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花生AhFRDL1基因在提高植物抗铝毒胁迫中的应用.pdf

  • 上传人:小***
  • 文档编号:8651889
  • 上传时间:2020-10-19
  • 格式:PDF
  • 页数:22
  • 大小:1.77MB
  • 摘要
    申请专利号:

    CN201310520847.8

    申请日:

    20131029

    公开号:

    CN104561026B

    公开日:

    20171027

    当前法律状态:

    有效性:

    有效

    法律详情:

    IPC分类号:

    C12N15/29,C07K14/415,C12N15/84,A01H5/00

    主分类号:

    C12N15/29,C07K14/415,C12N15/84,A01H5/00

    申请人:

    中国农业大学

    发明人:

    左元梅,邱巍,纪春巧,熊宏春,郭笑彤

    地址:

    100193 北京市海淀区圆明园西路2号

    优先权:

    CN201310520847A

    专利代理机构:

    北京路浩知识产权代理有限公司

    代理人:

    王文君

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    内容摘要

    本发明提供了花生柠檬酸转运蛋白基因AhFRDL1在提高植物抗铝毒胁迫中的应用。所述应用为将所述花生柠檬酸转运蛋白基因AhFRDL1或含所述花生柠檬酸转运蛋白基因AhFRDL1的重组表达载体转入植物细胞中,筛选转基因植物,使转基因植物表达花生柠檬酸转运蛋白,从而提高植物的抗铝毒胁迫能力。本发明首次证明花生柠檬酸转运蛋白基因AhFRDL1是一个调控柠檬酸向植物体外分泌的基因,并且参与了植物抵抗铝毒胁迫的生物学过程,将花生柠檬酸转运蛋白基因AhFRDL1应用于提高植物的抗铝毒胁迫中,为进一步培育酸性土壤上耐铝毒的主要作物具有长远的实践意义。

    权利要求书

    1.花生柠檬酸转运蛋白基因AhFRDL1在提高植物抗铝毒胁迫中的应用,所述花生柠檬酸转运蛋白基因AhFRDL1的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示;所述植物为花生、拟南芥。 2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述应用为将所述花生柠檬酸转运蛋白基因AhFRDL1或含所述花生柠檬酸转运蛋白基因AhFRDL1的重组表达载体转入植物细胞中,筛选转基因植物,使转基因植物表达花生柠檬酸转运蛋白。 3.根据权利要求2所述的应用,其特征在于,所述含花生柠檬酸转运蛋白基因AhFRDL1的重组表达载体为pBAR1-AhFRDL1。 4.根据权利要求3所述的应用,其特征在于,所述重组表达载体为pBAR1-AhFRDL1的构建方法如下:(1)提取花生样品RNA并反转录获得cDNA,以cDNA为模板,以AhFRDL1-F和AhFRDL1-R为引物,进行PCR;AhFRDL1-F:5’-TGGTAGAGAAAATGGCTGAGAAG-3’;AhFRDL1-R:5’-AACATGATTGCATTCATCTCCAT-3’;(2)将步骤(1)得到的PCR产物克隆连接到pMD20-T载体上,获得载体pMD20-T-AhFRDL1;(3)以载体pMD20-T-AhFRDL1为模板,以35s-AhFRD1-F和35s-AhFRD1-R为引物,进行PCR;35s-AhFRD1-F:5’-ACGCCCCGGGATGGCTGAGAAGCAG-3’;35s-AhFRD1-R:5’-CGGGATCCTTTCTCCATAGGAATTCCCAAG-3’;(4)将步骤(3)得到的PCR产物克隆到pGEM-T载体中,获得载体pGEM-T-AhFRDL1;(5)将载体pGEM-T-AhFRDL1和pBAR1同时用XmaI和BamHI进行双酶切,回收AhFRDL1目的片段和pBAR1载体片段,连接,构建重组表达载体pBAR1-AhFRDL1。

    说明书

    技术领域

    本发明属于基因工程领域,特别涉及一种花生柠檬酸转运蛋白基因AhFRDL1在提高植物抗铝毒胁迫中的应用。

    背景技术

    铝是地壳中含量最丰富的金属元素,通常以难溶性硅酸盐或氧化铝形式存在,对植物没有毒害,但是在酸性条件下(pH<5),可溶性的铝(主要是Al3+)对大多数植物都会产生毒害,我国酸性土壤约占全国土地总面积的21%,铝不仅是酸性土壤上土壤酸度的主要来源,同时由于铝的交换量占土壤阳离子交换量的20-80%,导致土壤中阳离子易于淋失,致使P、K、Ca、Mg、B、Mo等营养元素缺乏,因此,铝毒害成为制约作物正常生长发育的重要的限制因素(Wright RJ.1989.Soil aluminum toxicity and plant growth.Communications in Soil Science and Plant Analysis.20:1479-1497)。有研究表明,铝胁迫下大豆根系对NO3-的吸收严重受阻(Lazol DB,Rincon M,Rufty JW,Mackown CT,Carter TE.Aluminum accumulation and associated effect on15NO3-influx in roots of two soybean genotypes differing in Al tolerance.Plant and Soil.164:291-295);铝胁迫使根中磷的浓度增加,可能的原因是铝使磷在根的表面沉积,从而减低磷的运转(Ryan PR,Skerrett M,Findlay GP,Delhaize E,Teyman SD.1997.Aluminum activates an anion channel in the apical cells of wheat roots.Proceedings of the National Academy of Sciences.94:6547-6552),因而影响与磷有关的代谢活动;酸性土壤上的小麦缺镁,施用镁肥只能消除症状,而不能改善整体营养;施用石灰即使不增施镁肥,不但可以消除铝毒,缺镁也自然消失,故认为酸性土壤小麦缺镁为铝所诱发,其实质是铝毒,或可以认为是铝毒的一种形态表现(施洁斌,秦遂初,单英杰.1997.酸性土壤小麦缺镁与铝及钙、钾元素的关系研究.浙江农业科学.6:282-284)。植物在长期的进化过程中,逐渐形成了许多抵抗铝毒胁迫的生理机制,其中最直接的生理特征是植物通过根系表皮细胞的柠檬酸转运蛋白向外分泌柠檬酸,直接螯合土壤中的铝,从而降低铝对根系的毒害效应(Furukawa J,Yamaji N,Wang H,Mitani N,Murata Y,Sato K,Katsuhara M,Takeda K,Ma JF.2007.An aluminum-activated citrate transporter in barley.Plant Cell Physiology.48:1081-1091)。

    目前在植物中功能研究清楚的柠檬酸运输蛋白属于MATE蛋白家族。MATE(Multidrug and Toxic Compound Extrusion)家族是一个很大的家族,在细菌、真菌、植物和哺乳动物中广泛存在,该家族蛋白一般包含400-700个氨基酸,并且形成典型12个横跨细胞膜的跨膜区(Omote H,Hiasa M,Matsumoto T,Otsuka M,Moriyama Y.2007.The MATE proteins as fundamental transporters of metabolic and xenobiotic organic cations.Trends in Pharmacological Sciences.11:587-593),目前植物中的这些蛋白同源性较低,其蛋白的同源一致性仅为40%。有研究表明,当大麦和高粱受铝胁迫诱导时,根系会分泌大量的柠檬酸。在许多植物中,这种以MATE家族为转运载体分泌柠檬酸的机制是抵抗铝胁迫的主要机制(Ma JF,Ryan PR,Delhaize E.2001.Aluminum tolerance in plants and the complexing roleof organic acids.Trends in Plant Science.6:273-278;Kochian LV,Pineros MA,Hoekenga OA.2005.The physiology,genetics and molecular biology of plant aluminum resistance and toxicity.Plant and Soil.274:175-195;Delhaize E,Gruber BD,Ryan PR.2007.The roles of organic anio permeases in aluminum resistance and mineral nutrition.Federation of European Biochemical Societies Letters.581:2255-2262;Furukawa J,Yamaji N,Wang H,Mitani N,Murata Y,Sato K,Katsuhara M,Takeda K,Ma JF.2007.An aluminum-activated citrate transporter in barley.Plant Cell Physiology.48:1081-1091;Magalhaes JV,Liu J,Guimaraes CT,等.2007.A gene in the multidrug and toxic compound extrusion(MATE)family confers aluminum tolerance in sorghum.Nature Genetics.39:1156-1161)。

    大麦HvAACT1基因属于MATE家族,主要在受到铝胁迫后的大麦植株根部表达,主要定位在大麦根尖的表皮细胞,同时在蛙卵细胞的异源表达说明HvAACT1基因与柠檬酸分泌有关。HvAACT1基因在烟草中的超表达与野生型烟草的比较又说明该基因可以提高植株根系柠檬酸的分泌量,从而产生明显的抗铝胁迫能力,因此证明大麦HvAACT1基因是一个受铝诱导的柠檬酸转运载体,可以抵抗大麦生长环境中所存在的铝胁迫(Furukawa J,Yamaji N,Wang H,Mitani N,Murata Y,Sato K,Katsuhara M,Takeda K,Ma JF.2007.An aluminum-activated citrate transporter in barley.Plant Cell Physiology.48:1081-1091)。

    高粱中SbMATE基因,也被证明是一个受铝诱导的柠檬酸转运载体,可以抵抗环境中特别是酸性土壤中的铝毒胁迫,从而减轻铝毒对高粱的侵害,确保了作物产量,为人类生存提供了更好的粮食保证和安全(Magalhaes JV,Liu J,Guimaraes CT,等.2007.A gene in the multidrug and toxic compound extrusion(MATE)family confers aluminum tolerance in sorghum.Nature Genetics.39:1156-1161;Magalhaes JV.2010.How a microbial drug transporter became essential for crop cultivation on acid soils:aluminium tolerance conferred by the multidrug and toxic compound extrusion(MATE)family.Annals of Botany.106:199-203)。

    关于MATE基因研究最清楚的植物是拟南芥。在拟南芥中,受铝诱导后,根系分泌的柠檬酸和苹果酸对植物抵抗铝胁迫也起到十分重要的作用。AtMATE基因与高粱和大麦抵抗铝胁迫的基因具有很高的相似性,该基因编码了一个柠檬酸运输载体,分泌柠檬酸螯合铝以抵抗铝胁迫。AtMATE主要在根中表达,在敲除了AtMATE基因的拟南芥突变体AtMATE-Ko中,铝诱导的根系分泌的柠檬酸急剧减少,使得植物在抵抗铝胁迫方面的能力明显减弱。同样,AtALMT1基因作为苹果酸的运输载体,也可以分泌苹果酸来螯合铝,敲除该基因的突变体AtALMT1-Ko同样会由于不能向外分泌足够的苹果酸而导致拟南芥遭受铝毒害,根系生长受到明显抑制。AtMATE和AtALMT1这两个基因是通过相互独立的过程参与拟南芥的耐铝胁迫反应,其中编码苹果酸运输载体的AtALMT1基因所起到的作用要更大些。当拟南芥中AtMATE和AtALMT1两个基因同时被敲除时,双突变体Atdouble-Ko受铝胁迫诱导根系向外分泌的柠檬酸和苹果酸都明显减少,导致植物相比单突变体(AtMATE-Ko和AtALMT1-Ko)产生更敏感的铝毒胁迫症状(Liu JP,Magalhaes JV,Shaff J,Kochian LV.2009.Aluminum-activated citrate and malate transporters from the MATE and ALMT families function independently to confer Arabidopsis aluminum tolerance.The Plant Journal.57:389-399;Liu JP,Luo XY,Shaff J,Liang CY,Jia XM,Li ZY,Magalhaes J,Kochian LV.2012.A promoter-swap strategy between the AtALMT and AtMATE genes increased Arabidopsis aluminum resistance and improved carbon-use efficiency for aluminum resistance.The Plant Journal.71:327-337)。

    目前,已经鉴定了功能且与耐铝毒有关的MATE基因家族成员主要有大麦HvAACT1、高粱SbMATE、拟南芥AtMATE、ScFRDL2(Secale cereale)、玉米ZmMATE1、水稻OsFRDL4等(Furukawa J,Yamaji N,Wang H,Mitani N,Murata Y,Sato K,Katsuhara M,Takeda K,Ma JF.2007.An aluminum-activated citrate transporter in barley.Plant Cell Physiology.48:1081-1091;Magalhaes JV,Liu J,Guimaraes CT,等.2007.A gene in the multidrug and toxic compound extrusion(MATE)family confers aluminum tolerance in sorghum.Nature Genetics.39:1156-1161;Liu JP,Magalhaes JV,Shaff J,Kochian LV.2009.Aluminum-activated citrate and malate transporters from the MATE and ALMT families function independently to confer Arabidopsis aluminum tolerance.The Plant Journal.57:389-399;Yokosho K,Yamaji N,Ma JF.2010.Isolation and characterisation of two MATE genes in rye.Functional Plant Biology.37:296-303;Yokosho K,Yamaji N,Ma JF.2011.An Al-inducible MATE gene is involved in external detoxification of Al in rice.The Plant Journal.68:1061-1069;Maron LG,Pineros MA,Guimaraes CT,Magalhaes JV,Pleiman JK,Mao CZ,Shaff J,Belicuas SNJ,Kochian LV.2010.Two functionally distinct members of the MATE(multi-drug and toxic compound extrusion)family of transporters potentially underlie two major aluminum tolerance QTLs in maize.The Plant Journal.61:728-740)。而在花生中,与耐铝胁迫有关的MATE基因目前还尚未有任何报导。花生是我国广泛种植的主要油料作物之一,研究花生根系柠檬酸转运载体基因将从分子育种及基因工程技术角度为耐铝花生品种选育以及其它耐铝作物的培育提供重要的理论依据和技术支撑。

    发明内容

    本发明的目的是提供花生柠檬酸转运蛋白基因AhFRDL1在提高植物抗铝毒胁迫中的应用。

    所述花生柠檬酸转运蛋白基因AhFRDL1具有(1)或(2)所示的核苷酸序列:

    (1)SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列;

    (2)SEQ ID No.1所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或几个核苷酸而形成的具有同等功能的核苷酸序列。

    所述花生柠檬酸转运蛋白基因AhFRDL1编码的花生柠檬酸转运蛋白具有(1)或(2)所示的氨基酸序列:

    (1)SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列;

    (2)SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等功能的由(1)衍生的蛋白质。

    本发明提供了所述花生柠檬酸转运蛋白基因AhFRDL1在提高植物抗铝毒胁迫中的应用。

    所述应用为将所述花生柠檬酸转运蛋白基因AhFRDL1或含所述花生柠檬酸转运蛋白基因AhFRDL1的重组表达载体转入植物细胞中,筛选转基因植物,使转基因植物表达花生柠檬酸转运蛋白,从而提高植物的抗铝毒胁迫的能力。

    优选地,所述含花生柠檬酸转运蛋白基因AhFRDL1的重组表达载体为pBAR1-AhFRDL1,其构建方法如下:

    (1)提取花生样品RNA并反转录获得cDNA,以cDNA为模板,以AhFRDL1-F和AhFRDL1-R为引物,进行PCR;

    AhFRDL1-F:5’-TGGTAGAGAAAATGGCTGAGAAG-3’(SEQ ID NO.3);

    AhFRDL1-R:5’-AACATGATTGCATTCATCTCCAT-3’(SEQ ID NO.4);

    (2)将步骤(1)得到的PCR产物克隆连接到pMD20-T载体上,获得载体pMD20-T-AhFRDL1;

    (3)以载体pMD20-T-AhFRDL1为模板,以35s-AhFRD1-F和35s-AhFRD1-R为引物,进行PCR;

    35s-AhFRD1-F:5’-ACGCCCCGGGATGGCTGAGAAGCAG-3’(SEQ ID NO.5);

    35s-AhFRD1-R:5’-CGGGATCCTTTCTCCATAGGAATTCCCA AG-3’(SEQ ID NO.6);

    (4)将步骤(3)得到的PCR产物克隆到pGEM-T载体中,获得载体pGEM-T-AhFRDL1;

    (5)将载体pGEM-T-AhFRDL1和pBAR1同时用XmaI和BamHI进行双酶切,回收AhFRDL1目的片段和pBAR1载体片段,连接,构建重组表达载体pBAR1-AhFRDL1。

    优选地,所述植物为花生、拟南芥。

    本发明具有如下有益效果:

    本发明首次证明了花生柠檬酸转运蛋白基因AhFRDL1具有抵抗铝胁迫的生物学功能。本发明将AhFRDL1基因转入到拟南芥抗铝功能缺失的两个突变体AtALMT1-Ko、AtMATE-Ko和双突变体Atdouble-Ko中,得到转基因植株,并以野生型和各拟南芥突变体为对照,得到:

    (1)培养基条件下不同转基因拟南芥有不同的抗铝生长最适浓度。双突变体Atdouble-Ko同时敲除了拟南芥中两个抵抗铝胁迫的基因AtALMT1和AtMATE,对铝毒响应最敏感,在50μM AlCl3处理时转基因拟南芥抗铝效果显著;单突变体AtMATE-Ko在400μMAlCl3处理时,转基因拟南芥抗铝效果显著;单突变体AtALMT1-Ko在200μM AlCl3处理时,转基因拟南芥抗铝效果显著。

    (2)转基因拟南芥与突变体相比能够明显促进根系生长。双突变体Atdouble-Ko转基因拟南芥根系相对增加42%-50%,单突变体AtMATE-Ko转基因拟南芥根系相对增加45%-62%,单突变体AtALMT1-Ko转基因拟南芥根系相对增加21%-37%。

    (3)转基因拟南芥与突变体相比根系柠檬酸分泌量显著增加。双突变体Atdouble-Ko转基因拟南芥根系向外分泌柠檬酸量是突变体的2.6-5.4倍,单突变体AtMATE-Ko转基因拟南芥根系向外分泌柠檬酸量是突变体的1.4-1.8倍,单突变体AtALMT1-Ko转基因拟南芥根系向外分泌柠檬酸量是突变体的1.3倍;而三种转基因拟南芥根系分泌的苹果酸量与相应突变体分泌的苹果酸量无显著差异。

    (4)AhFRDL1基因是目前在没有测序的花生植株中被证明的第一个能够抗铝毒的基因,主要通过根系向外分泌柠檬酸抵抗铝胁迫。

    本发明首次证明花生根系柠檬酸转运蛋白基因AhFRDL1是一个调控柠檬酸向植物体外分泌的基因,并且参与了植物抵抗铝胁迫的生物学过程,运用分子生物学及基因工程技术从多角度验证表明了该基因与根系分泌柠檬酸密切相关,这不仅为进一步深入促进植物耐铝分子机制的研究提供了重要的依据,而且也为从植物分子育种或基因工程层面培育耐铝毒作物进而提高作物的产量和品质奠定了重要的基础,因此可以将花生根系柠檬酸转运蛋白基因AhFRDL1应用于提高植物的抗铝毒胁迫中,进一步培育耐铝植物,具有长远的理论和实践意义,其应用前景十分广阔。

    附图说明

    图1为不同浓度铝处理下柠檬酸缺失突变体(AtMATE-Ko)转基因拟南芥相对根系生长量,各拟南芥株系的相对根系生长量对应的Al3+浓度从左到右依次为50,100,150,200,250,300,350,400,450μM。

    图2为不同浓度铝处理下苹果酸缺失突变体(AtALMT1-Ko)转基因拟南芥相对根系生长量,各拟南芥株系的相对根系生长量对应的Al3+浓度从左到右依次为25,50,100,150,200,250μM。

    图3为不同浓度铝处理下双突变体(Atdouble-Ko)转基因拟南芥相对根系生长量,各拟南芥株系的相对根系生长量对应的Al3+浓度从左到右依次为50,100,150,200μM。。

    图4为最适浓度铝胁迫(400μM AlCl3)处理柠檬酸缺失突变体(AtMATE-Ko)转基因拟南芥根系生长状况。

    图5为最适浓度铝胁迫(200μM AlCl3)处理苹果酸缺失突变体(AtALMT1-Ko)转基因拟南芥根系生长状况。

    图6为最适浓度铝胁迫(50μM AlCl3)处理双突变体(Atdouble-Ko)转基因拟南芥根系生长状况。

    图7为柠檬酸缺失突变体(AtMATE-Ko)转基因拟南芥400μMAlCl3处理根系柠檬酸(A)和苹果酸(B)的分泌量。

    图8为苹果酸缺失突变体(AtALMT1-Ko)转基因拟南芥200μMAlCl3处理根系柠檬酸(A)和苹果酸(B)的分泌量。

    图9为双突变体(Atdouble-Ko)转基因拟南芥50μM AlCl3处理根系柠檬酸(A)和苹果酸(B)的分泌量。

    图10为(A)柠檬酸缺失突变体(AtMATE-Ko)、(B)苹果酸缺失突变体(AtALMT1-Ko)和(C)双突变体(Atdouble-Ko)转基因拟南芥中AhFRDL1基因的相对表达量。

    具体实施方式

    以下实施例用于说明本发明,但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下,对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换,均属于本发明的范围。

    若未特别指明,本发明实施例中所用的实验材料、试剂和仪器等均可市售获得,若未具体指明,实施例中所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。

    拟南芥单突变体AtALMT1-Ko、AtMATE-Ko和双突变体Atdouble-Ko参见Liu JP,Magalhaes JV,Shaff J,Kochian LV.2009.Aluminum-activated citrate and malate transporters from the MATE and ALMT families function independently to confer Arabidopsis aluminum tolerance.The Plant Journal.57:389-399。

    实施例1花生AhFRDL1基因的克隆

    (1)花生水培培养

    将花生种子鲁花14(购于中国农业科学院)用10%双氧水消毒30分钟,清洗干净后置于饱和硫酸钙溶液中约8小时,并通气避光。之后置于铺有吸水纸的托盘中,浇适量的水后避光置于人工培养室中。培养室设置条件为光照14小时30℃,黑暗10小时22℃。1天左右花生发出小芽后移入石英砂中培养,待长出2片叶子后转入水培营养液中培养。水培营养液配方如下:KH2PO4(0.5mM)、K2SO4(0.75mM)、KCl(0.1mM)、MgSO4·7H2O(0.65mM)、CaSO4·2H2O(2mM)、H3BO3(1μM)、MnSO4·4H2O(1μM)、ZnSO4·7H2O(1μM)、CuSO4·5H2O(0.1μM)、(NH4)6Mo7O24·4H2O(0.005μM)、EDTA-Fe(80μM),pH值为5.8-6。

    (2)花生RNA提取并反转录为cDNA

    把保存于-80℃的花生根系及叶片样品放入用液氮预冷的研钵中,加入液氮研磨植物样品直至成粉末状,取出约0.1g粉末样品于1.5ml无RNase离心管中,加入1ml Trizol。涡旋震荡15s,室温静置5min,加入200μl氯仿,充分混匀,静置5min,4℃离心,12000rpm,15min,取上清液入1.5ml的离心管中,加入500μl异丙醇,混匀,室温静置10min,于4℃12000rpm离心10min,取出后倒掉上清液,加入1ml75%的乙醇,涡旋震荡数秒,4℃7500rpm离心5min,重复洗涤两次,倒掉乙醇并吸去剩余上清液后,离心管于室温下风干。加入适量的DEPC水和RNA酶抑制剂,得到RNA,并反转录为cDNA。

    (3)基因全长克隆

    设计扩增该基因全长的引物,分别为:

    AhFRDL1-F:5’-TGGTAGAGAAAATGGCTGAGAAG-3’(SEQ ID NO.3);

    AhFRDL1-R:5’-AACATGATTGCATTCATCTCCAT-3’(SEQ ID NO.4)。

    PCR反应体系为:将cDNA稀释5倍后取2μl,10×反应缓冲液2μl,dNTP(10mM)0.5μl,MgCl2(50mM)0.5μl,正向引物AhFRDL1-F(0.01mM)0.5μl,反向引物AhFRDL1-R(0.01mM)0.5μl,ddH2O13.7μl,TaqDNA聚合酶(invitrogen公司)0.3μl。

    将上述PCR反应体系混合后进行PCR反应,程序为:94℃预变性3min;94℃变性30s,55℃退火30s,72℃延伸2min,30个循环;72℃延伸10min。

    PCR反应后琼脂糖凝胶电泳得到预期约1.6kb的DNA条带,进行胶回收纯化,获得DNA全长。然后将回收得到的DNA连接到pMD20-T载体(TaKaRa公司),16℃过夜,转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞(TIANGEN公司),涂于含Amp抗生素的LB板,37℃过夜培养,挑单克隆于LB液体37℃过夜摇菌,送菌液测序(上海生物工程公司)确定序列的正确性,并提取正确质粒,得载体pMD20-T-AhFRDL1。AhFRDL1基因序列如SEQ ID No.1所示(2034bp),对应氨基酸序列为SEQ ID No.2。

    实施例2重组表达载体的构建

    1、构建载体

    (1)通过引物添加酶切位点XmaI和BamHI,以载体pMD20-T-AhFRDL1为模板进行PCR;

    引物序列为:

    35s-AhFRD1-F:5’-ACGCCCCGGGATGGCTGAGAAGCAG-3’(SEQ ID NO.5);

    35s-AhFRD1-R:5’-CGGGATCCTTTCTCCATAGGAATTCCCAAG-3’(SEQ ID NO.6);

    (2)将PCR产物克隆到pGEM-T载体中,转化DH5α感受态细胞后,挑选阳性克隆,培养细菌并提取质粒,得到载体pGEM-T-AhFRDL1;

    (3)将载体pGEM-T-AhFRDL1和pBAR1载体同时用XmaI和BamHI进行双酶切,分别回收AhFRDL1基因目的片段和pBAR1载体片段,然后用T4连接酶连接AhFRDL1基因目的片段和酶切后的pBAR1载体片段,构建35S强启动子驱动基因表达的载体;

    (4)将连接产物转化到DH5α感受态细胞,挑选阳性克隆,提取质粒,酶切检测并测序;

    (5)确定序列正确后,将正确质粒pBAR1-AhFRDL1电转化到GV3101农杆菌中,以备后续试验。

    2、电转化(农杆菌)

    (1)使用BIO-RAD电击转化仪,1.8kV电压,电阻200Ω;

    (2)将1μL质粒pBAR1-AhFRDL1加入到100μL农杆菌感受态细胞中,混匀,冰上放置60sec;

    (3)将混合液转移到预冷的电击杯中,迅速将电击杯放入电转化炉;按下“Pulse”键,听到响声后迅速取出电击杯;

    (4)立即加入1mL YEB液体培养基,并将液体转移至新的1.5mL离心管中;

    (5)28℃复舒培养2h;

    (6)在超净台中,准备含相应抗生素的平板;

    (7)将菌液取回,在超净台中轻轻混匀,取适量菌液(如100μL)滴至平板上,用冷却的涂布器在平板上将菌液均匀涂布,用封口膜将培养皿口封住;

    (8)将平板放置在28℃培养箱培养48h;

    (9)从平板上挑选菌落进行检测并保存,然后将平板放置在4℃冰箱保存。

    实施例3花生AhFRDL1基因对拟南芥单突变体AtALMT1-Ko、AtMATE-Ko和双突变体Atdouble-Ko的功能互补试验

    1.1转入AhFRDL1基因的拟南芥植株的获得

    将实施例2得到的重组表达载体pBAR1-AhFRDL1通过转基因技术分别转化到抗铝功能缺失的三个拟南芥突变体中:(1)拟南芥耐铝的基因AtALMT1(苹果酸运输载体)敲除的单突变体AtALMT1-Ko;(2)拟南芥耐铝的基因AtMATE(柠檬酸运输载体)敲除的单突变体AtMATE-Ko;(3)AtALMT1和AtMATE同时敲除的拟南芥双突变体Atdouble-Ko。

    具体操作步骤如下:用1%的琼脂糖浸泡拟南芥种子,将种子用移液枪点到混有蛭石的营养土中(蛭石与营养土的比例为1:1,塑料盆中装满土,用水浇土直到达到饱和),用塑料薄膜覆盖住土。放在22℃的温室,16h光照8h黑暗处理,并浇用营养液。待第一个花序长到5-15cm,第二个花序刚出现时移苗到另一个盆中。在移苗的同时,将构建好的重组表达载体pBAR1-AhFRDL1转入农杆菌GV3101中,待拟南芥长到出现第一个花序时完成转化。

    将已转入重组表达载体pBAR1-AhFRDL1的GV3101农杆菌接种到在5mL的LB培养基(含有卡那霉素)中,在恒温振荡培养器中30℃200rpm震荡过夜培养;第二天,将过夜培养的农杆菌接种5mL到500mL的LB培养液中,加入50mg/L Rif(利福平抗生素),50g Sucrose(蔗糖),500ul Silwet L-77,培养;第三天,取上述菌液离心20min,弃去上清液,用转化介质(每100mL无菌水中加入0.433g MS培养基,5g蔗糖,25ul Silwet L-77)重悬沉淀至OD值达到0.8左右。在温室平台上放好滤纸,将植株平放到台子上,将拟南芥的花序浸入含有农杆菌的培养液中1分钟后将浸在农杆菌中的拟南芥拿出,平放,并用塑料薄膜覆盖住,在温室中(22℃)过夜。第二天,拟南芥植株直立生长,每天浇用营养液,拟南芥恢复正常生长。当种子成熟时,将种子收集到15ml或50ml的离心管中。

    将收获的种子放入1.5mL的灭菌管中,75%乙醇浸润30s,振荡混合,无菌水冲洗一次,1.5%次氯酸钠消毒60s(期间不停震荡,及时吸出),无菌水冲洗6次,消毒完成后加入1mL灭菌水,放入4℃冰箱中,春化2天。MS培养基(配方见表1-1)培养春化好的种子,长出一个真叶时,移苗进营养土(蛭石与营养土以1:1的比例混合均匀,120℃,20min灭菌)中培养(开始覆盖保鲜膜,保持水分),每天浇水,待植株长到4-6片叶子时喷100mg/L的除草剂,每隔两天喷一次,连续喷5次,部分拟南芥死亡,继续种植存活的幼苗,待成熟,单株收取种子得到T1代转基因种子。

    表1-1MS培养基配方

    注:加琼脂粉前调节pH值到7.0

    1.2转基因植株T3代种子的获得

    同样的方法获得T2代转基因种子,将选好的转基因株系的T2代种子放入1.5mL的灭菌管中,75%乙醇浸润30S,振荡混合,无菌水冲洗一次,1.5%次氯酸钠消毒60s(期间不停震荡,及时吸出),无菌水冲洗6次,消毒完成后加入1mL灭菌水,放入4℃冰箱中,春化2天。将蛭石和营养土灭菌(120℃,20min)。将蛭石与营养土以1:1的比例混合均匀,装盆,点种前浇水至饱和。

    将春化后的种子点种,点种要均匀,点种后用塑料薄膜覆盖住盆子,放在拟南芥培养室中培养,室内温度22℃,光照16h黑暗8h光照处理,植物出苗后,将塑料薄膜揭开,适当浇水。拟南芥长到4-6片叶子时喷100mg/L的除草剂,每隔两天喷一次,连续喷5次,部分拟南芥死亡,继续种植存活的幼苗,待拟南芥成熟时,单株收取种子,得到T3代转基因纯合体种子,以备后续试验使用。

    按照上述方法,分别得到转入AhFRDL1基因的拟南芥单突变体AtALMT1-Ko、AtMATE-Ko和双突变体Atdouble-Ko的转基因拟南芥T3代种子。

    1.3不同铝胁迫对拟南芥转基因植株根系生长的影响

    试验材料:野生型拟南芥WT种子,拟南芥单突变体AtALMT1-Ko、AtMATE-Ko和双突变体Atdouble-Ko种子,转入AhFRDL1基因的转基因拟南芥T3代种子。其中,转入AhFRDL1基因的拟南芥单突变体AtMATE-Ko的不同转基因拟南芥株系为AtAm2、AtAm8、AtBm10;转入AhFRDL1基因的拟南芥单突变体AtALMT1-Ko的不同转基因拟南芥株系为AtAa10、AtAa18、AtBa14;转入AhFRDL1基因的拟南芥双突变体Atdouble-Ko的不同转基因拟南芥株系为AtBd1、AtBd2、AtBd4。

    将种子放入1.5mL的灭菌管中,75%乙醇浸润30s,振荡混合,无菌水冲洗一次,1.5%次氯酸钠消毒60s(期间不停震荡,及时吸出),无菌水冲洗7次,消毒完成后加入1mL灭菌水,放入4℃冰箱中,春化2天。配置营养培养基(配方见表1-2),灭菌后加入不同铝浓度处理调节pH为4.2。AtALMT1-Ko设置0,25,50,100,150,200,250μM Al3+七个铝浓度梯度,AtMATE-Ko设置0,50,100,150,200,250,300,350,400,450μM Al3+十个铝浓度梯度,Atdouble-Ko设置0,50,100,150,200μM Al3+五个铝浓度梯度,倒板凝固后将春化好的种子点到不同铝处理浓度培养基表面,每个梯度设三板重复,并水平放到适宜拟南芥生长的条件中培养。温度:22℃,湿度:70%左右,光照强度:120μmol/m2/s,长日照条件:16h光照,8h黑暗。

    表1-2拟南芥培养基营养配方(pH4.2)

    注:拟南芥营养液pH值调到4.2

    培养7天后定量主根长,比较不同试验材料在不同铝处理时根系生长状况,确定最适宜铝处理浓度后重复定量根长,分析转基因植株根系生长状况。计算指标:相对根系生长量:RNRG%

    RNRG%=加铝环境生长根长/对照不加铝根长×100

    如图1-图3所示,培养基条件下不同转基因拟南芥有不同的抗铝生长最适浓度。单突变体AtMATE-Ko在400μM AlCl3处理时,转基因拟南芥抗铝效果显著(图1)。单突变体AtALMT1-Ko在200μMAlCl3处理时,转基因拟南芥抗铝效果显著(图2)。双突变体Atdouble-Ko同时敲除了拟南芥中两个抵抗铝胁迫的基因AtALMT1和AtMATE,对铝毒响应最敏感,在50μM AlCl3处理时转基因拟南芥抗铝效果显著(图3)。

    确定最适铝浓度处理后,同样方法分析比较不同试验材料在对照(不加铝)处理和最适铝浓度处理下根系生长状况的差异,分析AhFRDL1基因对拟南芥在铝胁迫下根长生长的影响。

    如图4-图6所示,转基因拟南芥与突变体相比能够明显促进根系生长。单突变体AtMATE-Ko转基因拟南芥根系相对突变体增加45%-62%(图4),单突变体AtALMT1-Ko转基因拟南芥根系相对突变体增加21%-37%(图5),双突变体Atdouble-Ko转基因拟南芥根系相对突变体增加42%-50%(图6)。

    1.4铝胁迫对拟南芥转基因植株根系柠檬酸、苹果酸分泌量的影响

    试验材料:野生型拟南芥WT种子,拟南芥单突变体AtALMT1-Ko、AtMATE-Ko和双突变体Atdouble-Ko种子,转入AhFRDL1基因的转基因拟南芥T3代种子。其中,转入AhFRDL1基因的拟南芥单突变体AtMATE-Ko的不同转基因拟南芥株系为AtAm2、AtAm8、AtBm10;转入AhFRDL1基因的拟南芥单突变体AtALMT1-Ko的不同转基因拟南芥株系为AtAa10、AtAa18、AtBa14;转入AhFRDL1基因的拟南芥双突变体Atdouble-Ko的不同转基因拟南芥株系为AtBd1、AtBd2、AtBd4。

    正常培养基培养拟南芥:将种子放入1.5mL的灭菌管中,75%乙醇浸润30S,振荡混合,无菌水冲洗一次,1.5%次氯酸钠消毒60s(期间不停震荡,及时吸出),无菌水冲洗7次,消毒完成后加入1mL灭菌水,放入4℃冰箱中,春化2天。配置营养培养基(配方见表1-2),灭菌后不加铝处理调节pH为4.2。倒培养基平板凝固后,将春化好的种子点在正常培养基上培养10d。

    收集根系分泌物:将上述培养基中的拟南芥植株,每20株放于一个装有根系分泌物收集液的2mL离心管中(收集液成分:过滤灭菌的0.66mM CaCl2中加入适宜铝浓度后调节pH为4.2),在正常的培养环境条件下(温度:22℃,湿度:70%左右,光照强度:120μmol/m2/s,长日照条件(16h光照,8h黑暗))收集24h。收集完毕后在收集液中加入微量微生物抑制剂以防止有机酸被降解,-80℃保存。

    冻干浓缩:为使收集到的根系分泌物达到或超过有机酸测定所需最低浓度,将三管(即60株)收集好的根系分泌物合并成一管,并放在冻干仪中冻干浓缩,干燥处保存,浓缩后为黄色粉末物质,待测。

    取1mL高纯水充分溶解冻干浓缩物后,高效液相色谱HPLC测定根系分泌物中柠檬酸、苹果酸含量,并做数据分析,比较不同拟南芥材料在铝胁迫下柠檬酸的分泌量。

    如图7-图9所示,转基因拟南芥与突变体相比根系柠檬酸分泌量显著增加。单突变体AtMATE-Ko转基因拟南芥根系向外分泌柠檬酸量是突变体的1.4-1.8倍(图7),单突变体AtALMT1-Ko转基因拟南芥根系向外分泌柠檬酸量是突变体的1.3倍(图8),双突变体Atdouble-Ko转基因拟南芥根系向外分泌柠檬酸量是突变体的2.6-5.4倍(图9)。而三种转基因拟南芥根系分泌的苹果酸量与相应突变体分泌的苹果酸量无显著差异。图7-9中字母abc表示各柱子数值之间的方差分析,相同字母表示数值之间无显著差异,不同字母则表示存在显著差异。

    1.5铝胁迫对转基因植株AhFRDL1基因表达的影响

    1.5.1试验材料

    野生型拟南芥WT种子,拟南芥单突变体AtALMT1-Ko、AtMATE-Ko和双突变体Atdouble-Ko种子,转入AhFRDL1基因的转基因拟南芥T3代种子。其中,转入AhFRDL1基因的拟南芥单突变体AtMATE-Ko的不同转基因拟南芥株系为AtAm2、AtAm8、AtBm10;转入AhFRDL1基因的拟南芥单突变体AtALMT1-Ko的不同转基因拟南芥株系为AtAa10、AtAa18、AtBa14;转入AhFRDL1基因的拟南芥双突变体Atdouble-Ko的不同转基因拟南芥株系为AtBd1、AtBd2、AtBd4。

    1.5.2提取RNA

    在收集完根系分泌物后快速取出拟南芥植株,轻轻洗净蘸干后分开收取拟南芥地上部(如:叶)和地下部(如:根)约100mg,迅速装入2mL无RNA酶离心管,放入液氮迅速冷冻并于-80℃保存。在保存有植物样品的离心管中加入2粒灭菌小钢珠,并放在漩涡仪中多次振荡研磨。待所有管子的样品研磨好后,用RNA提取试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司,货号DP432)提取RNA。

    RNA提取试剂盒提取RNA:

    2mL研磨好样品的离心管中加入450μL RL(使用前加入β-巯基乙醇,1mL RL中加入10μLβ-巯基乙醇)剧烈震荡混匀。将所有溶液转移至过滤注CS上(过滤柱CS放在收集管中),12000rmp离心5min,小心吸取收集管中的上清至RNase-Free的离心管中,洗头尽量避免接触收集管中的细胞碎片沉淀。缓慢加入0.5倍上清体积的无水乙醇(通常为225μL),混匀将得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱CR3中,12000rmp离心60s,倒掉收集管中的废液,将吸附柱CR3放回收集管中。向吸附柱中加入350μL去蛋白液RW1,12000rmp离心60s,倒掉收集管中的废液,将吸附柱CR3放回收集管中。向吸附柱CR3中央加入80μL DNase I工作液(10μL DNase I储存液放入新的RNase-Free的离心管中,加入70μL RDD溶液轻柔混匀),室温放置15min。向吸附柱CR3中加入350μL去蛋白液RW1,12000rmp离心60s,倒掉收集管中的废液,将吸附柱CR3放回收集管中。向吸附柱CR3中加入500μL漂洗液RW(加入乙醇),室温静置2min,12000rmp离心60s,倒掉收集管中的废液,将吸附柱CR3放回收集管中。同样再次加入500μL漂洗液RW,室温静置2min,12000rmp离心2min,倒掉废液。将吸附柱CR3置于室温放置数分钟,以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。将吸附柱CR3放入一个新的RNase-Free的离心管中,向吸附膜的中间部位悬空滴加50μLRNase-Free dd H2O,室温放置2min,12000rmp离心2min,得到拟南芥RNA。

    1.5.3RNA浓度和纯度的测定和反转录

    OD260/OD280应为1.7-2.1,低于1.7,说明有蛋白或酚污染。OD260/OD230应大于2.0,低于该值,说明有糖、盐、胍等小分子污染。

    反转录(cDNA第一条链的合成):按照反转录试剂盒(M-MLV逆转录酶,Promega普洛麦格生物技术有限公司,货号M1701)的说明书操作,将2μg总RNA样品,5μL Oligo(dt)18primer(Oligo(dt)18引物)加入到离心管中,加DEPC水到总体积15μL,轻轻混匀,不可剧烈;70℃严格加热5min,立即置于冰上2min;短暂离心后将反应物收集于底部,加以下反应物入管中:1.25μL的dNTP混合液(10mM),5μL的M-MLV5×缓冲液,1μL的M-MLV Reverse Transcriptase(M-MLV反转录酶),0.5μL的RNase inhibitor(RNase抑制剂),DEPC水补足至25μL;42℃温浴1h;冰上冷却。cDNA可直接用于PCR反应且在-20℃可存放3个月。

    Real-time PCR:基因PCR的引物采用Primer premier5.0和Oligo6软件设计,引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

    引物序列为:

    AhFRD1RTF:5’-GAAGATGTTAAAGTCCTCCAT-3’(SEQ ID NO.7);

    AhFRD1RTR:5’-ACCAGCAGATGACATGATAAG-3’(SEQ ID NO.8)。

    以反转录形成的cDNA为模板,每个反应体系中分别加入SYBR Green Realtime PCR Master Mix12.5μL,上下游引物各1μL,模板cDNA为3μL,总反应体系为25μL,剩余用灭菌水补足。把反应物放入ABI公司出产的7500System荧光定量仪器中进行反应,时间约为两个小时。反应程序如下:步骤(1):50℃2min;步骤(2):95℃1min;步骤(3):95℃15s,60℃15s,72℃45s,40个循环;步骤(4):从60℃到98℃,每0.5min上升1℃进行循环。PCR反应完全后,从仪器上导出数据EXCEL进行处理,采用SPSS11.0分析软件,在0.05显著水平下进行分析。

    如图10所示,在各转基因拟南芥突变体植株的根和叶中能够检测到AhFRDL1基因的大量表达,而在野生型和非转基因拟南芥突变体中却检测不到该基因的表达,说明AhFRDL基因成功转入拟南芥突变体并表达。

    本发明首次证明花生根系柠檬酸转运蛋白基因AhFRDL1是一个调控柠檬酸向植物体外分泌的基因,并且参与了植物抵抗铝胁迫的生物学过程,运用分子生物学及基因工程技术从多角度验证说明了该基因与根系分泌柠檬酸密切相关,这不仅为进一步深入研究植物耐铝的分子机制研究提供了重要的依据,而且也为从植物分子育种和基因工程等方面培育铝作物进而提高作物产量和品质提高奠定了重要的基础,因此可以将花生根系柠檬酸转运蛋白基因AhFRDL1应用于提高植物的抗铝毒胁迫中,进一步培育耐铝植物,具有长远的实践意义,其应用前景十分广阔。

    虽然,上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验,对本发明作了详尽的描述,但在本发明基础上,可以对之作一些修改或改进,这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此,在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进,均属于本发明要求保护的范围。

    关 键  词:
    花生 AhFRDL1 基因 提高 植物 抗铝毒 胁迫 中的 应用
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