一种基于细胞聚集体的微脉管肝脏芯片及其制备和使用方法.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201510720578.9 (22)申请日 2015.10.30 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 105176816 A (43)申请公布日 2015.12.23 (73)专利权人 东南大学 地址 211189 江苏省南京市江宁区东南大 学路2号 (72)发明人 顾忠泽郑付印赵远锦付繁繁 赵泽魏红梅 (74)专利代理机构 南京瑞弘专利商标事务所 (普通合伙) 32249 代理人 陈国强 (51)Int.Cl. C12M 3/00(2006.01) C12M 3/。

2、04(2006.01) C12Q 1/02(2006.01) 审查员 马妍妍 (54)发明名称 一种基于细胞聚集体的微脉管肝脏芯片及 其制备和使用方法 (57)摘要 本发明公开了一种基于细胞聚集体的微脉 管肝脏芯片， 包括位于上层的微脉管系统， 中间 的类血管内皮屏障系统和下层的肝脏器官多细 胞共培养系统， 微脉管系统和肝脏器官多细胞共 培养系统分别设置于各自的片基上； 其中， 所述 微脉管系统包括由若干阻流栅栏交错布置构成 的弯曲脉管， 所述弯曲脉管两端分别设有微脉管 进口和微脉管出口； 所述类血管内皮屏障系统由 多孔膜组成； 所述肝脏器官多细胞共培养系统包 括细胞聚集体富集区和多种细胞共培。

3、养区， 并在 两端分别设置有培养系统进口和培养系统出口。 本发明可以进行肝脏疾病模型的制备以及药物 代谢动力学和药物活性的研究， 具有样品用量 小， 药物低消耗， 便携、 经济、 高效、 准确的特点。 权利要求书2页 说明书6页 附图3页 CN 105176816 B 2017.09.26 CN 105176816 B 1.一种基于细胞聚集体的微脉管肝脏芯片， 其特征在于： 包括位于上层的微脉管系统 （1） ， 中间的类血管内皮屏障系统 （2） 和下层的肝脏器官多细胞共培养系统 （3） ， 微脉管系统 （1） 和肝脏器官多细胞共培养系统 （3） 分别设置于各自的片基上； 其中， 所述微脉管系统。

4、 （1） 包括由若干阻流栅栏 （4） 交错布置构成的弯曲脉管 （5） ， 所述弯曲脉管 （5） 两端分别设有微 脉管进口 （6） 和微脉管出口 （7） ； 所述类血管内皮屏障系统 （2） 由多孔膜 （8） 组成； 所述肝脏 器官多细胞共培养系统 （3） 包括细胞聚集体富集区 （9） 和多种细胞共培养区 （10） ， 并在两端 分别设置有培养系统进口 （12） 和培养系统出口 （11） ， 肝脏器官多细胞共培养系统 （3） 位于 培养系统进口 （12） 的内部区域设置有两个分流栅栏 （13） ， 其中， 细胞聚集体富集区 （9） 由多 个月牙槽状结构 （15） 组成， 每个月牙槽状结构 （15）。

5、 上均设置有若干缝隙 （14） ， 多个月牙槽 状结构 （15） 纵向排列成若干列， 且该若干列交错布置， 所有月牙槽状结构 （15） 的开口均朝 着培养系统进口 （12） ； 所述肝脏器官多细胞共培养系统 （3） 的培养系统出口 （11） ， 培养系统进口 （12） 通道深 度， 分流栅栏 （13） 和月牙槽状结构 （15） 的高度均为100 m； 分流栅栏 （13） 为圆滑弧形， 与培 养系统进口 （12） 的通道对齐， 并等距对称布置； 月牙槽状结构 （15） 的个数为80个， 其外圆环 半径为350 m， 内圆环半径为150 m， 月牙槽状结构 （15） 上的缝隙 （14） 为四个， 。

6、并均匀发散排 列， 其宽度为20 m， 深度100 m， 内圆环开口直线距离为100 m， 月牙槽状结构 （15） 相互之间 的间隔距离为100 m。 2.根据权利要求1所述的基于细胞聚集体的微脉管肝脏芯片， 其特征在于： 所述片基为 聚二甲基硅氧烷、 聚甲基丙烯酸甲酯、 玻璃、 聚碳酸酯、 聚四氟乙烯、 硝酸纤维素、 生物膜、 硅 片的一种或几种。 3.根据权利要求1所述的基于细胞聚集体的微脉管肝脏芯片， 其特征在于： 所述肝脏器 官多细胞共培养系统 （3） 所用的细胞粘附和培养基质为纤维蛋白胶、 细胞外基质蛋白、 BSA 蛋白、 丝素蛋白、 明胶、 壳聚糖、 精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸、 基。

7、质胶、 海藻酸钠、 异甲基丙烯酰 胺、 聚乙二醇或聚乙二醇丙烯酸酯的一种或几种。 4.根据权利要求1所述的基于细胞聚集体的微脉管肝脏芯片， 其特征在于： 所述微脉管 系统 （1） 的微脉管入口 （6） 和微脉管出口 （7） 通道深度， 阻流栅栏 （4） 高度和弯曲脉管 （5） 深 度均为100 m； 阻流栅栏 （4） 的宽度为20 m， 形状为半圆形倒角， 且与肝脏器官多细胞共培养 系统 （3） 中月牙槽状结构 （15） 的位置相对应； 弯曲脉管 （5） 是圆滑的通道， 通道宽度为600 m， 弯曲数为20。 5.根据权利要求1所述的基于细胞聚集体的微脉管肝脏芯片， 其特征在于： 所述多孔膜 。

8、(8)的材料为聚二甲基硅氧烷、 Transwell 用的PET或 PC膜的一种， 厚度为10 m， 孔径为 0.4， 1, 3, 5, 8 m。 6.一种权利要求1-5任一所述的基于细胞聚集体的微脉管肝脏芯片的制备方法， 其特 征在于： 包括以下步骤： （1） 用计算机辅助设计软件设计和绘制器官芯片的掩膜板， 精确绘制各层芯片的微结 构和微通道图形； （2） 通过光刻蚀的方法， 制备出上下两层的掩膜， 制备出含有微结构和微通道的芯片； （3） 将上层的微脉管系统芯片， 中间的多孔膜和下层的肝脏器官多细胞共培养系统进 行对齐， 加压， 并进行等离子体键合， 形成三维立体的微结构和微通道网络。 权。

9、利要求书 1/2 页 2 CN 105176816 B 2 7.一种权利要求1-5任一所述的基于细胞聚集体的微脉管肝脏芯片的使用方法， 其特 征在于： 首先， 通过微脉管进口和培养系统进口通道依次种植不同细胞种类， 并进行贴壁和三 维聚集体培养， 并进行肝脏实质细胞形貌和功能性评价； 种植细胞时， 在微脉管系统和类血管内皮屏障系统形成的密闭区域中种植血管内皮细 胞， 细胞密度为1x106个/mL， 贴壁培养2-4小时， 形成血管内皮细胞层； 在肝脏器官多细胞共 培养系统依次种植多种细胞， 肝脏细胞聚集体首先通过培养系统进口通道进入细胞聚集体 富集区的月牙槽状结构， 富集形成紧密的细胞连接， 并。

10、进行三维聚集体生长； 多种细胞共培 养区通过培养系统进口通道种植共培养细胞种类， 共培养细胞种类包括肝星形细胞， 库普 弗细胞， 角质细胞， 以及成纤维细胞， 细胞密度为1x106个/mL， 贴壁培养2-4小时； 然后， 通入药物进行药物肝脏毒性和药物活性评价， 包括药物的长期和短期肝脏毒性， 以及药物的IC50值； 最后， 在进行药物评价时， 药物通过微脉管系统 （1） 进入芯片， 然后穿透类血管内皮屏 障系统 （2） ， 进入到下层的肝脏器官多细胞共培养系统 （3） ， 从而评价其肝脏的毒性作用以 及进行药物的代谢和转化； 或者， 药物也通过培养系统进口 （12） 直接进入肝脏器官多细胞 。

11、共培养系统 （3） ， 与肝实质细胞聚集体和共培养细胞直接进行接触并实现代谢和转化， 并验 证药物的肝脏毒性和药物活力。 权利要求书 2/2 页 3 CN 105176816 B 3 一种基于细胞聚集体的微脉管肝脏芯片及其制备和使用方法 技术领域 0001 本发明涉及一种基于细胞聚集体的微脉管肝脏芯片及其制备和使用方法， 属于微 流体芯片加工设计和生物医药技术领域。 背景技术 0002 研发安全有效的药物是一个长期、 艰难和昂贵的进程。 细胞培养和动物实验是现 代医学和药学研究中广泛使用并极为依赖的两种实验平台。 药物进入临床前都要通过离体 实验和动物过渡实验来检测药物对体外培养细胞和动物机体。

12、的效应， 并反复进行药效学、 药代动力学、 毒理学的定性和定量预测。 然而药物研发失败的一个重要原因便是当前用于 药物评估的模型与人的疾病模型存在无法回避的差异。 通常情况下， 细胞培养模式很难模 拟人体微环境， 同时， 使用动物模型对正常和疾病的生理过程进行分析， 它不但昂贵、 耗时， 而且存在伦理上的争论。 通过这两类实验平台验证的实验性药物在进入临床试验后被淘 汰， 或药效低或毒副作用强， 导致药物研发中人力和物力的巨大浪费。 0003 器官芯片可以突破细胞培养和模式动物实验的局限。 它是一个基于多通道流体芯 片的三维细胞培养系统， 由多个模拟人体组织和器官环境的细胞培养分区集合而成。 。

13、在各 分区通过仿生循环系统进行连接。 微通道的尺寸可以与细胞尺寸相当， 可以精确地控制微 环境的成分、 温度等因素， 尽可能模拟细胞外基质的情况， 增强实验的可靠性和可操作性。 同时可以设计不同的二维或三维结构和精密加工成微电极等器件实现细胞的培养、 定位、 有序、 图案化以及检测等多种功能。 在芯片上模拟生物体的环境进行细胞、 组织和器官的培 养， 研究并控制细胞在体外培养过程中的生物学行为， 并在药物开发、 疾病诊断和治疗方面 具有广泛的应用前景。 人体器官芯片的研究在国际上尚处于起步阶段， 但是欧美日等国家 已开发出不同种类的脑芯片、 肺芯片、 心脏芯片、 肾芯片、 肝脏芯片、 脾芯片、。

14、 肠芯片等多种 器官的芯片， 以期用于器官功能模拟和替代动物模型进行药物筛选等研究。 0004 肝脏是人体最重要的解毒器官， 也是药物实现转化和代谢的主要器官， 构建模拟 肝脏器官功能和结构的肝脏芯片将给药物筛选提供良好的平台。 然而， 目前的肝脏芯片类 型非常的少， 仅有个别的可以模拟类血管内皮屏障和部分微环境， 还是很难实现肝脏微环 境的系统模拟并广泛用于药物筛选的研究中。 肝脏本身就是一个极佳的肝细胞反应器， 肝 脏的基本结构和功能单位为肝小叶， 其内肝细胞不仅达到数量和密度的要求， 还呈现极性 有序排列； 肝脏细胞处于一种三维环境中， 肝细胞与其周围的肝血窦内皮细胞， 肝星状细 胞， 。

15、库普弗细胞， 及细胞外基质等相互作用， 细胞间相互作用也有助于调节细胞的生长和功 能分化。 肝脏内血管和胆管系统为肝脏细胞提供氧气和营养物质， 药物也在肝脏内实现代 谢和转化， 同时带走肝细胞的代谢废物。 发明内容 0005 针对上述现有技术的不足， 本发明的目的是提供一种基于细胞聚集体的微脉管肝 脏芯片及其制备和使用方法， 该器官芯片模拟了肝脏复杂的多种微环境要素， 解决了传统 说明书 1/6 页 4 CN 105176816 B 4 的药物筛选中使用细胞和动物模型的固有缺陷， 解决了现有肝脏细胞培养体系存在的结构 单一， 和模拟功能少的缺点， 能够有效进行多细胞的依次定位植入和培养， 并进。

16、行药物的安 全性和有效性评价。 0006 为实现上述目的， 本发明采用以下技术方案： 0007 一种基于细胞聚集体的微脉管肝脏芯片， 包括位于上层的微脉管系统， 中间的类 血管内皮屏障系统和下层的肝脏器官多细胞共培养系统， 微脉管系统和肝脏器官多细胞共 培养系统分别设置于各自的片基上； 其中， 所述微脉管系统包括由若干阻流栅栏交错布置 构成的弯曲脉管， 所述弯曲脉管两端分别设有微脉管进口和微脉管出口； 所述类血管内皮 屏障系统由多孔膜组成； 所述肝脏器官多细胞共培养系统包括细胞聚集体富集区和多种细 胞共培养区， 并在两端分别设置有培养系统进口和培养系统出口， 肝脏器官多细胞共培养 系统位于培养。

17、系统进口的内部区域设置有两个分流栅栏， 其中， 细胞聚集体富集区由多个 月牙槽状结构组成， 每个月牙槽状结构上均设置有若干缝隙， 多个月牙槽状结构纵向排列 成若干列， 且该若干列交错布置， 所有月牙槽状结构的开口均朝着培养系统进口。 0008 所述片基为聚二甲基硅氧烷 （PDMS） 、 聚甲基丙烯酸甲酯 （PMMA） 、 玻璃、 聚碳酸酯 （PC） 、 聚四氟乙烯、 硝酸纤维素、 生物膜、 硅片的一种或几种。 0009 所述肝脏器官多细胞共培养系统所用的细胞粘附和培养基质为胶原蛋白、 纤维蛋 白胶、 细胞外基质蛋白、 BSA蛋白、 丝素蛋白、 明胶、 壳聚糖、 精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸 （RG。

18、D） 、 基质胶 （Matrigel） 、 海藻酸钠、 异甲基丙烯酰胺 （NIPAM） 、 聚乙二醇 （PEG） 或聚乙二醇丙烯酸 酯 （PEGDA） 的一种或几种， 优先选择为胶原蛋白。 0010 所述微脉管系统的微脉管入口和微脉管出口通道深度， 阻流栅栏高度和弯曲脉管 深度均为100 m； 阻流栅栏的宽度为20 m， 形状为半圆形倒角， 且与肝脏器官多细胞共培养 系统中月牙槽状结构的位置相对应； 弯曲脉管是圆滑的通道， 通道宽度为600 m， 弯曲数为 20。 0011 所述多孔膜的材料为聚二甲基硅氧烷 （PDMS） 、 Transwell 用的PET或 PC膜的一 种， 厚度为10 m，。

19、 孔径为0.4， 1, 3, 5, 8 m， 优先选择孔径为1 m的PDMS柔性膜。 0012 所述肝脏器官多细胞共培养系统的培养系统入口和培养系统出口通道深度， 分流 栅栏和月牙槽状结构的高度均为100 m； 分流栅栏为圆滑弧形， 与进口通道对齐， 并等距对 称布置； 月牙槽状结构的个数为80个， 其外圆环半径为350 m， 内圆环半径为150 m， 月牙槽 状结构上的缝隙为四个， 并均匀发散排列， 其宽度为20 m， 深度100 m， 内圆环开口直线距离 为100 m， 月牙槽状结构相互之间的间隔距离为100 m。 0013 一种基于细胞聚集体的微脉管肝脏芯片的制备方法， 包括以下步骤： 。

20、0014 （1） 用计算机辅助设计软件设计和绘制器官芯片的掩膜板， 精确绘制各层芯片的 微结构和微通道图形； 0015 （2） 通过微加工技术， 特别是光刻蚀的方法， 制备出上下两层的掩膜， 制备出含有 微结构和微通道的芯片； 0016 （3） 将上层的微脉管系统芯片， 中间的多孔膜和下层的肝脏器官多细胞共培养系 统进行对齐， 加压， 并进行等离子体键合， 形成三维立体的微结构和微通道网络； 0017 （4） 通过微脉管进口和培养系统进口通道依次种植不同细胞种类， 并进行贴壁和 三维聚集体培养， 并进行肝脏实质细胞形貌和功能性 （白蛋白分泌， 尿素合成， P450酶活性 说明书 2/6 页 5。

21、 CN 105176816 B 5 等） 评价； 0018 （5） 通过上层和下层通道依次通入药物进行药物肝脏毒性和药物活性评价 （药物 的长期和短期肝脏毒性， 以及药物的IC50值） 。 0019 在微脉管系统和类血管内皮屏障系统形成的密闭区域中种植血管内皮细胞， 细胞 密度为1x106个/mL， 贴壁培养24小时， 形成血管内皮细胞层。 0020 在肝脏器官多细胞共培养系统依次种植多种细胞， 肝脏细胞聚集体首先通过培养 系统进口通道进入细胞聚集体富集区的月牙槽状结构， 并富集生长为三维聚集体生长； 多 种细胞共培养区通过培养系统进口通道种植共培养细胞种类， 共培养细胞种类包括肝星形 细胞，。

22、 库普弗细胞， 角质细胞， 以及成纤维细胞， 细胞密度为1x106个/mL， 贴壁培养24小时。 0021 一种基于细胞聚集体的微脉管肝脏芯片的使用方法， ： 在进行药物评价时， 药物通 过微脉管系统进入芯片， 然后穿透类血管内皮屏障系统， 进入到下层的肝脏器官多细胞共 培养系统， 从而评价其肝脏的毒性作用以及进行药物的代谢和转化； 或者， 药物也通过培养 系统进口直接进入肝脏器官多细胞共培养系统， 与肝实质细胞聚集体和共培养细胞直接进 行接触并实现代谢和转化， 并验证药物的肝脏毒性和药物活力。 0022 本发明的有益效果是： 0023 （1） 肝脏芯片构建了微脉管系统， 并以多孔膜和内皮细胞。

23、为基础制备了类血管内 皮屏障系统， 有效模拟了肝血窦内部的微脉管和内皮屏障功能， 可以供给营养和氧气。 0024 （2） 肝脏芯片通过多缝隙月牙槽设计富集肝实质细胞聚集体， 并进行三维聚集体 的长期培养， 有效实现肝脏内部细胞的高密度、 定位和三维培养， 有助于实现细胞的信息交 流和相互促进作用。 0025 （3） 肝脏芯片通过多缝隙月牙槽设计肝细胞聚集体富集区域周围种植其他肝脏种 类的细胞， 实现多种细胞的共培养， 有效模拟了实际肝脏器官内部多样的细胞类型和细胞 间的相互作用。 0026 （4） 肝脏芯片可以实现肝实质细胞的长期培养， 并进行有效的药物评价应用， 透明 材质可以在线监测细胞、。

24、 组织和器官的生物学行为， 从而为细胞-药物相互作用和药物筛选 提供了一个全新的技术平台。 附图说明 0027 图1是本发明的结构示意图； 0028 图2是微脉管系统的结构示意图； 0029 图3是类血管内皮屏障系统的结构示意图； 0030 图4是肝脏器官多细胞共培养系统的结构示意图； 0031 图5是图4中A部位的放大图； 0032 图6是基于细胞聚集体的微脉管肝脏芯片的细胞定位分布情况，（a） 为贴壁生长在 多孔膜上的血管内皮细胞层， 并进行了绿色荧光Calcein-AM染色，（b） 为肝脏实质细胞三维 聚集体富集生长， 并进行了蓝色荧光Hochest33342细胞核染色，（c） 为贴壁生。

25、长在多细胞共 培养区域的小鼠胚胎成纤维细胞， 并进行了绿色荧光Calcein-AM染色。 0033 图中， 1-微脉管系统， 2-类血管内皮屏障系统， 3-肝脏器官多细胞共培养系统， 4- 阻流栅栏， 5-弯曲脉管， 6-微脉管进口， 7-微脉管出口， 8-多孔膜， 9-肝脏细胞聚集体富集 说明书 3/6 页 6 CN 105176816 B 6 区， 10-多种细胞共培养区， 11-培养系统出口， 12-培养系统进口， 13-分流栅栏， 14-缝隙， 15-月牙槽状结构。 具体实施方式 0034 下面结合附图对本发明作更进一步的说明。 0035 如图1-5所示为一种基于细胞聚集体的微脉管肝脏。

26、芯片， 其特征在于： 包括位于上 层的微脉管系统1， 中间的类血管内皮屏障系统2和下层的肝脏器官多细胞共培养系统3， 微 脉管系统1和肝脏器官多细胞共培养系统3分别设置于各自的片基上； 0036 其中， 如图2， 微脉管系统1包括由若干阻流栅栏4交错布置构成的弯曲脉管5， 所述 弯曲脉管5两端分别设有微脉管进口6和微脉管出口7； 0037 如图3， 类血管内皮屏障系统2由多孔膜8组成； 0038 如图4， 肝脏器官多细胞共培养系统3包括细胞聚集体富集区9和多种细胞共培养 区10， 并在两端分别设置有培养系统进口12和培养系统出口11， 肝脏器官多细胞共培养系 统3位于培养系统进口12的内部区域。

27、设置有两个分流栅栏13， 其目的是让通入的细胞在通 道内均匀分散开， 防止边缘没有细胞， 直接从中间通道穿过芯片， 其中， 细胞聚集体富集区9 由多个月牙槽状结构15组成， 如图5， 每个月牙槽状结构15上均设置有若干缝隙14， 多个月 牙槽状结构15纵向排列成若干列， 且该若干列交错布置， 所有月牙槽状结构15的开口均朝 着培养系统进口12。 0039 片基为聚二甲基硅氧烷 （PDMS） 、 聚甲基丙烯酸甲酯 （PMMA） 、 玻璃、 聚碳酸酯 （PC） 、 聚四氟乙烯、 硝酸纤维素、 生物膜、 硅片的一种或几种。 0040 肝脏器官多细胞共培养系统3所用的细胞粘附和培养基质为胶原蛋白、 纤。

28、维蛋白 胶、 细胞外基质蛋白、 BSA蛋白、 丝素蛋白、 明胶、 壳聚糖、 精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸 （RGD） 、 基 质胶 （Matrigel） 、 海藻酸钠、 异甲基丙烯酰胺 （NIPAM） 、 聚乙二醇 （PEG） 或聚乙二醇丙烯酸酯 （PEGDA） 的一种或几种， 优先选择为胶原蛋白。 0041 微脉管系统1的微脉管入口6和微脉管出口7通道深度， 阻流栅栏4高度和弯曲脉管 5深度均为100 m； 阻流栅栏4的宽度为20 m， 形状为半圆形倒角， 且与肝脏器官多细胞共培 养系统3中月牙槽状结构15的位置相对应； 弯曲脉管5是圆滑的通道， 通道宽度为600 m， 弯 曲数为20。 004。

29、2 多孔膜8的材料为聚二甲基硅氧烷 （PDMS） 、 Transwell 用的PET或 PC膜的一种， 厚 度为10 m， 孔径为0.4， 1, 3, 5, 8 m， 优先选择孔径为1 m的PDMS柔性膜。 0043 肝脏器官多细胞共培养系统3的培养系统入口11和培养系统出口12通道深度， 分 流栅栏13和月牙槽状结构15的高度均为100 m； 分流栅栏13为圆滑弧形， 与进口通道对齐， 并等距对称布置； 月牙槽状结构15的个数为80个， 其外圆环半径为350 m， 内圆环半径为150 m， 月牙槽状结构15上的缝隙14为四个， 并均匀发散排列， 其宽度为20 m， 深度100 m， 内圆 环。

30、开口直线距离为100 m， 月牙槽状结构15相互之间的间隔距离为100 m。 0044 上述基于细胞聚集体的微脉管肝脏芯片的制备方法， 包括以下步骤： 0045 （1） 用计算机辅助设计软件 （如Auto-CAD或Solidwork） 设计和绘制器官芯片的掩 膜板， 精确绘制各层芯片的微结构和微通道图形； 0046 （2） 通过微加工技术， 特别是光刻蚀的方法， 制备出上下两层的掩膜， 制备出含有 说明书 4/6 页 7 CN 105176816 B 7 微结构和微通道的芯片； 0047 （3） 将上层的微脉管系统芯片， 中间的多孔膜和下层的肝脏器官多细胞共培养系 统进行对齐， 加压， 并进行。

31、等离子体键合， 形成三维立体的微结构和微通道网络； 0048 （4） 通过微脉管进口和培养系统进口通道依次种植不同细胞种类， 并进行贴壁和 三维聚集体培养， 并进行肝脏实质细胞形貌和功能性 （白蛋白分泌， 尿素合成， P450酶活性 等） 评价； 0049 （5） 通过上层和下层通道依次通入药物进行药物肝脏毒性和药物活性评价 （药物 的长期和短期肝脏毒性， 以及药物的IC50值） 。 0050 在微脉管系统1和类血管内皮屏障系统2形成的密闭区域中种植血管内皮细胞， 细 胞密度为1x106个/mL， 贴壁培养24小时， 形成血管内皮细胞层。 0051 在肝脏器官多细胞共培养系统3依次种植多种细胞。

32、， 肝脏细胞聚集体首先通过培 养系统进口12通道进入细胞聚集体富集区9的月牙槽状结构15， 并富集生长为三维聚集体 生长； 多种细胞共培养区10通过培养系统进口12通道种植共培养细胞种类， 共培养细胞种 类包括肝星形细胞， 库普弗细胞， 角质细胞， 以及成纤维细胞， 细胞密度为1x106个/mL， 贴壁 培养24小时。 0052 上述基于细胞聚集体的微脉管肝脏芯片的使用方法为： 在进行药物评价时， 药物 通过微脉管系统1进入芯片， 然后穿透类血管内皮屏障系统2， 进入到下层的肝脏器官多细 胞共培养系统3， 从而评价其肝脏的毒性作用以及进行药物的代谢和转化； 或者， 药物也通 过培养系统进口12。

33、直接进入肝脏器官多细胞共培养系统3， 与肝实质细胞聚集体和共培养 细胞直接进行接触并实现代谢和转化， 并验证药物的肝脏毒性和药物活力。 0053 以下结合具体实施例对上述方案做进一步说明。 应理解， 这些实施例是用于说明 本发明而不限于限制本发明的范围。 实施例中采用的实施条件可以根据具体条件做进一步 调整， 未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。 0054 实施例1 基于细胞聚集体的微脉管肝脏芯片的设计和制备 0055 用计算机辅助设计软件 （如Auto-CAD或Solidwork等） 设计和绘制基于细胞聚集体 的微脉管肝脏芯片的微结构和微通道图形。 首先采用在底片上旋涂光刻胶， 通过光刻。

34、自显 影后形成光刻胶模具， 通过微机电加工中的硅深刻蚀技术制作硅摸具， 也可利用数控CNC系 统加工制备芯片的微结构和微通道。 将聚二甲基硅氧烷 （PDMS） 的预聚体与固化剂混合， 经 超声、 搅拌、 真空脱气等步骤后浇铸在上下两层芯片的模具上， 在7080热反应13小时或 65过夜热反应， 自然冷却。 将聚二甲基硅氧烷 （PDMS） 芯片从模具上小心揭下， 并将上下两 层芯片与置于中间的洁净的多孔膜进行对齐、 粘合、 等离子体键合， 制成有微脉管系统， 类 血管内皮屏障系统和肝脏多细胞共培养系统的肝脏芯片。 0056 实施例2 肝脏芯片多细胞共培养系统的得细胞植入和定位培养 0057 关闭。

35、肝脏多细胞共培养系统通道的进口和入口， 打开微脉管系统的进口和出口， 经由微脉管系统的进口， 将内皮细胞培养液缓慢流经微通道进入微脉管系统的弯曲脉管内 部， 精致培养24小时， 待内皮细胞贴壁生长在中间的多孔膜上， 形成类血管内皮屏障。 关闭 微脉管系统的进口和出口， 打开肝脏器官多细胞共培养系统的出口和进口， 将悬滴法制备 的肝脏细胞聚集体培养液缓慢注入肝脏多细胞共培养系统空腔中， 因缝隙宽度比较小， 培 养液和单个细胞很容易通过， 而细胞聚集体的直径比较大， 细胞聚集体会不断地富集在月 说明书 5/6 页 8 CN 105176816 B 8 牙槽结构内部， 形成更大的细胞聚集体， 并根据。

36、月牙槽结构的形状进行三维的培养和生长， 用新鲜培养液清洗掉未被捕获和富集在月牙槽内部的细胞或细胞聚集体。 继续将多种肝脏 星形细胞胶质细胞， 库普弗细胞， 以及成纤维细胞等共培养细胞的培养液缓慢流经微通道 进入肝脏多细胞培养系统的空腔内， 静置培养24小时， 贴壁生长。 待细胞贴壁牢固后， 进行 连续的培养液供给。 0058 实施例3 药物活性及安全性检测 0059 待细胞稳定生长和增殖后， 进行药物的肝脏毒性和药物活性评价。 药物按不同浓 度溶解在细胞培养液中， 经由微脉管系统通道入口缓慢流入微脉管系统的弯曲脉管内部， 药物穿过类血管内皮屏障系统的多孔膜细胞层， 进入到下层的肝脏器官多细胞共。

37、培养系 统， 并经由肝脏实质细胞的代谢和转化， 以此进行肝脏细胞形貌表征和细胞功能活性 （如白 蛋白分泌， 尿素合成， P450酶活性） 的评价， 从而评价药物的肝脏毒性和药物活性。 另外， 药 物按不同浓度溶解在细胞培养液中， 经由肝脏器官多细胞共培养系统的进口缓慢流入其空 腔内部， 药物直接作用于肝实质细胞聚集体和多细胞种类， 并经由肝脏实质细胞的代谢和 转化， 以此进行肝脏细胞形貌表征和细胞功能活性的评价， 从而也进行药物对正常肝脏细 胞的安全性或药物对病理肝脏细胞的药物活性的检测。 0060 上述实例只为说明本发明的技术构思及特点， 其目的在于让熟悉此项技术的人是 能够了解本发明的内容并据以实施， 并不能以此限制本发明的保护范围。 凡根据本发明精 神实质所做的等效变换或修饰， 都应涵盖在本发明的保护范围之内。 说明书 6/6 页 9 CN 105176816 B 9 图1 图2 图3 说明书附图 1/3 页 10 CN 105176816 B 10 图4 图5 说明书附图 2/3 页 11 CN 105176816 B 11 图6 说明书附图 3/3 页 12 CN 105176816 B 12 。