《一种提高绵羊卵母细胞体外发育能力的方法.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《一种提高绵羊卵母细胞体外发育能力的方法.pdf（6页完整版）》请在专利查询网上搜索。
1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201410289845.7 (22)申请日 2014.06.24 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 104342400 A (43)申请公布日 2015.02.11 (73)专利权人 新疆维吾尔自治区畜牧科学院中 国-澳大利亚绵羊育种研究中心 地址 830000 新疆维吾尔自治区乌鲁木齐 市克拉玛依东街151号 (72)发明人 黄俊成汪立芹杨楠林嘉鹏 吴阳升赵云程 (74)专利代理机构 乌鲁木齐新科联知识产权代 理有限公司 65107 代理人 欧咏 (51)Int。
2、.Cl. C12N 5/075(2010.01) (56)对比文件 汪立芹 等.不同因素对绵羊卵母细胞体外 受精效果的影响. 中国畜牧兽医 .2010,第37卷 (第8期),84-87页. 汪立芹 等.PDE3与亮甲酚蓝在绵羊卵母细 胞体外培养中的应用研究. 安徽农业科学 .2011,第39卷(第25期),15408-15409、 15553页. 杨楠 等.TSA对绵羊卵母细胞体外成熟及孤 雌胚胎发育的影响. 西北农业学报 .2014,第23 卷(第3期),9-13页. 审查员 冯娟 (54)发明名称 一种提高绵羊卵母细胞体外发育能力的方 法 (57)摘要 本发明提供的一种提高绵羊卵母细胞体外。
3、 发育能力的方法， 将染色分离获取的质次BCB-卵 母细胞， 体外成熟、 体外受精后用含有200nMol/L 组蛋白去乙酰化抑制剂曲古抑菌素A(TSA)培养 液培养10h， 用不含有TSA的培养液继续培养， 培 养48h后统计卵裂率， 培养7d后统计囊胚率即可， 另将染色分离获取的BCB+卵母细胞用成熟培养 液洗涤2-3次， 培养至24h直接利用。 该法对绵羊 卵母细胞体外利用， 具有重要的实用价值。 权利要求书1页 说明书4页 CN 104342400 B 2017.09.12 CN 104342400 B 1.一种提高绵羊卵母细胞体外发育能力的方法， 其特征在于： 分步实施： 步骤1、 将。
4、染色分离获取的质次BCB-卵母细胞， 用成熟培养液洗涤2-3次， 按25-30枚/ 滴， 放入前2h平衡好的体积为55-78 L/滴的成熟培养液中， 放入CO2箱， 在5CO2、 95的空 气条件下培养； 步骤2、 将步骤1体外成熟23-25h的卵母细胞取出， 用0.1的透明质酸酶处理30-60s， 经吹吸， 脱去卵母细胞周围的卵丘细胞； 用体外受精液洗涤2-4次， 按25-30枚/滴的密度加 入前2h平衡好的50-70 L的体外受精液滴内； 水浴解冻精液， 移入前2h平衡好的装有体外受 精液的试管， 放入CO2箱， 上游20-25min， 取上清， 在1500rpm条件下， 离心4-5min。
5、， 弃去上清 液， 将剩余的精子沉淀， 按2-4106个/mL的密度加入体外受精液滴， 与处理好的卵母细胞 共同孵育； 步骤3、 将步骤2受精20-23h的卵取出， 移至平衡好的含有TSA的体外培养液内， 经吹吸， 脱去卵丘细胞及黏附卵上的精子， 洗涤3-4次， 按50-70枚/孔的密度移入平衡好的500 L/孔 的含有TSA的体外培养液内培养10h,再用不含TSA的体外培养液洗涤2-3次， 放置于不含TSA 的体外培养液内培养7d， 统计囊胚率； 其中BCB-卵母细胞的获取： 摘取宰杀30min内的绵羊卵巢， 置入温度在30-35， 含 1000IU/ml青霉素和1000IU/ml链霉素的生。
6、理盐水中， 3h内用生理盐水清洗3-4次， 用吸有 1mL抽卵液， 带有9号针头的10ml注射器抽吸卵巢表面2-8mm的卵泡， 将注射器内回收的卵泡 液打在35-60mm的皿内， 在显微镜下捡出卵母细胞， 放入添加浓度为25-30 Mol/L的BCB染 色液， 置于35-39水浴中染色80-90min， 在显微镜下将BCB+和BCB-卵母细胞分离， 其中将 染色分离的BCB+卵母细胞， 用成熟培养液洗涤2-3次， 培养至24h， 直接利用； 步骤4实验液体的配制： 抽卵液： TCM-199hepes+1mg/mL PVA+0.7mg/mL肝素钠； 亮甲酚蓝染色液： PBS+26 Mol/L亮甲。
7、酚蓝+5mg/mL BSA； 成熟培养液： TCM-199HCO3+10FBS+0.05IU/mL FSH+0.05IU/mL LH+1 g/mL estradiol +24.2 g/mL丙酮酸钠+0.1mM/L半胱氨酸+10ng/mLEGF+100IU/mL双抗； SOF： 6.29mg/ml NaCL+0.534mg/mL KCL+0.162mg/ml KH2PO4+0.6 l/mL乳酸钠+ 0.089mg/mL MgSO4+2.1mg/mL NaHCO3+0.0357mg/mL丙酮酸钠+0.299mg/mL CaCL22H2O； 体外受精液： SOF+20FBS+6IU/mL肝素钠+10。
8、0IU/mL硫酸庆大霉素； 体外培养液： SOF+3mg/mL BSA； 含TSA体外培养液： SOF+200nMol/L TSA+3mg/mL BSA。 权利要求书 1/1 页 2 CN 104342400 B 2 一种提高绵羊卵母细胞体外发育能力的方法 技术领域 0001 本发明涉及组蛋白去乙酰化抑制剂曲古抑菌素A(TSA)， 对经过BCB筛选后的质量 不好的BCB阴性卵母细胞进行培养的方法， 能显著提高绵羊卵母细胞体外胚胎发育率。 背景技术 0002 TSA是一种非竞争性可逆的组蛋白乙酰化抑制剂， 其来源于链霉素的代谢产物， 它 的主要作用是增强组蛋白的乙酰化水平。 TSA可以特异性抑制。
9、组蛋白去乙酰化酶的活性， 降 低DNA甲基化水平并激活印记基因和管家基因的表达。 而组蛋白的高乙酰化水平可以增强 转录因子与核小体的作用， 有利于基因转录的启动。 当组蛋白乙酰化作用达到高峰时胚胎 的基因组被激活， 并与基因表达水平的增加相一致。 因此， 组蛋白去乙酰化抑制剂TSA可能 会对绵羊卵母细胞及体外胚胎的发育能力产生影响。 0003 在前 期研究的 一 种 用于 绵羊 卵母 细胞 体外的 筛选培养方法 (专 利号 ： ZL200910113567.9)中发现， 经过BCB筛选后的阴性卵母细胞成熟率极显著低于阳性卵母细 胞， 因而， 如何提高阴性卵母细胞质量成为亟待解决的问题。 文献检。
10、索披露： 1.Reprod Fert Dev， 2007， 19(1)， 169， 作者： Zhang Y H等， 发表的 TSA优化处理的克隆胚胎体外培养体系 可以得到克隆小猪 文章得出， 50nM的TSA能提高猪克隆胚胎体外培养的囊胚率。 2.Zygote， 2009， 17， 209-215， 作者： Shuntaro Ikeda等， 发表的 在牛的卵母细胞体外受精过程中通过 TSA增加组蛋白乙酰化水平影响囊胚的内细胞团数 文章得出， 在牛的卵母细胞体外受精过 程中经TSA处理后， 显著提高了囊胚内细胞团数。 3.Reprod Dev， 2011， 57(1)： 34-42， 作者： L。
11、ee M J等， 发表的 TSA提高了牛体细胞核移植胚胎的发育 文章得出， TSA处理牛克隆胚 胎， 可以显著提高牛体细胞核移植的效率。 0004 国内有中国农业科学院北京畜牧兽医研究所刘晓等8人发表的 曲古抑菌素A对猪 卵母细胞体外成熟及孤雌胚胎发育能力的影响 、 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所李 向臣等 5人发表的 TSA对滩羊成纤维细胞作为供体细胞的作用 、 东北农业大学生命科学 学院黄波等5人发表的 TSA浓度及处理时间对猪体细胞核移植胚胎体外发育影响 。 0005 本发明将TSA与BCB筛选技术相结合作为本方法的切入点， 展开的方法学与应用学 的研究， 能极大地提高绵羊卵母细胞体外。
12、发育能力， 具有重要的实践意义。 发明内容 0006 本发明的目在于： 为提高绵羊卵母细胞的质量， 即先采用BCB染色筛选， 再对筛选 后的质量差的卵母细胞用TSA进行抑制培养， 效果十分明显， 该方法简单易操作， 实用性极 强。 0007 本发明的目的是这样实现的： 一种提高绵羊卵母细胞体外发育能力的方法， 分步 实施； 步骤1： 将染色分离获取的质次BCB-卵母细胞， 用成熟培养液洗涤2-3次， 按25-30枚/ 滴， 放入前2h平衡好的体积为55-78 l/滴的成熟培养液中， 放入CO2箱， 在5CO2、 95的空 气条件下培养； 步骤2： 将步骤1体外成熟23-25h的卵母细胞取出， 。
13、用0.1的透明质酸酶处 说明书 1/4 页 3 CN 104342400 B 3 理30-60s， 经吹吸， 脱去卵母细胞周围的卵丘细胞； 用体外受精液洗涤2-4次， 按25-30枚/滴 的密度加入前2h平衡好的50-70 l的体外受精液滴内； 水浴解冻精液， 移入前2h平衡好的装 有体外受精液的试管， 放入CO2箱， 上游20-25min， 取上清， 在1500rpm条件下， 离心4-5min， 弃去上清液， 将剩余的精子沉淀， 按2-4106个/ml的密度加入体外受精液滴， 与处理好的 卵母细胞共同孵育； 步骤3： 将步骤2受精20-23h的卵取出， 移至平衡好的含有TSA的体外培 养液内。
14、， 经吹吸， 脱去卵丘细胞及黏附卵上的精子， 洗涤3-4次， 按50-70枚/孔的密度移入平 衡好的500 l/孔的含有TSA的体外培养液内培养10h， 再用不含TSA的体外培养液洗涤2-3 次， 放置于不含TSA的体外培养液内培养7d， 统计囊胚率； 0008 其中BCB-卵母细胞的获取： 摘取宰杀30min内的绵羊卵巢， 置入温度在30-35， 含 1000IU/ml青霉素和1000IU/ml链霉素的生理盐水中， 3h内用生理盐水清洗3-4次， 用吸有 1ml抽卵液， 带有9号针头的10ml注射器抽吸卵巢表面2-8mm的卵泡， 将注射器内回收的卵泡 液打在 35-60mm的皿内， 在显微镜。
15、下捡出卵母细胞， 放入添加浓度为25-30 Mol/L的BCB染 色液， 置于35-39水浴中染色80-90min， 在显微镜下将BCB+和BCB-卵母细胞分离， 其中将 染色分离的BCB+卵母细胞， 用成熟培养液洗涤2-3次， 培养至24h， 直接利用； 0009 步骤4： 实验液体的配制： 0010 抽卵液： TCM-199hepes+1mg/ml PVA+0.7mg/ml肝素钠； 0011 亮甲酚蓝染色液： PBS+26 Mol/L亮甲酚蓝+5mg/ml BSA； 0012 成熟培养液： TCM-199HCO3+10FBS+0.05IU/ml FSH+0.05IU/ml LH+1 g/m。
16、l estradiol+24.2 g/ml丙酮酸钠+0.1mM/L半胱氨酸+10ng/ml EGF+100IU/ml双抗； 0013 SOF： 6.29mg/ml NaCL+0.534mg/ml KCL+0.162mg/ml KH2PO4+0.6 l/ml乳酸钠+ 0.089mg/ml MgSO4+2.1mg/mlNaHCO3+0.0357mg/ml丙酮酸钠+0.299mg/mlCaCL22H2O； 0014 体外受精液： SOF+20FBS+6IU/ml肝素钠+100IU/ml硫酸庆大霉素； 0015 体外培养液： SOF+3mg/mlBSA； 0016 含TSA体外培养液： SOF+200。
17、nMol/L TSA+3mg/mlBSA。 0017 本 发 明 在 前 期的 研 究 中 ， 已 经 验 证 了 亮甲 酚 蓝 染 色 (B C B) (专 利 号 ： ZL200910113567.9)可用于测定G6PDH活性， 根据G6PDH活性的不同， BCB染色呈现不同程度 的着色； 并且发现BCB-卵母细胞体外培养的成熟率、 卵裂率、 囊胚率显著低于BCB+组， 因此 采用TSA与BCB筛选技术相结合； 就是将BCB-卵母细胞使用添加TSA的培养液作用10h， 能提 高BCB-卵母细胞质量， 而BCB+卵母细胞质量不受任何影响， 从而能提高卵母细胞总体发育 效率。 0018 本发明。
18、的构思及研究机理表明， 添加曲古抑菌素A能显著提高经BCB筛选后的质次 BCB-卵母细胞体外培养囊胚发育率。 采用TSA与BCB筛选技术相结合的技术路线科学合理， 组合方法达到了创新效果， 且有独到之处， 彰显技术进步。 具体实施方式 0019 本发明结合实施例作进一步说明。 0020 实施例、 将染色分离获取的质次BCB-卵母细胞， 用成熟培养液洗涤3次， 按28枚/ 滴， 放入前2h平衡好的体积为60 L/滴的成熟培养液中， 放入CO2箱， 在5CO2、 95的空气条 件下培养； 将体外成熟24h的卵母细胞取出， 用0.1的透明质酸酶处理45s， 经吹吸， 脱去部 说明书 2/4 页 4 。
19、CN 104342400 B 4 分卵丘细胞； 用体外受精液洗涤3次， 按28枚/滴的密度加入前2h平衡好的60 L的体外受精 液滴内； 水浴解冻精液， 移入前2h平衡好的装有体外受精液的试管， 放入CO2箱， 上游23min， 取上清， 在1500rpm条件下， 离心5min， 弃去上清液， 将剩余的精子沉淀， 按3106个/mL的密 度加入体外受精液滴， 与处理好的卵母细胞共同孵育； 将受精21h的卵取出， 移至平衡好的 含有TSA的体外培养液内， 经吹吸， 脱去全部卵丘细胞及黏附卵上的精子， 洗涤4次， 按60枚/ 孔的密度移入平衡好的500 L/孔的含有TSA的体外培养液内培养10h，。
20、 再用不含TSA的体外 培养液洗涤3次， 放置于不含TSA的体外培养液内培养7d， 统计囊胚率； 其中BCB-卵母细胞的 获取： 摘取宰杀30min内的绵羊卵巢， 置入温度在32， 含1000IU/ml青霉素和1000IU/ml链 霉素的生理盐水中， 3h内用生理盐水清洗3次； 用吸有1mL抽卵液， 带有9号针头的10mL注射 器抽吸卵巢表面6mm的卵泡， 将注射器内回收的卵泡液打在45mm的皿内， 在显微镜下捡出卵 母细胞， 放入添加浓度为30 Mol/L的BCB染色液， 至于36水浴中染色90min； 在显微镜下将 BCB+和BCB-卵母细胞分离， 分别培养至24h， 再分别进行体外受精，。
21、 将受精22h的BCB-卵母细 胞取出， 移至平衡好的含有TSA的体外培养液内， 经吹吸， 脱去全部卵丘细胞及黏附卵上的 精子， 洗涤4次， 按60枚/孔的密度移入平衡好的500 L/孔的含有TSA的培养液内培养10h， 再 用不含TSA的培养液洗涤3次， 入培养液内培养48h后统计卵裂率， 7d后统计囊胚率即可； 0021 其中染色分离的BCB+卵母细胞直接利用即可； 0022 其中实验液体的配置： 0023 抽卵液： TCM-199hepes+1mg/mLPVA+0.7mg/ml肝素钠； 0024 亮甲酚蓝染色液： PBS+26 Mol/L亮甲酚蓝+5mg/mLBSA； 0025 成熟培养。
22、液： TCM-199HCO3+10FBS+0.05IU/mL FSH+0.05IU/mL LH+1 g/mL estradiol+24.2 g/mL丙酮酸钠+0.1mM/L半胱氨酸+10ng/mL EGF+100IU/mL双抗； 0026 SOF： 6.29mg/ml NaCL+0.534mg/mL KCL+0.162mg/mL KH2PO4+0.6 l/mL乳酸钠+ 0.089mg/mL MgSO4+2.1mg/mL NaHCO3+0.0357mg/mL丙酮酸钠+0.299mg/mL CaCL22H2O； 体 外受精液： SOF+20FBS+6IU/mL肝素钠+100IU/mL硫酸庆大霉素；。
23、 0027 含TSA体外培养液： SOF+200nMol/L TSA+3mg/mLBSA. 0028 体外培养液： SOF+3mg/mLBSA； 0029 本方法采用显微镜检测卵母细胞质量， 细胞质不着蓝色的BCB-卵母细胞质量显著 低于胞质着蓝色的BCB+卵母细胞。 0030 本方法试验选用的TCM-199hepes、 PVA、 肝素钠、 亮甲酚蓝、 PBS、 BSA、 FBS、 FSH、 LH、 estradiol、 EGF、 半胱氨酸、 TSA均购自SIGMA公司、 双抗购自北京鼎国昌盛生物技术有限公 司。 0031 实验结果及数据验证： 用一组数据验证其采用TSA与BCB染色相结合的方法的有效 性。 将TSA与BCB染色相结合， 能最大限度的提高卵母细胞体外发育能力。 0032 表1 0033 说明书 3/4 页 5 CN 104342400 B 5 0034 注： 数据经统计学软件SPSS分析， 同列标记不同小写字母的为差异显著(P0.05)。 0035 由上表得知： 经TSA作用的的BCB-卵母细胞， 体外受精后虽然对卵裂率没有影响， 但囊胚率显著高于没经TSA作用的BCB-卵母细胞。 说明书 4/4 页 6 CN 104342400 B 6 。