一种油酸分子修饰的纳米凝胶包被生物炭基固定化脂肪酶及其制备方法.pdf

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201410133510.6 (22)申请日 2014.04.04 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 103882004 A (43)申请公布日 2014.06.25 (73)专利权人 中国科学院城市环境研究所 地址 361000 福建省厦门市集美大道1799 号 专利权人 中国科学院宁波城市环境研究中 心 （筹） (72)发明人 胡朝华万顺刚唐晓达张又弛 (51)Int.Cl. C12N 11/14(2006.01) C12N 11/04(2006.01) 审查员。

2、 张锦广 (54)发明名称 一种油酸分子修饰的纳米凝胶包被生物炭 基固定化脂肪酶及其制备方法 (57)摘要 本发明涉及脂肪酶固定化技术领域， 提供一 种油酸分子修饰的纳米凝胶包被生物炭基固定 化脂肪酶的制备方法， 包括以下步骤： 将茅草生 物质碳化成生物炭基质， 采用油酸分子修饰的纳 米凝胶对所述生物炭基质表面进行包被， 包被后 的生物炭基质与脂肪酶溶液充分接触， 对脂肪酶 进行界面活化与交联固定， 冷冻干燥后获得固定 化脂肪酶； 本发明同时提供一种利用上述制备方 法所制得的固定化脂肪酶， 采用该方法进行处理 的脂肪酶的催化活性得到大幅度的提高。 权利要求书1页 说明书4页 附图4页 CN 1。

3、03882004 B 2017.09.29 CN 103882004 B 1.一种油酸分子修饰的聚N-异丙基丙烯酰胺纳米凝胶包被生物炭基质固定化脂肪酶 的方法， 其特征在于， 包括以下步骤： 将茅草生物质碳化成生物炭基质， 采用油酸分子修饰 的纳米凝胶对所述生物炭基质表面进行包被， 包被后的生物炭基质与脂肪酶溶液充分接 触， 对脂肪酶进行界面活化与交联固定， 冷冻干燥后获得固定化脂肪酶； 所述油酸分子修饰 的纳米凝胶， 采用热引发自由基聚合反应合成。 2.根据权利要求1所述的油酸分子修饰的聚N-异丙基丙烯酰胺纳米凝胶包被生物炭基 质固定化脂肪酶的方法， 其特征在于： 所述茅草生物碳的碳化条件为。

4、初步限氧热裂解后， 继 续在氮气保护下以3100/min的升温速率加热到400900， 再炭化14h。 3.根据权利要求1所述的油酸分子修饰的聚N-异丙基丙烯酰胺纳米凝胶包被生物炭基 质固定化脂肪酶的方法， 其特征在于： 所述油酸分子修饰的纳米凝胶采用热引发自由基聚 合反应合成， 反应液的投料组分分别为： 功能单体N-异丙基丙烯酰胺、 油酸钠， 交联单体N, N -亚甲基双丙烯酰胺， 乳化剂曲拉通， 以及引发剂过硫酸钠。 4.根据权利要求1所述的油酸分子修饰的聚N-异丙基丙烯酰胺纳米凝胶包被生物炭基 质固定化脂肪酶的方法， 其特征在于， 按以下方法制备油酸分子修饰的纳米凝胶包被生物 炭基质： 。

5、取油酸修饰的聚N-异丙基丙烯酰胺纳米胶乳液， 加入茅草生物炭， 25搅拌混匀1 12h， 6080加热16h， 过滤收集沉淀， 60真空干燥。 5.根据权利要求1所述的油酸分子修饰的聚N-异丙基丙烯酰胺纳米凝胶包被生物炭基 质固定化脂肪酶的方法， 其特征在于， 所述脂肪酶进行界面活化与交联固定的处理步骤包 括： 将脂肪酶溶于磷酸缓冲液中， 接着与油酸分子修饰的纳米凝胶包被生物炭基质混合1 7h， 接着加入浓度为0.55wt的戊二醛的磷酸缓冲液， 2550下磁力搅拌20200min。 6.根据权利要求1所述的油酸分子修饰的聚N-异丙基丙烯酰胺纳米凝胶包被生物炭基 质固定化脂肪酶的方法， 其特征在。

6、于： 所述的脂肪酶为猪胰脂肪酶、 假单胞菌脂肪酶、 伯克 霍尔德菌脂肪酶、 假丝酵母脂肪酶、 根霉脂肪酶、 曲霉脂肪酶中的任意一种。 7.权利要求16任一项所述的油酸分子修饰的聚N-异丙基丙烯酰胺纳米凝胶包被生 物炭基质固定化脂肪酶的方法制备的固定化脂肪酶。 权利要求书 1/1 页 2 CN 103882004 B 2 一种油酸分子修饰的纳米凝胶包被生物炭基固定化脂肪酶及 其制备方法 技术领域 0001 本发明涉及脂肪酶固定化技术领域， 尤其涉及一种油酸分子修饰的纳米凝胶包被 生物炭基固定化脂肪酶及其制备方法。 背景技术 0002 生物酶法合成生物柴油被公认为是一种节能环保型能源技术。 生物酶。

7、法是以脂肪 酶为催化剂， 在非水溶液体系中催化动植物油脂 （脂肪酸甘油三酯） 与短链醇合成脂肪酸单 烷基酯 （即生物柴油） ， 这种催化合成方法具有原料预处理简单、 醇用量少、 能耗低、 产物分 离回收方便以及环境友好等优点。 然而， 游离的脂肪酶催化活性和使用寿命不足限制了其 在催化制备生物柴油中的应用。 许多策略如脂肪酶分子修饰和酶固定化技术已经被用于改 善脂肪酶在非水溶液体系中的催化活性和稳定性。 酶固定化技术由于能提高脂肪酶的催化 性和重复使用效率， 明显降低酶催化工艺的成本， 因而已成为制备生物柴油的关键技术之 一。 0003 传统的脂肪酶固定化材料， 包括已商业化的固定化脂肪酶No。

8、vozym435所采用的大 孔丙烯酸树脂， 往往采用惰性的无机或有机材料 （在中国专利公开号CN1844382A、 CN101280297A、 CN101381721A、 CN101613690A、 CN102191236A、 CN103468668A中均有介绍） ， 这些酶固定载体及其固定化过程缺乏可调控性。 与传统的惰性载体相比， 智能化高分子材 料 （如温度敏感型水凝胶） 是一类理想的酶固定载体， 其在增加酶负载量、 保持酶分子构象 和催化活性、 以及提高固定化酶再利用性等方面具有重要的应用价值。 我们前期研究表明， 聚N-异丙基丙烯酰胺水凝胶 （PNIPAAm） 及其共聚物是一类具有温。

9、度敏感性的智能水凝胶 （Hu等， Journal of Materials Chemistry. 2009） ， 在33左右体积剧烈变化并产生相分 离， 这个温度被定义为较低临界溶液温度 （LCST） 。 当外界环境温度低于LCST， PNIPAAm水凝 胶通过溶胀作用大量吸水； 反之， 外界温度高于LCST时， 水凝胶剧烈收缩并将所吸收于凝胶 内部的水排出， 这种独特的 “溶胀吸水/收缩排水” 特性已被广泛用于负载酶等生物大分子。 在非水相中， 固定化脂肪酶分子表层是否保持适度水分是稳定酶活性构象的关键环节之 一。 酶蛋白分子表面通过氢键结合作用吸附着一层水分子， 这些水分子对酶活性构象起到。

10、 平衡和稳定作用， 并且调节酶分子与底物的结合以及酶分子与产物的分离。 因此， 利用这类 温敏性水凝胶有望实现固定化脂肪酶表层水分含量的可调可控。 0004 生物炭是一种低成本、 多功能的环保材料， 已被广泛用于温室气体减排、 退化土壤 改良、 以及重金属和有机污染物的环境修复等领域,目前有关生物炭载体用于固定化脂肪 酶的研究尚未见报道。 因此， 结合采用生物炭和温敏性高分子凝胶， 研新型脂肪酶固定化载 体与固定化技术具有创新性和必要性， 新型固定化脂肪酶及其制备方法对于安全、 高效转 化生物柴油具有重要的实际应用价值。 发明内容 说明书 1/4 页 3 CN 103882004 B 3 00。

11、05 因此， 针对以上内容， 本发明提供一种油酸分子修饰的纳米凝胶包被生物炭基固 定化脂肪酶及其制备方法， 采用该方法进行处理的脂肪酶的催化活性得到大幅度的提高。 0006 为达到上述目的， 本发明是通过以下技术方案实现的： 一种油酸分子修饰的纳米 凝胶包被生物炭基固定化脂肪酶的制备方法， 包括以下步骤： 将茅草生物质碳化成生物炭 基质， 采用油酸分子修饰的纳米凝胶对所述生物炭基质表面进行包被， 包被后的生物炭基 质与脂肪酶溶液充分接触， 对脂肪酶进行界面活化与交联固定， 冷冻干燥后获得固定化脂 肪酶。 0007 进一步的改进是： 所述茅草生物碳的碳化条件为初步限氧热裂解后， 继续在氮气 保护。

12、下以310/min的升温速率加热到400900， 再炭化14h。 0008 进一步的改进是： 所述油酸分子修饰的纳米凝胶采用热引发自由基聚合反应合 成， 反应液的投料组分分别为： 功能单体N-异丙基丙烯酰胺、 油酸钠， 交联单体N,N -亚甲基 双丙烯酰胺， 乳化剂曲拉通， 以及引发剂过硫酸钠。 0009 进一步的改进是： 按以下方法制备油酸分子修饰的纳米凝胶包被生物炭基质： 取 油酸修饰的聚N-异丙基丙烯酰胺纳米胶乳液， 加入茅草生物炭， 25搅拌混匀112h， 60 80加热16h， 过滤收集沉淀， 60真空干燥。 0010 进一步的改进是： 脂肪酶进行界面活化与交联固定的处理步骤包括： 。

13、将脂肪酶溶 于磷酸缓冲液中， 接着与油酸分子修饰的纳米凝胶包被生物炭基质反应17h， 接着加入浓 度为0.55wt%的戊二醛的磷酸缓冲液， 2550下磁力搅拌20200min。 0011 进一步的改进是： 所述的脂肪酶为猪胰脂肪酶、 假单胞菌脂肪酶、 伯克霍尔德菌脂 肪酶、 假丝酵母脂肪酶、 根霉脂肪酶、 曲霉脂肪酶中的任意一种。 0012 上述制备方法的固定化脂肪酶也属于本发明的保护范围。 0013 通过采用前述技术方案， 本发明的有益效果是： 本发明采用油酸分子修饰的纳米 凝胶包被在茅草生物炭基质的表面， 通过油/水界面的活化效应激活脂肪酶分子的催化活 性位点， 并通过凝胶的溶胀/退溶胀作。

14、用增强脂肪酶的固定化效果， 进一步的， 采用了戊二 醛进一步交联并定向化固定活性脂肪酶， 提高固定化脂肪酶的催化活性。 0014 本发明具有以下特点： 0015 1、 首次采用油酸分子修饰功能化载体的内外表面， 通过油/水界面的活化效应增 强脂肪酶分子活性构象与催化活性； 0016 2、 结合可控释水分子的温敏性高分子凝胶网络， 保护脂肪酶活性并实现酶固定化 过程的调控， 提高脂肪酶的固定化效果和催化活性； 0017 3、 以茅草生物炭作为固定化基质， 其生物质原料可再生， 制备过程环保、 经济； 0018 4、 新型固定化脂肪酶具有稳定的酶催化活性， 并可重复利用， 其制备方法简单、 条 件。

15、温和、 成本低廉。 0019 在本实验条件下， 同等量的不同脂肪酶的催化酯水解活性大小如下： 纳米凝胶包 被生物炭固定化脂肪酶 游离脂肪酶 非包被生物炭基固定化脂肪酶， 其中纳米凝胶 包被生物炭固定化脂肪酶的催化酯水解活性比游离脂肪酶增加了224.5%， 而比非包被的生 物炭基固定化脂肪酶增强了45.3倍。 附图说明 说明书 2/4 页 4 CN 103882004 B 4 0020 图1为本发明实施例的制备技术路线图。 0021 图2为本发明实施例中过筛的茅草生物炭表面形貌示意图。 0022 图3为油酸分子修饰的聚N-异丙基丙烯酰胺纳米凝胶透射电镜图。 0023 图4为油酸分子修饰的纳米凝胶。

16、包被生物炭基固定化脂肪酶表面形貌。 具体实施方式 0024 以下将结合具体实施例来详细说明本发明的实施方式， 借此对本发明如何应用技 术手段来解决技术问题， 并达成技术效果的实现过程能充分理解并据以实施。 0025 若未特别指明， 实施例中所采用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手 段， 所采用的试剂和产品也均为可商业获得的。 所用试剂的来源、 商品名以及有必要列出其 组成成分者， 均在首次出现时标明。 0026 本发明的实施例为： 0027 参考图1、 图2、 图3及图4， 一种油酸分子修饰的纳米凝胶包被生物炭基固定化脂肪 酶的制备方法， 具体操作步骤如下： 1） 制备生物炭： 将茅草生。

17、物质粉碎后， 在炭化炉中400 限氧热裂解30min， 在氮气保护下， 继续以3/min的升温速率加热到675， 再炭化2h， 将所 得生物质炭研磨过筛， 选取过20-100目筛的的茅草生物炭作为酶固定化基质 （附图2） 。 2） 制 备油酸分子修饰的纳米凝胶： 分别称取2.5份的N-异丙基丙烯酰胺、 0.075份的N,N -亚甲基 双丙烯酰胺， 以及0.96份油酸钠在水相中混匀， 加入2份曲拉通X-100的； 通惰性气体， 70 搅拌预热20min； 加入0.2wt%的过硫酸钠水溶液， 继续搅拌热聚合反应3h； 所得反应产物即 为油酸修饰的聚N-异丙基丙烯酰胺纳米凝胶乳液 （附图3） ； 3。

18、） 制备油酸分子修饰的纳米凝 胶包被生物炭： 取上述油酸修饰的聚N-异丙基丙烯酰胺纳米胶乳液， 加入4.2份茅草生物 炭， 搅拌混匀3h， 80加热1.5h， 过滤收集沉淀， 所得沉淀物真空干燥， 即得油酸修饰的纳米 凝胶包被生物炭基载体。 4） 脂肪酶的 “油水界面活化” 与固定： 将1份脂肪酶溶于40 份 磷酸 缓冲液 （pH7, 50mmol/L） ， 充分溶解后， 离心去除杂质， 收集酶上清液， 与1份油酸修饰的纳 米凝胶包被生物炭基载体混合， 25下搅拌混匀后， 250rpm振荡3h， 使油酸分子修饰的纳米 凝胶网络溶胀， 通过油/水界面活化效应增强脂肪酶分子的催化活性； 为了进一步。

19、提高活化 脂肪酶在载体上的固定化效果， 加入戊二醛 （终浓度为1wt%） ， 35下磁力搅拌80min， 使载 体上已活化的脂肪酶分子之间相互交联并定向固定下来； 高速离心， 反复用磷酸缓冲液洗 涤， 收集沉淀物， -50冷冻干燥， 即获得油酸分子修饰的纳米凝胶包被生物炭基固定化脂 肪酶。 0028 对比例子： 0029 用非包被的茅草生物炭作为载体， 直接吸附、 交联固定脂肪酶， 以与油酸分子修饰 的纳米凝胶包被生物炭固定化脂肪酶比较。 非包被的茅草生物炭基固定化脂肪酶的制备方 法同上。 同时， 以游离的脂肪酶为对照， 进一步比较和非包被的生物炭基固定化脂肪酶与界 面活化的纳米凝胶包被生物炭。

20、固定化脂肪酶的催化酯水解反应活性。 0030 测定脂肪酶水解活性的操作步骤如下： 0031 称取62.29mg的棕榈酸对硝基苯酯溶解到10ml异丙醇溶剂中， 制备棕榈酸对硝基 苯酯的2-异丙醇溶液 （16.5mmol/L） 。 取1ml上述溶液， 加到9ml的磷酸缓冲液 （pH7， 10mM） ， 再 加入0.2ml的曲拉通x-100 （2w/v%） 和10mg阿拉伯胶 （0.1w/v%） 。 将上述10ml反应底物装于圆 说明书 3/4 页 5 CN 103882004 B 5 底烧瓶中， 在50保育30min， 投入25mg固定化脂肪酶， 继续摇床震荡培养 （200rpm） 。 培养一 定。

21、时间后， 分取0.5-1ml反应液， 用4预冷的去离子水稀释到2.5-3ml， 混匀后， 4高速离 心 （12000rpm） 5min， 取上清液410nm比色分析对硝基苯酚的浓度。 脂肪酶的催化水解活性用 单位体积的酶活性单位 （U/ml） 来评估， 一个酶活性单位定义为在上述条件下单位时间内酶 催化释放1微摩尔的对硝基苯酚。 实验结果表明， 油酸修饰的纳米胶包被的生物炭定向固定 化脂肪酶的催化酯水解反应活性明显高于游离的脂肪酶和非包被的生物炭基固定化脂肪 酶。 在本实验条件下， 同等量 （25mg） 的不同脂肪酶的催化酯水解活性大小如下： 纳米凝胶包 被生物炭定向固定化脂肪酶 游离脂肪酶 。

22、非包被生物炭基固定化脂肪酶， 其中纳米 凝胶包被生物炭定向固定化脂肪酶的催化酯水解活性比游离脂肪酶增加了224.5%， 而比非 包被的生物炭基固定化脂肪酶增强了45.3倍。 0032 其中， 本发明， 所述各个步骤的参数在以下描述的范围内皆可实现本发明的目的： （1） 制备生物炭基质： 将茅草生物质粉碎后， 在炭化炉中250400限氧热裂解0.52h ， 继续以310/min的升温速率加热到400900， 再炭化14h， 将所得生物炭研磨过筛， 选取过20100目筛的茅草生物炭作为酶固定化基质；（2） 制备油酸分子修饰的纳米凝胶： 在烧瓶中加入50200ml的去离子水， 分别加入110wt%的。

23、N-异丙基丙烯酰胺、 0.013wt% 的N,N -亚甲基双丙烯酰胺、 以及0.15wt%的油酸钠， 磁力搅拌混匀后， 加入0.12v/v%曲 拉通X-100； 通惰性气体， 6575搅拌预热2050min； 按15次等量加入0.10.5wt%过 硫酸钠水溶液， 每次间隔时间3060 min， 继续搅拌热聚合反应24h； 所得反应产物即为 油酸修饰的聚N-异丙基丙烯酰胺纳米凝胶乳液；（3） 制备油酸分子修饰的纳米凝胶包被生 物炭： 取上述油酸修饰的聚N-异丙基丙烯酰胺纳米胶乳液， 加入110份茅草生物炭， 25 搅拌混匀112h， 6080加热16h， 过滤收集沉淀， 所得沉淀物在60真空干燥。

24、， 即得油 酸分子修饰的纳米凝胶包被生物炭基载体；（4） 脂肪酶的 “油水界面活化” 与固定： 将15份 脂肪酶溶于磷酸缓冲液， 所述磷酸缓冲液的pH为68， 浓度为10100mmol/L， 充分溶解后， 离心去除杂质， 取脂肪酶上清液， 与15份油酸修改的纳米凝胶包被生物炭基载体混合， 25 下搅拌混匀后， 250rpm振荡13h， 使油酸分子修饰的纳米凝胶网络溶胀， 通过油/水界面 活化效应激活脂肪酶分子催化活性位点； 之后， 加入浓度为0.55wt%的戊二醛的磷酸缓冲 液， 2550下磁力搅拌20200min， 使载体上已活化的脂肪酶分子之间相互交联并定向 化固定下来； 通过高速离心， 。

25、反复用磷酸缓冲液洗涤去除游离脂肪酶， 再收集沉淀物并冷冻 干燥， 即获得界面活化的纳米凝胶包被生物炭固定化脂肪酶。 0033 以上所记载， 仅为利用本创作技术内容的实施例， 任何熟悉本项技艺者运用本创 作所做的修饰、 变化， 皆属本创作主张的专利范围， 而不限于实施例所揭示者。 说明书 4/4 页 6 CN 103882004 B 6 图1 说明书附图 1/4 页 7 CN 103882004 B 7 图2 说明书附图 2/4 页 8 CN 103882004 B 8 图3 说明书附图 3/4 页 9 CN 103882004 B 9 图4 说明书附图 4/4 页 10 CN 103882004 B 10 。