继续搅拌培养 2 小时。 0040 4、 将步骤 1 中的丁酸梭菌种子液按 2% 的比例利用蠕动泵加入到联合培养基中， 35静置培养24小时。 取样检测活菌总数， 活菌总数为4.36109CFU/m。

24、l， 芽孢率为98.6%。 0041 5、 将发酵液利用管式离心机离心， 加入载体玉米芯， 在 40以下通风干燥， 水分控 制在 5%， 粉碎过 100 目钢筛， 检测合格后， 包装入库。 0042 实施例 4 0043 枯草芽孢杆菌与丁酸梭菌复合菌制剂在预防初生仔猪腹泻上的应用 0044 1、 将实施例 2 得到的复合菌制剂与饲料按 0.5% 混合， 直接喂食。 0045 2、 试验结果 0046 实验对象为某商品猪的出生仔猪。 0047 实验组 ： 初生仔猪饲喂添加微生态制剂的饲料， 不进行抗生素注射剂用药等方法 的防控， 其他的饲养管理按猪场的常规方法进行。 0048 对照组 ： 仔猪发。

25、生腹泻后注射抗生素及其它药物， 并结合猪场的治疗管理给予一 定的其他药物的治疗， 日粮、 营养成分及饲养管理等完全与实验组相同。 0049 试验结果如表 1 ： 0050 说 明 书 CN 102220261 B 6 5/5 页 7 0051 结果表明 ： 实验组与对照组相比， 该复合微生态制剂可以有效预防仔猪的腹泻， 并 且降低用药成本。 0052 实施例 5 0053 枯草芽孢杆菌与丁酸梭菌复合菌制剂在预防蛋鸡腹泻上的应用 0054 1、 将实施例 2 得到的复合菌制剂与饲料按 0.5% 混合， 直接喂食。 0055 2、 试验结果 0056 实验对象为某商品蛋鸡场的蛋鸡。 0057 实验组 ： 蛋鸡饲喂添加微生态制剂的饲料， 不进行抗生素用药等方法的防控， 其他 的饲养管理按鸡场的常规方法进行。 0058 对照组 ： 蛋鸡发生腹泻后投放抗生素及其它药物， 并结合鸡场的治疗管理给予一 定的其他药物的治疗， 日粮、 营养成分及饲养管理等完全与实验组相同。 0059 0060 结果表明 ： 实验组蛋鸡与对照组比较， 腹泻率， 死亡率大幅度降低， 并且用药大幅 降低， 但是终末体重却明显提高， 增加了经济效益。 说 明 书 CN 102220261 B 7 1/1 页 8 图 1 说 明 书 附 图 CN 102220261 B 8 。