一种降解PFOA菌株YAB1及其应用.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201510446268.2 (22)申请日 2015.07.28 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 104974969 A (43)申请公布日 2015.10.14 (83)生物保藏信息 CCTCC NO： M2015280 2015.05.07 (73)专利权人 吉首大学 地址 416000 湖南省湘西土家族苗族自治 州吉首市人民南路120号 (72)发明人 易浪波彭清静唐崇俭彭清忠 柴立元 (51)Int.Cl. C12N 1/20(2006.01) A62D。

2、 3/02(2007.01) C12R 1/01(2006.01) A62D 101/28(2007.01) (56)对比文件 CN 102703473 A,2012.10.03, CN 103058319 A,2013.04.24, CN 1680219 A,2005.10.12, US 7767323 B1,2010.08.03, 杨波 等.物化作用氧化降解PFOA/PFOS. 化 学进展 .2014,第26卷(第7期),第1265-1274页. Hiroshi Moriwaki 等.Sonochemical decomposition of perfluorooctane sulfona。

3、te and perfluorooctanoic acid. Environmental Science & Technology .2005,第39卷(第9期),第3388-3392页. Liu J 等.Biotransformation of 8:2 fluorotelomer alcohol in soil and by soil bacteria isolates. Environmental Science & Technology .2007,第41卷(第23期),第8024- 8030页. Huilun Chen 等.Toxicity of perfluorooctanoic a。

4、cid to Pseudomonas putida in the aquatic environment. Journal of Hazardous Materials .2013,第 262卷(第22期),第726-731页. 吴敏 等.含氟有机化合物优势降解菌的筛 选. 环境科学与技术 .2004,第16卷(第1期),第 30-32页. 审查员 马家兴 (54)发明名称 一种降解PFOA菌株YAB-1及其应用 (57)摘要 本发明公开了一种降解PFOA菌株YAB-1及其 应 用 ， 该 P F O A降 解 菌 为 类 黄 色 假 单 胞 菌 （Pseudomonasparafulva） 。

5、， 保藏编号： CCTCC NO： M2015280， 保藏日期： 2015年5月7日， 保藏单 位： 中国典型培养物保藏中心。 利用菌株YAB-1降 解含PFOA物料的方法为： 先将YAB-1单菌落接种 至LB培养基12-18小时， 然后将这个培养基制成 一定OD600的菌悬液， 最后用这个菌悬液处理含 PFOA的物料。 本发明提供了一种降解PFOA菌株 YAB-1及其利用这种菌株处理含PFOA物料的方 法。 该菌株降解PFOA能力强， 处理含PFOA物料的 方法简单、 有效， 能显著降低物料中PFOA的浓度。 权利要求书1页 说明书4页 CN 104974969 B 2017.10.17 。

6、CN 104974969 B 1.一种降解PFOA的类黄色假单胞菌 （Pseudomonas parafulva） YAB-1菌株， 保藏编号： CCTCC NO： M2015280， 保藏日期： 2015年5月7日， 保藏单位： 中国典型培养物保藏中心， 保藏 地址： 中国 武汉 武汉大学。 2.一种利用权利要求1所述类黄色假单胞菌 （Pseudomonas parafulva） YAB-1菌株降解 含PFOA物料的方法， 其特征在于： 先将YAB-1单菌落接种至LB培养基12-18小时， 然后将这个 培养基制成一定OD600的菌悬液， 最后用这个菌悬液处理含PFOA的物料。 权利要求书 1。

7、/1 页 2 CN 104974969 B 2 一种降解PFOA菌株YAB-1及其应用 技术领域 0001 本发明属于生物及环境保护技术领域， 具体指一种降解PFOA菌株YAB-1及其应用 YAB-1降解PFOA的方法。 背景技术 0002 全氟辛酸类化合物 （Perfluorinated octylic acid compounds） 指 C7F15COOH 及 其衍生物。 其中全氟辛酸 （Perfluorooctanoic Acid， 简称 PFOA） 别称十五氟辛酸， 分子式 为C8HF15O2， 分子量为414.07 g/mol， 密度为1.8 g/cm3， 水中溶解度为3.4 g/L。

8、； 溶于极性有 机溶剂。 0003 PFOA 是人工合成的表面活性剂， 由于F具有最大的电负性， 使得 CF 的键能较 大， 为 460 kJ/mol， 是自然界中键能最大的共价键之一， 因而具有很高的化学、 生物和热稳 定性。 但PFOA由于其独特的疏水疏油性质， 被广泛用于纺织、 造纸、 食品包装、 地毯、 皮革和 灭火泡沫等制造工业产品和日用消费品。 0004 很多研究表明， 因为PFOA的稳定性， 使其在环境中很难自然的降解， 因此在全球各 个水域、 各区域的动物和人体内都检测到了PFOA的存在。 由于PFOA具有持久性、 生物累积 性、 致癌、 致畸、 致突变性及内分泌干扰等特性， 。

9、对生态环境和人类健康构成重大危害。 2009 年 斯德哥尔摩公约 将PFOA列为新型持久性环境污染物。 0005 目前， 国内外降解PFOA的方法主要包括化学降解法、 物理降解法和生物降解法。 化 学降解PFOA的方法包括紫外光化学降解法、 水热电化学氧化法等， 但是这些方法成本非常 高并且效率低； 物理降解PFOA的方法主要是光降解法和超声波降解法， 虽然价格没有化学 降解法那么昂贵， 但降解效果不明显， 且容易产生二次污染物。 0006 微生物降解氟类有机化合物已经有氟代苯、 氟苯胺、 多氟双酚、 氟代调聚醇和氟代 调聚磺酸盐等报道， 这些研究结果表明， 自然界中一些微生物存在脱氟酶， 能。

10、对碳氟键发生 攻击。 但目前从自然界中分离筛选到的一些降解PFOA菌株， 其降解能力都非常弱、 且菌种资 源也非常稀缺， 难以能满足环境污染治理的需求。 0007 因此， 加大对PFOA 类持久性有机污染物的降解研究， 筛选高效的PFOA降解菌株， 为后续的降解机理研究和菌株改良提供优良的种质资源， 无论是对于生物技术本身， 还是 环境保护都具有重要意义。 发明内容 0008 本发明要解决的技术问题就是克服现有技术的不足， 提供一种高效降解PFOA的菌 株及其降解PFOA的方法。 0009 本发明人于2013年4月18日在武汉氟化工厂采集长期受PFOA污染的土壤样品。 从 该样品中分离得到一种。

11、降解PFOA菌株YAB-1 （Pseudomonas parafulva YAB-1） , 该PFOA降 解菌为类黄色假单胞菌 （Pseudomonas parafulva） ， 保藏编号： CCTCC NO： M2015280， 保藏日 期： 2015年5月7日， 保藏单位： 中国典型培养物保藏中心， 保藏地址： 中国武汉武汉大学。 说明书 1/4 页 3 CN 104974969 B 3 0010 所述菌株YAB-1的筛选和分离步骤包括： 0011 1、 取样： 样品取自于长期受氟化物污染的土壤， 在低温下带回实验室保存待用。 0012 2、 驯化： 采用梯度压力法驯化样品。 按10%的接。

12、种量接种样品至含PFOA浓度为50 mg/L的驯化培养基中培养2周， 随后每2周将PFOA浓度提高50 mg/L继续培养， 直至PFOA浓度 达到500 mg/L时， 驯化结束， 整个驯化共为期10周。 0013 3、 分离纯化： 在无菌条件下， 移取1 mL驯化液做梯度稀释， 将不同稀释倍数的菌液 涂布于无机盐离子培养基平板上， 30 培养， 挑取生长状态良好的单菌落划线分离， 获得1 株以PFOA为惟一碳源生长的纯菌株。 0014 驯化培养基配置： 1000 mL蒸馏水中加入： NH4NO3 5 g， NaCl 2 g， KH2PO4 1 g， K2HPO4 1 g ， MgSO4 7H2。

13、O 0.5 g ， CaCl22H2O 0.05 g ， 酵母膏 1 g和不同质量的PFOA， 调pH 至7.0， 121灭菌30 min。 0015 分离纯化培养基配置： 1000 mL蒸馏水中加入： NH4NO3 5 g， NaCl 2 g， KH2PO4 1 g， K2HPO4 1 g ， MgSO4 7H2O 0.5 g ， CaCl22H2O 0.05 g， PFOA 500 mg， 琼脂18 g， 调pH到7.0， 121 灭菌30 min。 0016 本发明的另一个目的是提供一种利用菌株YAB-1 （Pseudomonas parafulva YAB- 1） 降解含PFOA物料的。

14、方法， 该方法包括如下步骤： 0017 先将YAB-1单菌落接种至LB培养基12-18小时， 然后将这个培养基制成一定OD600的 菌悬液， 最后用这个菌悬液处理含PFOA的物料。 0018 与现有技术相比， 本发明的有益效果是： 0019 本发明提供了一种新的降解PFOA菌株YAB-1 （Pseudomonas parafulva YAB-1） 及 其利用这种菌株处理含PFOA物料的方法。 该菌株降解PFOA能力强， 是一种能够以PFOA为惟 一碳源生长的菌株， 当环境条件为： 温度30、 pH=7、 接种量2%、 PFOA初始浓度500 mg/L时， 接种菌株YAB-1至无机盐离子培养基中。

15、振荡培养， 经GC-MS测定， PFOA的降解率达32.4%。 利 用菌株YAB-1 （Pseudomonas parafulva YAB-1） 处理含PFOA物料的方法简单、 有效， 能显著 降低物料中PFOA的浓度。 具体实施方式 0020 现结合具体实施例对降解PFOA菌株YAB-1及其应用进一步具体说明。 0021 本发明人于2013年4月18日采集武汉氟化工厂采集长期受PFOA污染的土壤样品， 从该样品中分离得到一种降解PFOA菌株YAB-1 （Pseudomonas parafulva YAB-1） , 该PFOA 降解菌为类黄色假单胞菌 （Pseudomonas parafulv。

16、a） ， 保藏编号： CCTCC NO： M2015280， 保藏 日期： 2015年5月7日， 保藏单位： 中国典型培养物保藏中心， 保藏地址： 中国武汉武汉大学。 0022 菌株YAB-1的筛选方法、 步骤如下： 0023 1、 采集不同样地样品混匀， 四分法取样， 留10 g样品待用。 0024 2、 样品的驯化： 取10 g样品， 接入90 ml富集培养基， 培养2周后， 转入含PFOA浓度 50 mg/L的无机盐培养基， 逐渐提高PFOA浓度驯化培养， 每个浓度梯度驯化2周， 当PFOA浓度 达到500 mg/L时继续培养2周， 驯化结束。 0025 3、 菌株的分离纯化： 取不同稀。

17、释倍数的驯化菌液涂布于分离培养基平板， 选择生 长状态良好， 形态不同的菌落， 采用反复平板划线分离， 获得1株以PFOA为惟一碳源生长的 说明书 2/4 页 4 CN 104974969 B 4 纯菌株YAB-1。 0026 4、 菌株的鉴定： 对菌株进行形态、 生理生化鉴定和16S rDNA序列测定。 0027 （1） 、 采用CTAB法提取细菌YAB-1总DNA。 0028 （2） 、 PCR扩增： 以菌株DNA为模板， 利用通用引物(PA： 5 -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG- 3 和PB： 5 -TTAAGGTGATCCAGCCGCA-3 )进行PCR扩增。 0029 （。

18、3） 、 PCR 反应体系： DNA 模板2 L， 10 PCR Reaction Buffer 5 L， dNTPs 4 L， 引物各1 L， Taq 酶0.25 L， 去离子水36.75 L。 0030 （4） 、 PCR 扩增程序： 95 预变性5 min， 95 变性30 s， 54 退火30 s， 72 延伸90 s， 进行30个循环， 最后72 延伸10 min。 0031 （5） 、 数据处理： PCR 产物由宝生物工程有限公司进行测序， 测序结果提交到 GenBank， 并进行BLAST 分析， 利用Clustal X2 进行多序列比对， 通过MEGA 4 软件采用 neigh。

19、bor-joining 方法构建系统发育树， 对分离菌株进行分类。 0032 5、 环境条件对菌株的生长和降解PFOA的影响： 采用 “单因素实验法” 分别考察PFOA 初始浓度、 接菌量、 初始pH、 温度对菌株YAB-1的生长和降解PFOA的影响。 将处于对数生长期 的菌株YAB-1 （原菌悬液的吸光度OD600为2.0） 接种至含PFOA的培养基中， 于160 r/min振荡 培养， 并做平行实验3 次， 每隔12 h取样测定菌株YAB-1 的生长和降解曲线。 0033 （1） 、 单因素设置如下： 底物浓度为100、 200、 500、 800和1000 mg/L； 接菌量为0.5%、。

20、 1%、 2%、 5%和10%； pH值为5、 6、 7、 8和9； 温度为20、 25、 30、 35和40 。 0034 （2） 、 PFOA的测定方法： 0035 a. 样品浓缩： 发酵液经5000 r/min离心5 min后， 取5 mL至干净离心管， 加入甲基 叔丁基醚1 mL超声萃取10 min， 静止分层， 收集有机相， 样品重复萃取3次， 合并上层有机 相。 0036 b. 样品衍生： 加入1 mL BSTFA充分混匀后， 密封， 置于40 水浴中衍生化反应1 h， 用正己烷定容至10 mL。 0037 c. 样品测定： 选用内标法进行GC-MS （SIM） 定量分析， 根据浓。

21、度与峰面积比的标准 曲线计算PFOA的浓度。 0038 （3） 、 菌体浓度测定： 菌体浓度采用比浊法测定。 本实验的菌体细胞浓度以OD600来 表示， 即波长为600 nm时， 紫外光透过所测菌液样品的光密度值。 0039 6、 结果： 从长期受氟化物污染的环境样品中分离1株细菌， 命名为YAB-1， 经鉴定 YAB-1为类 黄色假单胞菌 （Pseudomonas parafulva） 。 0040 分离菌株的同源性分析和分类结果 StrainsMost similar strainsimilarityGenus YAB-1Pseudomonas parafulva 99%Pseudomon。

22、as 0041 先将YAB-1单菌落接种至LB培养基16小时， 然后将这个培养基制成一定OD的菌悬 液， 最后用这个菌悬液处理含PFOA的物料， 能有效降低物料中PFOA的浓度。 0042 PFOA初始浓度对菌株生长和PFOA降解的影响： 当PFOA浓度小于500 mg/L时， 同时 期的菌液OD600值随底物浓度增大而增大。 当PFOA高于500 mg/L时， 菌液OD600值随着PFOA浓 度增大而变小。 当PFOA浓度为500 mg/L时， 培养基中生物量最大， 降解效果也最高， PFOA的 最大降解率为32.4%。 说明书 3/4 页 5 CN 104974969 B 5 0043 接。

23、菌量对菌株生长和PFOA降解的影响： 当接菌量为1%和2%时， 菌株的生长符合典 型的指数生长曲线模型， 同时菌株的生物量和PFOA的降解能力随接菌量的增大而提高， 但 当接菌量大于2%时， 菌株的生长受到明显抑制， 因此菌株YAB-1降解PFOA的最适接种量为 2%。 0044 pH值对菌株生长和PFOA降解的影响： 微生物都有最适宜生长和繁殖的pH值。 随着 pH的升高， 菌株的生长和降解率先升高后降低， 当培养基pH=7.0时， 96 h时菌液OD600和降解 率达到最高， 分别为0.181和28.9%。 菌株YAB-1有较宽的pH范围适应， 最适pH值为7.0。 0045 温度对菌株生长和PFOA降解的影响： 在培养温度为2 0 -40 时， 菌株YAB-1均 能生长良好。 当温度为20时， 菌株YAB-1生物量和PFOA降解率显著低于30 和40 。 30 时菌株生长量和PFOA降解率均达到最高。 培养温度为30 是菌株生长和降解PFOA的最 适温度。 说明书 4/4 页 6 CN 104974969 B 6 。