一种抗禽传染性支气管炎病毒的肽核酸及应用.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201610566609.4 (22)申请日 2016.07.18 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 106434649 A (43)申请公布日 2017.02.22 (73)专利权人 马国辅 地址 210014 江苏省南京市玄武区童卫路4 号501室 专利权人 韩健宝 (72)发明人 马国辅韩健宝范建华徐步 张则斌张敬峰徐孝宙黎先伟 王远孝曲向阳 (74)专利代理机构 南京瑞弘专利商标事务所 (普通合伙) 32249 代理人 陈建和 (51)Int.Cl. C12。

2、N 15/113(2010.01) A61K 31/7088(2006.01) A61K 47/61(2017.01) A61P 31/14(2006.01) 审查员 张丹丹 (54)发明名称 一种抗禽传染性支气管炎病毒的肽核酸及 应用 (57)摘要 本发明涉及一种抗禽传染性支气管炎病毒 的肽核酸， 针对传染性支气管炎病毒IBV的M和N 蛋白的基因高度保守区域设计特异性强的两组 反义核酸序列， 所述两组反义核酸序列特异地与 IBV的两个关键基因即M和N蛋白对应的靶基因相 结合， 且M和N蛋白分布于IBV基因组的不同区域， 提高反义核酸的稳定性和透膜性。 该序列与上述 靶基因反向互补， 根据碱基。

3、互补原理， 反义核酸 序列特异性地与IBV(M和N蛋白)的对应的靶基因 相结合， 诱导核酶等分子对靶基因进行降解， 阻 断靶基因的转录与表达， 抑制IBV在宿主体内复 制与装配， 以达到防控传染性支气管炎病的目 的。 权利要求书1页 说明书11页 CN 106434649 B 2017.08.25 CN 106434649 B 1.一种抗禽传染性支气管炎病毒的肽核酸， 其特征是针对传染性支气管炎病毒IBV的M 和N蛋白的基因高度保守区域设计特异性强的两组反义核酸序列， 所述两组反义核酸序列 特异地与IBV的两个关键基因即M和N蛋白对应的靶基因相结合， 且M和N蛋白分布于IBV基因 组的不同区域。

4、： 第一组反义核酸序列M M-2： 5 -AUAACACUAUCAUUUUCAGUA-3 M-3： 5 -AUUGUUGACCAUUUGUGAGGA-3 第二组反义核酸序列N N-1： 5 - AUGCAUUUCCAGAAGAACCAA-3 N-3： 5 - AGUAGUAAAUUCAAAUUUCAA-3 。 2.根据权利要求1所述的抗禽传染性支气管炎病毒的肽核酸， 其特征是所述反义核酸 序列， 分别按质量比例1: 0.43: 0.43: 0.43对M-2， M-3， N-1和N-3进行配比， 从而形成 序列组。 权利要求书 1/1 页 2 CN 106434649 B 2 一种抗禽传染性支气。

5、管炎病毒的肽核酸及应用 技术领域 0001 本发明涉及一种用于防控传染性支气管炎病毒(IBV)的动物药物， 尤其是涉及含 有该反义核酸序列的药物组合物， 及其在动物药物上的用途。 背景技术 0002 传染性支气管炎(Infectious Brochitis， IB)是指由传染性支气管炎病毒(IBV) 引起鸡的一种急性、 高度接触性传染病， 主要侵害鸡的呼吸、 泌尿生殖和消化系统， 感染鸡 可由于呼吸道或肾脏病变而引起死亡。 IBV为国际兽疫局(OIE)及我国规定的家禽B类传染 病之一。 IBV的易感动物主要是鸡， 不同品种和品系的鸡对本病的敏感性不同， 但是所有年 龄的鸡都容易感染， 尤其32。

6、6周龄的鸡最为易感染。 一年四季均可发生， 分布广， 传播速度 快， 发病率和死亡率高。 本病最早由Schalk和Hawn于1930年在美国北科他州发现， 最初认为 主要侵害雏鸡， 临床表现主要为咳嗽、 喷嚏、 气管啰音等呼吸道为特征， 但后来调查显示该 病在育成鸡和蛋鸡群也普遍存在， 产蛋鸡表现为产蛋率下降310， 甚至可高达25， 同时不可孵蛋的数量增加了92， 孵化率降低了7。 随后在在世界许多地区分离出很多毒 株， 如欧洲分离到荷兰株， 在澳大利亚分离到Vac8和 VacG。 1972年， 邝荣禄在广州首先提出 IB在我国的存在并先后分离到F毒株(佛山) 和杭州毒株等， 随后在全国各地。

7、不断有IB的发 现， 且出现变异现象， 造成病毒临床表现复杂， 各血清型之间仅有部分或完全没有交叉保护 作用， 从而给本病的防治带来很大的困难， 并给养禽业带来巨大经济损失。 0003 针对IBV的致病性特点及传统疫苗不能有效控制该病等， 研究人员展开对IB的流 行病学调查， 流行毒株的分型对对于实施有效的疫病控制、 病原研究、 及研究病毒的演化有 重要意义。 当前根据病毒对组织的亲嗜性、 损害的主要器官和引起的临床症状等确定的临 床分型有： 呼吸型、 生殖道型、 肾型、 肠型、 腺胃型和变异型等。 血清型分析表明， 全世界IBV 约有30多个血清型， 不同血清型之间交叉保护效果差， 且变异株。

8、的不断出现和流行， 不难看 出这是造成鸡群免疫失败的原因。 0004 幼鸡感染IBV后很快出现流鼻涕， 气管啰音， 咳嗽， 喷嚏， 精神沉郁， 怕冷挤堆， 饮水 增加， 呼吸道症状持续14d后消失。 随后鸡群突然发病， 23d内逐渐加剧， 病鸡挤堆厌食， 排白色稀粪， 体重明显减轻， 鸡冠和皮肤变暗， 肛门周围粘满白色水样粪便， 感染幼鸡出现 死亡。 对于蛋鸡群出现产蛋量下降， 部分耐过鸡可逐渐康复， 饲料报酬低及影响孵化率等。 感染初期剖检可以看到气管和喉头内有大量粘液， 气管粘膜充血， 肺脏充血， 气囊浑浊。 后 期病变主要在肾脏， 病鸡肾脏肿大、 苍白， 肾小管和输尿管扩张， 里面充满大。

9、量白色尿酸盐， 整个肾脏外表有许多花纹， 呈槟榔样。 切开肾脏有多量白色尿酸盐流出。 严重病例在腹膜、 心包膜和胸膜上也有白色尿酸盐沉积， 母鸡卵巢发生退行性变化， 腹腔内有游离的卵黄样 物质， 卵巢充血或出血， 有的呈紫色。 0005 鸡传染性支气管炎病毒(infectious bronchitis virus,IBV)属冠状病毒科冠状 病毒属， 为单股正链RNA病毒， 病毒粒子为多形性， 但大多数略呈球形， 直径约90200nm， 有 囊膜， 囊膜来源于宿主细胞的高尔基体膜或粗面内质网膜。 囊膜表面有长20nm排列整齐的 说明书 1/11 页 3 CN 106434649 B 3 杆状纤突。

10、， 呈放射状排列， 长约20nm， 末端成球形， 纤突之间有较宽的间隙。 核衣壳呈长丝 状、 螺旋对称， 直径913nm。 IBV经5615min及4590min灭活， 对乙醚和氯仿极敏感， 用 0.1去氧胆酸钠4作用18h可使IBV完全失去感染能力。 高锰酸钾、 70酒精和1福尔马 林等消毒剂均可在室温下几分钟内杀死病毒。 0006 IBV基因组为单股正链RNA， 全长约27kb。 基因组的5 端有帽子和3 端有poly A 尾 巴结构， 被分成6个区域， 至少有10个ORF， IBV的基因定位顺序为5 Cap-1a-1b-S-3a-3b-E- M-5a-5b-N-3 Poly A。 IBV。

11、复制时以负链RNA为模板可转录出6 种亚基因组mRNAs， 按由小到 大的顺序被命名为mRNA1mRNA6。 所有mRNA都具有共同的3 末端嵌套式结构， 一个64核苷 酸的前导序列。 其中mRNA2、 mRNA4、 mRNA6为功能性单顺反子mRNA， 分别编码IBV的3种结构蛋 白， 即纤突蛋白(spike， S)、 膜蛋白 (membrane， M蛋白)、 核衣壳蛋白(nucleocapsid， N蛋 白)， 而mRNA1， mRNA3， mRNA5 均含有一个以上的ORF， 是功能性多顺反子。 6个独立的基因编 码病毒的结构蛋白和非结构蛋白 ， 在各基因之间存在着一小段9个nt的共同序。

12、列 (CUUAACAAA)， 其作用可能参与调控下游基因的转录， 在5 端的帽子结构后面紧接先导序 列， 长约6070nt， 该序列作为引物在IBV独特的先导引物转录合成机制模式中起重要作 用。 由于IBV基因组RNA 复制的不连续性以及RNA聚合酶的不完全校对机制， 基因组十分容 易发生点突变、 缺失、 插入和不同毒株基因组间的同源重组等， 使得病毒的血清型、 基因型、 结构蛋白、 免疫原性等容易发生变化。 0007 M蛋白是由221个氨基酸组成， 由mRNA4所编码， 具有三次跨膜结构， 能与S蛋白结 合， 被认为是冠状病毒组装过程中的一个关键信号。 M蛋白是IBV粒子中含量最多的糖蛋白，。

13、 约占病毒总蛋白的40， M蛋白主要组成部分跨膜3次， 横跨囊膜， 大部分在囊膜的内侧面， 仅有一小部分糖基化的N端露在膜外， M蛋白的N端有2个糖基化位点。 M蛋白聚集于粗面内 质网和高尔基体膜中， 与E蛋白、 -Actin相互作用， M蛋白具有控制并介导病毒粒子从粗面 内质网膜或高尔基体膜出芽， 在病毒装配时与核衣壳相互作用， 并将核衣壳结合到囊膜上 的作用。 M蛋白的靶向信号位于它的第一个跨膜区而不同于E蛋白的胞质尾区， 共表达M和E 蛋白能够形成病毒粒子。 M蛋白中A159和K160 位点人工突变导致IBV的感染性丧失。 另有报 道认为， M蛋白上存在着重要免疫原性的抗原决定簇， 但其。

14、免疫生物学功能， 尤其是该蛋白 在病毒致病过程中的作用及其与病毒的组织嗜性的关系还需要进一步研究确认。 0008 N蛋白， N蛋白是冠状病毒的主要结构蛋白之一， 为病毒的核衣壳的组成蛋白， 是一 种磷酸化蛋白， 由mRNA6编码， 分子量为46kD， 经磷酸化分子量为50kD， 由409个氨基酸组成 的， 是唯一完全位于膜内的蛋白， 不能被糖基化， 氨基酸推导序列分析发现， 其中17为碱 性氨基酸， 且80的碱性氨基酸在位置上是保守的， 通常簇集在66aa88aa、 181aa 234aa、 334aa373aa 3个区域。 N蛋白3个碱性氨基酸区域的基本特征可能有利于其与病毒 核酸的结合， 。

15、以便包裹核酸， 且含有核定位和核输出信号调节胞质与胞核动态运输过程， 使 病毒基因组RNA易于装配入病毒粒子内部。 在感染细胞中， N蛋白是表达量最高的病毒蛋白 之一， 也具有很好的免疫原性， 能够诱导机体产生高水平的抗体并介导细胞毒性T细胞效 应。 Fan等获得了一个稳定的N蛋白N-末端(IBV-N29-160) 氨基酸残基片段(这一区域类似 于SARS-CoV的一个RNA结合区域)， 并得到其晶体结构， 对其晶体结构分析表明， 该蛋白核心 由5条反向平行的 片层伴有一带正电的 发夹结构和一个疏水性的平面构成， 并推断这一 核心结构很有可能参与结合病毒RNA。 Reed M L等研究了IBV。

16、感染的VeroV和DF21细胞， 发 说明书 2/11 页 4 CN 106434649 B 4 现在N蛋白C端的一个富含亮氨酸的八肽 (291-LQLDGLHL-298)起着核输出信号的作用， 通 过氨基酸替代和缺乏证实Leu296和 Leu298是N蛋白从核中有效输出所必需的。 N蛋白是重 要的免疫原， 在刺激机体的细胞免疫和体液免疫中起重要作用。 研究发现在N蛋白上具有3 个IBV特异性B细胞识别表位， 分别位于175aa241aa、 310aa370aa和360aa409aa区域。 ELISA检测表明， N蛋白所诱导的抗体出现最早， 效价也最高， 提示N蛋白具有更高的免疫原 性。 00。

17、09 反义核酸(antisense nucleic acid)是一段与靶基因(mRNA或DNA)的某段序列互 补的天然存在或人工合成的核苷酸序列， 反义核酸通过碱基配对方式特异性的与病毒靶基 因结合形成杂交分子， 从而在复制、 转录和翻译水平调节靶基因的表达， 或诱导RNase H识 别并切割mRNA， 进而使其功能丧失。 0010 反义核酸包括反义RNA(antisense RNA)和反义DNA(antisense DNA)， 具有合成方 便、 序列设计简单、 容易修饰、 选择性高、 亲和力强等特点。 反义核酸作为一种新的抗病毒、 抗肿瘤药物， 掀起了一场药理学领域的革命， 即新的药物受体m。

18、RNA通过新受体结合方式 (Watson-Crick杂交)、 引发新的药物受体结合后反应： (1)RNase H介导的靶RNA 的降解； (2)抑制DNA的复制和转录及转录后的加工和翻译等。 可以说反义寡核苷酸(ODNs) 疗法比 传统的药物治疗手段有更高的特异性。 从二十世纪70年代末到现在， 在这三十年的时间中， 反义核酸药物已走出实验室， 进入了实际临床应用。 特别是第一个反义核酸药物 Fomivirsen通过FDA批准上市后， 人们对反义疗法尤为关注。 0011 反义核酸作用原理基于碱基配对原则， 可通过与靶RNA进行碱基配对结合的方式 参与对相关基因表达的调控。 其作用方式可能有： 。

19、反义RNA与病毒mRNA结合形成互补双链 阻断核糖体与病毒mRNA的结合， 从而抑制了病毒mRNA翻译成蛋白质的过程。 反义 DNA能 与靶基因形成一种三链核酸(triple helix nucleic acid)， 它通过作用于控制基因转录 的转录子、 增强子和启动子区， 对基因的转录进行调控。 反义核酸与病毒mRNA 的结合可 阻挡mRNA向细胞质的运输。 反义核酸与病毒mRNA结合后使得mRNA更加易被核酸酶识别降 解， 从而大大缩短mRNA的半衰期。 上述四种作用途径都可表现为对病毒基因表达的抑制或 调控， 且这种调控是高度特异性的。 0012 反义核酸是通过碱基互补配对的原理来识别所。

20、打靶的基因， 从理论来分析， 研究 人员以动物细胞为例， 其染色体大约有几十亿对碱基， 如果4个碱基(A、 G、 C和T)的数目大致 相同， 并在整个基因中随机分布， 那么按照统计学原理， 大于17个碱基的反义核酸与非靶基 因杂交的可能性不大， 所以长度超过17个碱基的反义核酸分子与靶基因的结合可以说是唯 一的， 从而使反义核酸具有高度的特异性。 0013 研究表明， 在细胞内部一个拷贝的基因会产生200-300条mRNA， 翻译出10万个具有 生物活性的蛋白质分子。 传统药物主要作用于有生物功能的蛋白分子的某结构域上的几个 作用位点， 事实上蛋白的结构是非常复杂的， 且在生物体内， 活性蛋白。

21、的空间结构又是千变 万化的， 以传统药物有限的几种作用位点来控制靶分子的动态的和整体的功能很难达到理 想的效果， 因而不难看出传统药物的局限性。 由mRNA可翻译出几十到几百个蛋白， 反义核酸 在mRNA水平对靶基因直接进行调控， 这个步骤相当于将传统药物作用放大了数十到数百 倍， 可见反义核酸的调控是极其经济合理的。 0014 毒理学研究表明， 反义核酸在体内具有很低的毒性， 尽管其在生物体内的存留时 说明书 3/11 页 5 CN 106434649 B 5 间有长有短， 但最终都将被降解消除， 这避免了如转基因疗法中外源基因整合到宿主染色 体上的危险性。 与传统药物相比， 反义核酸药物具。

22、有特异性强， 效率高和毒副作用低等优 点， 在抑制肿瘤生长和抗病毒复制等方面显现出了良好的应用价值。 目前已有多个药物进 入美国和欧洲市场， 另还有30多种反义核酸药物正在进行临床前期的研究或开发后进入了 、 和期实验。 0015 由于动物体内存在大量的核酸外切酶， 反义核酸若不经过化学修饰， 很快就被降 解， 失去活性。 目前对反义核酸的化学修饰有很多方法， 常见的有硫代修饰反义核酸及2 - 甲氧基修饰反义核酸等。 且目前硫代修饰药物的研究最为全面， 它可有效抵抗核酸酶的降 解， 同时可促进核酸酶Rase H的活性， 目前这种修饰方法已成功用于临床的反义核酸药物。 但这些还只是第一代反义核酸。

23、的修饰方法， 随着技术的发展与进步， 新的修饰途径与方法 被开发出来， 使得反义核酸的研究进入了第二、 三代， 其中肽核酸的修饰最为引人关注。 0016 肽核酸(peptidenucleic acids， PNAs)， 是一种以中性酰胺键为骨架的全新的DNA 类似物， 可序列特异的靶向作用于DNA的大沟槽， 其骨架的结构单元为N(2-氨基乙基)- 甘 氨酸， 碱基部分通过亚甲基羰基连接于主骨架的氨基N上。 为反义核酸的第二代产品。 0017 壳聚糖是天然多糖中唯一的碱性多糖,具有来源丰富、 无毒、 易化学修饰性、 生物 相容性和可再生性等优越的功能性质和独特分子结构。 壳聚糖作为可生物降解材料。

24、用于新 型给药系统,通过改变给药途径可大大提高药物疗效,具有控制释放、 增加靶向性、 减少刺 激和降低毒副作用以及提高疏水性药物通过细胞膜、 增加药物稳定性等作用特点。 0018 IBV因传染性支气管炎是由IBV引起的一种高度接触性传染病， 这是家禽最重要疾 病的之一， 给家禽业造成了重大的经济损失。 目前该病在全世界范围内广泛流行， 危害严重 是， 给全球的养禽业造成巨大的经济损失。 由于IBV临床分型众多， 且该病毒属单正股RNA病 毒， 基因突变、 重组和免疫压力等因素都可能引起鸡传染性支气管炎病毒发生遗传变异,给 该病的预防和控制带来了很大的困难。 开发预防和治疗IBV感染的新技术显得。

25、尤为迫切。 感 染引发的相关疾病。 本发明针对IBV(M和N蛋白)两种主要蛋白基因的保守区域设计的病毒 特异性的反义寡核苷酸序列， 采用特定工艺合成、 肽修饰及壳聚糖包装反义寡核苷酸， 使其 具备高水平的生物利用度、 稳定理化性能及高效安全的疗效。 发明内容 0019 本发明目的是， 本发明针对IBV(M和N蛋白)两种主要蛋白基因的保守区域设计的 病毒特异性的反义寡核苷酸序列， 采用特定工艺合成、 肽修饰及壳聚糖包装反义寡核苷酸， 使其具备高水平的生物利用度、 稳定理化性能及高效安全的疗效。 本发明率先将肽核酸技 术与反义核酸技术结合起来。 并应用于预防和治疗IBV因传染性支气管炎是由IBV 。

26、引起的 高度接触性传染病， 提供一种预防和治疗IBV感染的新技术。 0020 本发明采用了以下技术方案： 一种抗禽传染性支气管炎病毒的肽核酸， 是用于防 控传染性支气管炎病毒(IBV)的特异性抗病毒肽核酸(反义寡核苷酸)动物药物， 其特征是 针对传染性支气管炎病毒IBV的M和N蛋白的基因高度保守区域设计特异性强的反义核酸序 列， 并采用特定工艺人工制成肽核酸片段(肽核酸是寡核苷酸模拟物， 通过先合成肽骨架， 然后引入碱基。 不是采用修饰途径)， 提高反义核酸的稳定性和透膜性。 0021 所述两组反义核酸序列， 其特征为它们可特异地与IBV的两个关键基因、 M和N蛋白 说明书 4/11 页 6 。

27、CN 106434649 B 6 对应的靶基因相结合， 且M和N蛋白分布于IBV基因组的不同区域， 以下为本发明所涉及的一 系列序列或其组合： 0022 第一组反义核酸序列M： 0023 M-1： 5 -UUAUAAAUAGAUUAUAUUCCU-3 0024 M-2： 5 -AUAACACUAUCAUUUUCAGUA-3 0025 M-3： 5 -AUUGUUGACCAUUUGUGAGGA-3 0026 第二组反义核酸序列N： 0027 N-1： 5 -AUGCAUUUCCAGAAGAACCAA-3 0028 N-2： 5 -ACUUGAUCAACCUUAUAACCA-3 0029 N-3：。

28、 5 -AGUAGUAAAUUCAAAUUUCAA-3 ； 0030 所述的反义核酸序列， 筛选出M-2， M-3， N-1和N-3为优选使用的序列。 0031 所筛选出的优选的反义核酸序列， 分别按质量比例1:(0.43):(0.43):(0.4 3) 对M-2， M-3， N-1和N-3进行配比， 从而形成优选序列组。 0032 所述的反义核酸制备成肽核酸； 将肽核酸溶液与咪唑丙烯酸壳聚糖(UAC)溶液等 体积置于55水浴恒温30min,将两者在混合器上混合,偶联制备出UAC-PNA纳米分子微囊， 并将其用于制备抗IBV药物。 0033 所采用的可药用载体或赋形剂的药物组合。 0034 I。

29、BV基因组为单股正链RNA， 全长约27kb。 基因组的5 端有帽子和3 端有poly A 尾 巴结构， 被分成6个区域， 至少有10个ORF， IBV的基因定位顺序为5 Cap-1a-1b-S-3a-3b-E- M-5a-5b-N-3 Poly A。 IBV复制时以负链RNA为模板可转录出6 种亚基因组mRNAs， 按由小到 大的顺序被命名为mRNA1mRNA6。 所有mRNA都具有共同的3 末端嵌套式结构， 一个64核苷 酸的前导序列。 其中mRNA2、 mRNA4、 mRNA6为功能性单顺反子mRNA， 分别编码IBV的3种结构蛋 白， 即纤突蛋白(spike， S)、 膜蛋白 (mem。

30、brane， M)、 核衣壳蛋白(nucleocapsid， N)， 而 mRNA1， mRNA3， mRNA5均含有一个以上的ORF， 是功能性多顺反子。 6个独立的基因编码病毒的 结构蛋白和非结构蛋白， 在各基因之间存在着一小段9个nt的共同序列(CUUAACAAA)， 其作 用可能参与调控下游基因的转录， 在5 端的帽子结构后面紧接先导序列， 长约6070nt， 该 序列作为引物在IBV独特的先导引物转录合成机制模式中起重要作用。 由于IBV基因组RNA 复制的不连续性以及RNA聚合酶的不完全校对机制， 基因组十分容易发生点突变、 缺失、 插 入和不同毒株基因组间的同源重组等， 使得病毒。

31、的血清型、 基因型、 结构蛋白、 免疫原性等 容易发生变化。 0035 本发明有益效果： 本发明采用人工方法制成肽核酸片段， 提高反义核酸的稳定性 和透膜性。 该序列与上述靶基因反向互补， 根据碱基互补原理， 反义核酸序列特异性地与 IBV(M和N蛋白)的对应的靶基因相结合， 诱导核酶等分子对靶基因进行降解， 阻断靶基因的 转录与表达， 抑制IBV在宿主体内复制与装配， 以达到防控传染性支气管炎病的目的。 本发 明还涉及含有该反义核酸序列的药物组合物， 及其在动物药物上的用途。 本发明无毒副作 用， 无耐药性， 能特异性直接抑制IBV复制， 抗病毒效果好， 无药残等食品安全问题。 针对IBV 。

32、的肽核酸体外抗病毒结果， 反义核酸对体外Vero细胞抗IBV效果经定量PCR检测结果显示： M 特异肽核酸， M-1， M-2， M-3的抑制率分别为:75， 83和89， 可见M-3效果较好。 N特异反 义肽核酸， 除N-2效果不明显外， N-1X和N-3的抑制率分别为92和86。 但实际使用时混合 说明书 5/11 页 7 CN 106434649 B 7 序列的肽核酸更好。 具体实施方式： 0036 发明所设计的反义核酸序列： 0037 0038 本发明的技术方案 0039 主要材料与试剂 0040 病毒毒株 0041 IBV毒株： NS-IBV-57株， 由楠森兽医诊断技术研究中心实验。

33、室提供。 0042 细胞株 0043 Vero细胞： 中国科学院上海细胞所。 0044 反义核酸的合成 0045 采用合成工艺进行反义核酸的人工合成。 0046 反义核酸的修饰 0047 为了获得良好的实际应用效果， 采用肽骨架构建并修饰反义核酸以形成稳定理化 性能和特定空间结构的肽核酸(PNA) 0048 肽核酸的修饰 0049 以壳聚糖为修饰物对肽核酸进行修饰。 0050 肽核酸的剂型 0051 1、 采用控释制药工艺将经修饰过的肽核酸制备成结肠溶控释微囊制剂； 0052 2、 采用冷冻干燥制药工艺将经修饰过的肽核酸制备成注射用冻干粉针； 0053 3、 采用冻干后再制粒工艺将经修饰过的肽。

34、核酸制备成口服用水溶性颗粒。 0054 药剂稳定性分析 0055 高温： 流通蒸汽高温105， 20分钟灭菌不影响其生物活性。 0056 极端温度： 50存放6个月不影响其生物活性。 0057 室温： 存放24个月不影响其生物活性。 0058 低温： -20存放48个月不影响其生物活性。 0059 实施方案针对抗IBV的肽核酸体外抗病毒效果分析 说明书 6/11 页 8 CN 106434649 B 8 0060 从GenBank数据库检索出IBV的基因组， 特别是近年来我国所报道的IBV毒株的序 列， 用生物学软件进行序列分析， 综合考虑序列的保守性， G+C含量， 碱基分布特点， 然后 从。

35、中挑选出合适的区域设计反义核酸， 最后所确定的针对病毒的M和N基因的反义核酸序列 如下。 0061 M 0062 M-1： 5 -UUAUAAAUAGAUUAUAUUCCU-3 0063 M-2： 5 -AUAACACUAUCAUUUUCAGUA-3 0064 M-3： 5 -AUUGUUGACCAUUUGUGAGGA-3 0065 N 0066 N-1： 5 -AUGCAUUUCCAGAAGAACCAA-3 0067 N-2： 5 -ACUUGAUCAACCUUAUAACCA-3 0068 N-3： 5 -AGUAGUAAAUUCAAAUUUCAA-3 0069 采用IBV病毒特异性定量RT。

36、-PCR检测肽核酸对病毒靶基因的抑制程度， 同时运用 病毒毒价测定实验检测抗病毒的滴度。 0070 Day 1: 0071 铺板： 消化前期准备的Vero细胞， 离心收集， 细胞计数， 用完全培养基(DMEM+5胎 牛血清+青链霉素)将细胞浓度调到36105个/ml， 铺24孔板， 于37二氧化碳培养箱中 进行培养18-24小时。 0072 Day 2: 0073 显微镜观察细胞的密度， 待细胞长满孔板面积的5070时， 且细胞状态良好。 吸 去培养液， 每孔加入300 l待筛选药物， 每个药物10个孔。 温育1小时后， 加入100 l IBV (1000PFU/mL)， 吸附2小时后， 用营。

37、养液洗去未吸附的病毒后， 再加入含4FBS的 DMEM培养 基， 在37和5CO2环境中继续培养， 感染后定时观察细胞病变。 感染后72h， 将感染细胞进 行反复冻融以释放病毒， 以此为样本进行病毒检测。 实验过程中还设不加病毒和肽核酸的 正常细胞对照组， 加病毒、 不加肽核酸阳性对照组和加肽核酸药物、 不加病毒的阴性对照 组。 0074 Day 1-3: 0075 观察药物对细胞的保护效应， 并对结果进行评判。 0076 Real-time PCR定量检测 0077 收集上述各处理组中的上清液， 用病毒总RNA提取试剂盒提取病毒RNA。 对获得的 病毒RNA首先进行反转录成cDNA， 然后运。

38、用针对的引物分别检测IBV处理组中的病毒含量。 定量扩增后的结果， 运用统计学软件计算出各处理组中病毒滴度， 抑制效果以PNA组与空白 对照组差异的倍数。 0078 本发明参考Meir R等(2010)提供的引物， 采用real-time PCR定量检测IBV。 0079 IBV特异性检测引物 0080 引物1:5 -ATGCTCAACCTTGTCCCTAGCA-3 0081 引物2:5 -TCAA-ACTGCGGATCATCACGT-3 0082 GAPDH为内参(Kuchipudi S V等) 0083 引物1:5 -GAAGCTTACTGGAATGGCTTTCC-3 说明书 7/11 页。

39、 9 CN 106434649 B 9 0084 引物2:5 -CGGCAGGTCAGGTCAACAA-3 0085 反应体系(25 l) 0086 0087 0088 反应条件： 反转录， 425min， 9510sec； 0089 PCR扩增： Cycle： 40， 955sec， 5530sec， 7230sec。 0090 反应结束后确认Real Time One Step RT-PCR的扩增曲线和融解曲线， 以确保结 果的特异性与可靠性。 0091 针对IBV的肽核酸体外抗病毒结果： 0092 定量PCR检测结果显示， M特异肽核酸， M-1， M-2， M-3的抑制率分别为:75，。

40、 83和 89(附表1)， 可见M-3效果较好。 N特异反义肽核酸， 除N-2效果不明显外， N-1X和N-3 的抑 制率分别为:92和86(附表1) 0093 附表1.反义核酸对体外Vero细胞抗IBV效果 说明书 8/11 页 10 CN 106434649 B 10 0094 0095 药物组合处理 0096 方法同上， 针对前一步所筛选出的M-2/3， N-1/3为优选序列。 然后， 在前面的这些 实验基础上， 对筛选出的有效抗病毒作用的药物进行组合使用， 比较组合后的抗病毒效果 与单药抗病毒效果之间的差异。 Vero细胞感染IBV NS-IBV-57株后， 分别加入针对M 或N的 基。

41、因药物组合， 同时设阳性对照和阴性对照及空白对照， 用Real-time PCR方法进行检测， 统计分析各用药组之间病毒抑制率， 确定药物的组合， 如附表2。 0097 附表2.不同浓度的反义肽核酸对体外Vero细胞抗IBV效果 0098 0099 细胞毒性实验： 0100 1)以Vero细胞作检测对象， 96孔板， 每孔加100微升5000个细胞。 药物浓度(0.02， 0.1， 0.5， 1， 5， 10 m)， 每个梯度设置3个重复孔， 另设未处理细胞对照、 无细胞培养基对照。 0101 2)处理结束后， 每孔每100 l培养基加入10 l MTT Stock， 37培养箱内继续孵育 4。

42、小时。 也可更换100 l新鲜无血清培养基后再加MTT Stock。 0102 3)吸去培养基， 每孔加入100 l MTT溶解剂， 保持各孔内液体体积一致。 说明书 9/11 页 11 CN 106434649 B 11 0103 4)在570nm测定OD吸光度并进行比较计算。 注意： 为准确考虑可在699nm处测定未 还原的MTT本身的吸光度OD值， 然后用OD570减去OD699。 0104 5)结果判断： 细胞增殖或毒性100 x(OD实 验OD本 底)/(OD对 照OD本 底)。 0105 OD实验是接受处理细胞的OD值， OD对照是未处理细胞对照管OD值， OD本底是无细 胞培养基。

43、对照OD值。 处理后细胞增殖或毒性变化表示为未处理对照的百分数。 0106 检测结果表明， 针对IBV肽核酸无毒性。 0107 鸡胚上IBV的肽核酸抗病毒效果： 0108 取10日龄的SPF鸡胚180枚， 随机分成6组， 每组30枚， IBV(5000PFU/mL) 每枚200 l， 肽核酸用量为3 g/胚， 每个样本设3个平行， 置37温箱继续孵化， 期间观察胚体未有肉 眼可见病变， 收集接种24h后鸡胚尿囊液， 定量RT-PCR检测IBV病毒增殖抑制率， 见附表3： 0109 附表3.不同浓度的反义肽核酸在鸡胚上的抗IBV效果 0110 0111 实验动物感染及饲养： 0112 健康17日。

44、龄SPF雏鸡共300只(楠森兽医诊断中心实验动物养殖场司提供， 经检测 IBV 阴性)随机分为6组。 其中IBV感染组(试验组)50只， 采用滴鼻攻毒方式， 100 l/只； 空白 对照组(对照组)共50只， 不作任何处理。 三个药物剂量组(25ppm， 50ppm， 100ppm)， 采用饮水 给药方式， 严格按组隔离饲养， 各组的饲料与饮水均单独准备， 不交叉。 0113 IBV感染后， 逐日详细观察至攻毒后15day， 统计发病数和死亡数， 计算免疫保护 率。 同时采集样品， 提取总RNA， 进行RT-PCR检测， 分析各组中IBV的检出率， 如附表4 。 0114 表4 .抗IBV的肽核酸药物临床实验 说明书 10/11 页 12 CN 106434649 B 12 0115 0116 0117 最终优选的给药剂量为50100ppm。 说明书 11/11 页 13 CN 106434649 B 13 。