一种韩国新型鸭肝炎病毒抗体ELISA检测试剂盒.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 102127531 A (43)申请公布日 2011.07.20 CN 102127531 A *CN102127531A* (21)申请号 201010599000.X (22)申请日 2010.12.22 C12N 15/09(2006.01) C12N 15/51(2006.01) C12P 21/02(2006.01) G01N 33/576(2006.01) G01N 33/569(2006.01) G01N 33/535(2006.01) (71)申请人 山东省农业科学院家禽研究所 地址 250023 山东省济南市天桥区交校路 1 号 (72)发明人 马秀。

2、丽 黄兵 李玉峰 吴静 于可响 宋敏训 秦卓明 (74)专利代理机构 济南诚智商标专利事务所有 限公司 37105 代理人 王汝银 (54) 发明名称 一种韩国新型鸭肝炎病毒抗体 ELISA 检测试 剂盒 (57) 摘要 本发明公开了一种韩国新型鸭肝炎病毒抗 体 ELISA 检测试剂盒。该试剂盒含有以韩国新 型鸭肝炎 VP1 重组蛋白包被的 ELISA 板、 样品稀 释液、 浓缩洗涤液、 酶结合物工作液、 显色液 A、 显 色液 B、 终止液、 阳性对照和阴性对照。VP1 重组 蛋白是以下述方法获得 ： 以韩国新型鸭肝炎病毒 作为材料， 通过 RT-PCR 方法对其 VP1 基因进行扩 增、 。

3、克隆得到重组质粒 pMD-VP1。然后定向插入 到 pET-32a(+) 表达载体， 筛选获得重组表达质粒 pET-32a(+)-VP1。经 ITPG 诱导表达、 纯化， 获得 VP1 重组蛋白。该检测试剂盒用于韩国新型鸭肝 炎的检测， 其特异性强、 敏感性高、 操作简单， 易于 大范围推广应用， 具有广阔的市场前景。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 2 页 说明书 7 页 序列表 4 页 附图 2 页 CN 102127536 A1/2 页 2 1. 韩国新型鸭肝炎 VP1 重组蛋白的制备， 包括以下步骤 ： 1) 以韩国新型鸭。

4、肝炎病毒作为材料， 通过 RT-PCR 方法对其 VP1 基因进行扩增、 克隆得 到重组质粒 pMD-VP1 ； 扩增 VP1 基因的上下游引物分别是 ： 上游引物 ： 5 -GAATTCGGTGATTCCAATCAGCT-3 下游引物 ： 5 -CTCGAGTTCAATCTCCAGATGGA-3 扩增片段大小为 720bp ； 2)以EcoR I和Xhol I同时对重组质粒pMD-VP1和pET-32a(+)载体进行酶切， 回收目 的片段， 16连接过夜， 转化 BL21(DE3) 感受态细胞， 提取质粒， 经 EcoR I 和 Xhol I 双酶切 鉴定正确后获得阳性重组表达质粒 pET-。

5、32a(+)-VP1 ； 3) 将阳性重组表达质粒 pET-32a(+)-VP1 及空白载体 pET-32a(+) 分别转化 BL21(DE3) 感受态细胞， 获得的阳性质粒菌于 37培养， 待 A600 值达到 0.4 0.6 时， 加入 IPTG 至终 浓度为0.8mmol/L进行诱导表达， 收集诱导表达后4h的菌体， 超声波破碎， 离心后取沉淀进 行SDS-PAGE电泳和Western blot鉴定， 经鉴定的重组菌进行SDS-PAGE电泳， 电泳结束后取 下凝胶， 先用双蒸水洗涤， 然后浸入 4预冷的 250mmol/L 的 KCL 溶液中显色 5 10min， 最 后用双蒸水洗涤 ；。

6、 将目的蛋白条带切下， PBS 洗涤 3 次， 用玻璃棒将其捣细， 反复冻融 3 次， 8000r/min 离心 10min， 吸取上清， SDS-PAGE 电泳进行纯度鉴定。 2.一种韩国新型鸭肝炎病毒抗体ELISA检测试剂盒， 其特征是， 包括权利要求1所述的 韩国新型鸭肝炎 VP1 重组蛋白包被的 ELISA 板。 3. 如权利要求 2 所述的韩国新型鸭肝炎病毒抗体 ELISA 检测试剂盒， 其特征是， 所述 ELISA 板的制备方法为 ： 用 pH8.5 的 0.05M Tris-HCL 缓冲液作包被液， 将韩国新型鸭肝炎 VP1 重组蛋白稀释为 25g/mL， 按 100L/ 孔加入。

7、 ELISA 反应板中， 37封闭 2 小时， 4包 被过夜， 拍干， 用 1牛血清白蛋白 37封闭 2 小时， 以含 0.05吐温 -20pH7.4 的 PBS 洗 涤， 拍干， 再加入 20蔗糖磷酸盐缓冲液室温保护 3 小时。 4.如权利要求2或3所述的韩国新型鸭肝炎病毒抗体ELISA检测试剂盒， 其特征是， 还 包括样品稀释液、 10 浓缩洗涤液、 酶结合物工作液、 显色液 A、 显色液 B、 终止液、 阳性对照 和阴性对照。 5. 如权利要求 4 所述的韩国新型鸭肝炎病毒抗体 ELISA 检测试剂盒， 其特征是， 所述 样品稀释液为含 0.05吐温 -20 的 0.05M pH7.4 。

8、的磷酸盐缓冲液 ； 所述 10 浓缩洗液为 含 0.5吐温 -20 的 0.1M pH7.4 的磷酸盐缓冲液 ； 所述酶结合物工作液为美国 KPL 公司生 产的 HRP- 羊抗鸭 IgG ； 所述显色液 A 为 0.2mg/mL 的四甲基联苯胺溶液， 所述显色液 B 为含 0.5过氧化氢尿素的柠檬酸 - 磷酸盐缓冲液 ； 所述终止液为 2M 硫酸溶液 ； 所述阳性对照 为经韩国新型鸭肝炎VP1重组蛋白免疫获得的阳性血清， 其OD450nm1.0， 加入1000U/mL的 青链霉素， 无菌过滤后获得 ； 所述阴性对照为经筛选获得的阴性血清， 其 OD450nm 0.25， 加 入 1000U/m。

9、L 的青链霉素， 无菌过滤后获得。 6. 如权利要求 5 所述的韩国新型鸭肝炎病毒抗体 ELISA 检测试剂盒， 其特征是， 所述 试剂盒各组分的量为 ： 以韩国新型鸭肝炎VP1重组蛋白包被的ELISA板 ： 5块 ； 样品稀释液 ： 200mL ； 10 浓缩洗涤液 ： 400mL ； 酶结合物工作液 ： 50mL ； 显色液 A ： 50mL ； 显色液 B ： 50mL ； 终止液 ： 60mL ； 阳性对照 ： 2mL ； 阴性对照 ： 2mL。 7. 如权利要求 5 或 6 所述的韩国新型鸭肝炎病毒抗体 ELISA 检测试剂盒的使用方法， 权 利 要 求 书 CN 102127531。

10、 A CN 102127536 A2/2 页 3 其特征是， 将待检血清用样品稀释液作 1 100 稀释， 按 100L/ 孔加入抗体检测板中， 同 时设阴性对照、 阳性对照， 37孵育 45min ； 弃去反应孔中的液体， 每孔加洗涤液 350L， 洗 涤35次， 每次间隔1min， 拍干 ； 每孔加100L的酶结合物工作液， 37孵育45min ； 洗涤 3 5 次， 每次间隔 1min， 拍干 ； 依次加入 50L 显色液 A 和 50L 显色液 B， 37避光孵育 15min ； 加 50L 终止液， 用酶标仪在 450nm 波长下测定各孔吸光度 A 值 ； 以待检样本 OD450nm。

11、 值与阴性对照 OD450nm值的比值大于或等于 2.1， 且待检样本 OD450nm值大于 0.228 判为阳性。 权 利 要 求 书 CN 102127531 A CN 102127536 A1/7 页 4 一种韩国新型鸭肝炎病毒抗体 ELISA 检测试剂盒 技术领域 0001 本发明涉及一种新型鸭肝炎病毒抗体检测试剂盒， 专用于韩国新型 ( 基因 C 型 ) 鸭肝炎病毒抗体的快速检测， 属于生物技术领域。 背景技术 0002 鸭病毒性肝炎是危害雏鸭的一种急性、 高度致死性和接触性的传染病。通常将鸭 肝炎病毒分为 3 个血清型， 即 1 型 (DHV-1)、 2 型 (DHV-2) 和 3。

12、 型 (DHV-3)。其中 1 型 DHV 呈 世界性分布。近年来， 国内许多地区出现新型鸭肝炎的报道， 其与 DHV-1 在序列上存在显著 差异， 且新型 DHV 均不与 DHV-1 产生交叉反应， 严重制约了养鸭业的发展。为了区分上述毒 株， 国内学者将其分别称为 “台湾新型” 、“韩国新型” 和 “血清 1 型” DHV。目前的研究发现， 血清 1 型、“台湾新型” 和 “韩国新型” 等 DHV 在进化分析中属于三个不同的基因型， 即基因 A 型 ( 血清 1 型 )、 基因 B 型 ( 台湾新型 ) 和基因 C 型 ( 韩国新型 )。迄今为止， 国内报道的 新型 DHV 毒株与 “韩国。

13、新型” DHV 的序列相似性非常高， 均为基因 C 型。除台湾外， 内陆尚未 见基因 B 型 DHV 的报道。 0003 长期以来鸭肝炎的检测一直依赖于传统的病毒分离和中和试验， 该方法费时费 力， 不适于批量样品的检测。 基于全病毒建立的ELISA方法因DHV纯化比较困难而限制了该 方法的推广应用。目前尚未见针对韩国新型鸭肝炎抗体 ELISA 检测方法的报道。VP1 作为 鸭肝炎主要的保护蛋白， 编码主要的抗原位点， 已成为研究的首选基因。因此， 利用基因工 程技术研制开发适用于韩国新型鸭肝炎抗体检测的特异的、 敏感的、 适合基层应用的 ELISA 检测试剂盒， 对于韩国新型鸭肝炎的预防和控。

14、制具有重要意义。 发明内容 0004 本发明的目的是克服传统的鸭肝炎检测方面的不足， 提供一种韩国新型鸭肝炎病 毒抗体 ELISA 检测试剂盒， 该试剂盒成本低廉、 操作简便、 快速， 尤其适合批量样品的检测， 大大提高了鸭肝炎血清学诊断的速度。 0005 本发明的目的是通过以下技术方案来实现 ： 韩国新型鸭肝炎 VP1 重组蛋白的制 备， 包括以下步骤 ： 0006 1)以韩国新型鸭肝炎病毒作为材料， 通过RT-PCR方法对其VP1基因(SEQ-1)进行 扩增、 克隆得到重组质粒 pMD-VP1 ； 扩增 VP1 基因的上下游引物分别是 ： 0007 正链引物(上游引物) ： 5 -GAAT。

15、TCGGTGATTCCAATCAGCT-3 (SEQ-3)(EcoR I位点)， 0008 负链引物(下游引物) ： 5 -CTCGAGTTCAATCTCCAGATGGA-3 (SEQ-4)(Xhol I位点)， 0009 扩增片段大小为 720bp。 0010 2)以EcoR I和Xhol I同时对重组质粒pMD-VP1和pET-32a(+)载体进行酶切， 回 收目的片段， 16连接过夜， 转化 BL21(DE3) 感受态细胞， 提取质粒， 经 EcoR I 和 Xhol I 双 酶切鉴定正确后获得阳性重组表达质粒 pET-32a(+)-VP1。 0011 3) 将阳性重组表达质粒 pET-。

16、32a(+)-VP1 及空白载体 pET-32a(+) 分别转化 说 明 书 CN 102127531 A CN 102127536 A2/7 页 5 BL21(DE3) 感受态细胞， 获得的阳性质粒菌于 37培养， 待 A600 值达到 0.4 0.6 时， 加入 IPTG 至终浓度为 0.8mmol/L 进行诱导表达， 收集诱导表达后 4h 的菌体， 超声波破碎， 离心 后取沉淀进行 SDS-PAGE 电泳和 Western blot 鉴定， 经鉴定的重组菌进行 SDS-PAGE 电泳， 电泳结束后取下凝胶， 先用双蒸水洗涤， 然后浸入 4预冷的 250mmol/L 的 KCL 溶液中显色。

17、 5 10min， 最后用双蒸水洗涤。将目的蛋白条带切下， PBS 洗涤 3 次， 用玻璃棒将其捣细， 反复冻融 3 次， 8000r/min 离心 10min， 吸取上清， SDS-PAGE 电泳进行纯度鉴定。 0012 本发明的技术方案是 ： 一种韩国新型鸭肝炎病毒抗体 ELISA 检测试剂盒， 其特征 是， 包括以韩国新型鸭肝炎 VP1 重组蛋白包被的 ELISA 板。 0013 ELISA 板的最佳制备条件为 ： 用 pH8.5 的 0.05M Tris-HCL 缓冲液作包被液， 将韩 国新型鸭肝炎 VP1 重组蛋白稀释为 25g/mL， 按 100L/ 孔加入 ELISA 反应板中，。

18、 37作 用 2 小时， 4包被过夜， 拍干， 用 1牛血清白蛋白 (BSA)37封闭 2 小时， 以含 0.05吐 温-20pH7.4的PBS洗涤， 拍干， 再加入20蔗糖磷酸盐缓冲液室温保护3小时， 待其干燥后 装入含干燥剂的包装袋中保存。 0014 本发明的进一步技术方案是 ： 一种韩国新型鸭肝炎病毒抗体 ELISA 检测试剂盒， 包括以下组分 ： 以韩国新型鸭肝炎VP1重组蛋白包被的ELISA板 ： 5块 ； 样品稀释液 ： 200mL ； 10浓缩洗涤液 ： 400mL(用前110稀释) ； 酶结合物工作液 ： 50mL ； 显色液A ： 50mL ； 显色 液 B ： 50mL ；。

19、 终止液 ： 60mL ； 阳性对照 ： 2mL ； 阴性对照 ： 2mL。 0015 上述韩国新型鸭肝炎病毒抗体 ELISA 检测试剂盒中， 样品稀释液为含 0.05吐 温 -20 的 0.05M pH7.4 的磷酸盐缓冲液 ； 10 浓缩洗液为含 0.5吐温 -20 的 0.1M pH7.4 的磷酸盐缓冲液 ； 酶结合物工作液为美国 KPL 公司生产的 HRP- 羊抗鸭 IgG ； 显色液 A 为 0.2mg/mL 的四甲基联苯胺 (TMB) 溶液， 显色液 B 为含 0.5过氧化氢尿素的柠檬酸 - 磷酸 盐缓冲液 ； 终止液为 2M 硫酸溶液 ； 阳性对照为经韩国新型鸭肝炎 VP1 重组。

20、蛋白免疫获得的 阳性血清 (OD450nm 1.0)， 加入 1000U/mL 的青链霉素， 无菌过滤 ； 阴性对照为经筛选获得的 阴性血清 (OD450nm 0.25)， 加入 1000U/mL 的青链霉素， 无菌过滤。 0016 上述韩国新型鸭肝炎病毒抗体 ELISA 检测试剂盒使用方法 ： 将待检血清用样品稀 释液作 1 100 稀释， 按 100L/ 孔加入抗体检测板中， 同时设阴性对照、 阳性对照， 37孵 育45min ； 弃去反应孔中的液体， 每孔加洗涤液350L， 洗涤35次， 每次间隔1min， 拍干 ； 每孔加100L的酶结合物工作液， 37孵育45min ； 洗涤35次，。

21、 每次间隔1min， 拍干 ； 依 次加入 50L 显色液 A 和 50L 显色液 B， 37避光孵育 15min ； 加 50L 终止液， 用酶标仪 在 450nm 波长下测定各孔吸光度 A 值， 读值计算并判定结果。其检测样本的判定标准为 ： 以 待检样本 OD450nm值与阴性对照 OD450nm值的比值 (P/N) 大于或等于 2.1， 且待检样本 OD450nm值 大于 0.228 判为阳性。 0017 本发明具有下列优点 ： 0018 1. 本发明选择原核表达载体 pET-32a(+) 构建重组表达质粒进行融合表达， 利用 其组氨酸标签进行重组蛋白的纯化， 解决了 DHV 全病毒纯。

22、化困难的问题。 0019 2. 本发明以基因工程表达的重组 VP1 蛋白为基础制备而成， 重组 VP1 蛋白为非全 病毒抗原， 安全性好， 不含无关杂蛋白， 只与韩国新型鸭肝炎病毒阳性血清特异结合， 不与 其它病毒阳性血清发生交叉反应， 具有良好抗原性， 因此所发明的检测试剂盒具有很高的 特异性和敏感性。 说 明 书 CN 102127531 A CN 102127536 A3/7 页 6 0020 3. 本发明建立的韩国新型鸭肝炎病毒抗体 ELISA 检测试剂盒， 成本低廉、 操作简 便、 快速， 尤其适合批量样品的检测， 大大提高了鸭肝炎血清学诊断的速度。 附图说明 0021 图 1 是 。

23、VP1 基 因 扩 增 的 电 泳 图 片， 其 中 1 ： 韩 国 新 型 DHV VP1 基 因， 2 ： DNA MarkerDL2000。 0022 图 2 是 VP1 基因克隆到 pMD18-T 载体得到的重组质粒 pMD-VP1 的酶切鉴定图片， 其中 1 ： DNAMarker DL2000， 2 ： 重组质粒 pMD18-VP1 的酶切片段。 0023 图 3 是 VP1 基因插入到 pET-32a(+) 载体得到的重组质粒 pET-32a(+)-VP1 的酶 切鉴定图片， 其中 1 ： DNA Marker DL2000， 2 ： 重组质粒 pET-32a(+)-VP1 的酶。

24、切片段， 3 ： DNA MarkerDL15000。 0024 图 4 是诱导表达蛋白的 SDS-PAGE 分析图片， 其中 1 ： 蛋白 Marker， 2 5 重组质粒 pET-32a(+)-vp1 分别诱导表达 1h， 2h， 3h， 4h 的沉淀， 6 ： 空载体诱导 4h 对照， 7 10 ： 重组 质粒 pET-32a(+)-vp1 分别诱导表达 1h， 2h， 3h， 4h 的上清。 0025 图 5 是韩国新型 DHVVP1 表达产物的 Western-blot 分析图片， 其中 M ： 预染蛋白 Marker， 1 ： 诱导表达蛋白， 2 ： 空载体诱导对照。 0026 图。

25、 6 是重组蛋白的纯化图片， 其中 1 ： 蛋白 Marker， 2 ： 纯化的重组蛋白， 3 ： 未纯化 重组蛋白。 具体实施方式 0027 1.VP1 基因的扩增与表达载体的构建 0028 根 据 GenBank 中 已 登 录 的 韩 国 新 型 DHV VP1 基 因 序 列 (SEQ-1)，设 计 一 对 引 物 ：上 游 引 物 ： 5 GAATTCGGTGATTCCAATCAGCT 3 (SEQ-3) ；下 游 引 物 ： 5 CTCGAGTTCAATCTCCAGATGGA 3 (SEQ-4)。利用 Trizol 试剂提取韩国新型 DHV RNA 模板。 RT反应体系(20L) 。

26、： 25mmol/L Mg2+1.2L、 10mmol/L dNTP 2.0L、 5RT缓冲液4.0L、 下游引物 1.0L、 RNA 酶抑制剂 0.5L、 RNA 模板 10.3L。置于 PCR 扩增仪进行反应， 反转录酶 1L 于 42时加入 ； 反应程序 ： 70 5min， 42 30min， 95 2min。PCR 反应体 系 (50L) ： ddH2O 38.1L、 10 缓冲液 4.0L、 25mmol/L Mg2+1.4L、 5U/L rTaqDNA 聚合酶 0.5L、 上游引物 1.0L、 RT 产物 5.0L。置于 PCR 扩增仪进行反应， 反应程序 ： 95 5min 预。

27、变性 ； 94变性 30sec、 50退火 30sec、 72延伸 30sec， 共 30 个循环 ； 72后 延伸 10min ； 4保存。PCR 产物在 1琼脂糖凝胶中电泳， 以确定产物大小 ( 如图 1 所示 )。 将扩增出的 VP1 基因克隆至 pMD18-T 载体中， 经 EcoR I 和 Xhol I 双酶切鉴定、 测序正确的 阳性克隆命名为 pMD-VP1( 如图 2 所示 )。以 EcoRI 和 Xhol I 同时对重组质粒 pMD-VP1 和 pET-32a(+) 载体进行酶切， 回收目的片段， 16连接过夜， 转化 BL21(DE3) 感受态细胞， 提 取质粒， 经 Eco。

28、R I 和 Xhol I 双酶切鉴定、 测序正确的阳性克隆命名为 pET-32a(+)-VP1( 如 图 3 所示 )。 0029 2. 重组表达质粒的诱导表达 0030 将 阳 性 重 组 表 达 质 粒 pET-32a(+)-VP1 及 空 白 载 体 pET-32a(+) 分 别 转 化 BL21(DE3) 感受态细胞。阳性质粒菌于 37培养， 待 A600 值达到 0.4 0.6 时， 加入 IPTG 说 明 书 CN 102127531 A CN 102127536 A4/7 页 7 至终浓度为0.8mmol/L， 进行诱导表达。 收集不同诱导时间表达的菌体， 超声波破碎， 离心后 。

29、分别取上清和沉淀进行SDS-PAGE电泳， 并对表达产物进行Western blot分析， 一抗用鸡抗 韩国新型 DHV 阳性血清， 二抗用辣根过氧化物酶 (HRP) 标记的羊抗鸡 IgG， DAB 显色。结果 表明重组蛋白以不溶性包涵体形式存在于菌体中， 分子量约为 47ku， 与预期结果相符， 以诱 导后 4h 表达量最大 ( 如图 4 所示 )。Western-blot 分析发现， 表达的重组蛋白能够与韩国 新型鸭肝炎阳性血清进行反应， 具有良好的免疫学活性 ( 如图 5 所示 )。 0031 3. 重组蛋白的纯化 0032 选用KCL显色法 ： 将破碎好的重组菌进行SDS-PAGE电泳。

30、， 电泳结束后取下凝胶， 先 用双蒸水洗涤， 然后浸入 4预冷的 250mmol/L 的 KCL 溶液中显色 5-10min， 最后用双蒸水 洗涤。将目的蛋白条带切下， PBS 洗涤 3 次， 用玻璃棒将其捣细， 反复冻融 3 次， 8000r/min 离心 10min， 吸取上清， SDS-PAGE 电泳进行纯度鉴定。结果只有一条 47ku 的目的蛋白条带， 表明 KCL 显色法获得了较纯的目的蛋白 ( 如图 6 所示 )。 0033 4. 样品稀释液、 洗涤液、 终止液的配制 0034 样品稀释液为含 0.05吐温 -20 的 0.01M pH7.4 磷酸盐缓冲液 (KH2PO40.2g，。

31、 NaHPO4 12H2O 2.9g， NaCL 8g， 定容至 1000mL， 再加 0.5mL 吐温 -20) ； 10 浓缩洗涤液为含 0.5吐温 -20 的 0.1M pH7.4 磷酸盐缓冲液 (KH2PO42g， NaHPO412H2O 29g， NaCL 80g， 定容 至 1000mL， 再加 5mL 吐温 -20) ； 终止液为 2M 硫酸溶液 ( 取 111.2mL 浓硫酸即 18M， 稀释定 容至 1000mL)。 0035 5. 阳性对照和阴性对照的制备 0036 将用韩国新型鸭肝炎 VP1 重组蛋白免疫获得的阳性血清用样品稀释液作 1 100 稀释 (OD450nm 1。

32、.0)， 加入 1000U/mL 的青链霉素， 无菌过滤， 作为韩国新型鸭肝炎抗体间接 ELISA 检测试剂盒中的阳性对照 ； 将筛选获得的阴性血清 (OD450nm 0.25)， 加入 1000U/mL 的青链霉素， 无菌过滤， 作为韩国新型鸭肝炎抗体间接 ELISA 检测试剂盒中的阴性对照。 0037 6. 显色液的配制 0038 显色液 A ： 称取 200mg 四甲基联苯胺 (TMB)， 用 100mL 无水乙醇或 DMSO 溶解后， 以双蒸水定容至 1000mL ； 显色液 B ： 称取 21g 柠檬酸 (C6H8O7H2O)， 28.2g 无水磷酸氢二钠 (Na2HPO4)， 6.。

33、4mL 0.75过氧化氢尿素， 双蒸水定容至 1000mL， 调 pH 值 4.5 5.0。 0039 7. 检测新型鸭肝炎抗体的间接 ELISA 反应条件的确定 0040 抗原和血清最佳工作浓度的确定 ： 采用方阵试验确定。用包被缓冲液将 VP1 重 组蛋白作 1 10， 1 20， 1 40， 1 80 等系列稀释， 包被 ELISA 反应板， 100L/ 孔 ； 韩 国新型 DHV 阳性血清和阴性血清用样品稀释液分别作 1 25， 1 50， 1 100， 1 200， 1 400， 1 800 等系列稀释 ； 进行间接 ELISA 测定。显色液显色， 终止液终止反应 ； 测定 光波长 。

34、450nm 的 OD 值。取阳性血清 OD450nm1.0 左右， 阴性血清 OD450nm0.2 左右， 且阳性血清 OD450nm/ 阴性血清 OD450nm即 P/N 值大于 2.1 的抗原浓度和血清稀释度为最佳工作浓度， 结果 如表 1 所示， 结果表明血清最佳稀释度为 1 100， 抗原最佳浓度 25g/mL。 0041 表 1 抗原和血清最佳工作浓度的确定 (OD450nm值 ) 0042 说 明 书 CN 102127531 A CN 102127536 A5/7 页 8 0043 0044 8. 结果判定标准 0045 将收集的 40 份无韩国新型 DHV 抗体的鸭血清， 在最。

35、佳工作条件下进行间接 ELISA 测定， 以确定鸭血清在无韩国新型 DHV 感染时其吸收值范围 (X3SD 0.20130.009 0.228)， 因此确定以待检样本 OD450nm值与阴性 OD450nm值的比值 (P/N) 大于或等于 2.1， 且 待检样本 OD450nm值大于 0.228 判为阳性。 0046 9. 韩国新型鸭肝炎抗体检测 ELISA 板的制备 0047 用 pH8.5 的 0.05M Tris-HCL 缓冲液作包被液， 将韩国新型鸭肝炎 VP1 重组蛋白稀 释为25g/mL， 按100L/孔加入ELISA反应板中， 37作用2小时， 4包被过夜， 拍干， 用 1牛血清。

36、白蛋白 (BSA)37封闭 2 小时， 以含 0.05吐温 -20pH7.4 的 PBS 洗涤， 拍干， 再 加入 20蔗糖磷酸盐缓冲液室温保护 3 小时， 待其干燥后装入含干燥剂的包装袋中备用。 0048 10.ELISA 操作程序的确定 0049 按以上确定的优化条件进行操作， 即得到本方法的最佳操作程序 ： 0050 将待检血清用样品稀释液作 1 100 稀释， 按 100L/ 孔加入抗体检测板中， 同时 设阴性对照、 阳性对照， 37孵育 45min ； 弃去反应孔中的液体， 每孔加洗涤液 350L， 洗涤 3 5 次， 每次间隔 1min， 拍干 ； 每孔加 100L 的酶结合物工作。

37、液， 37孵育 45min ； 洗涤 3 5 次， 每次间隔 1min， 拍干 ； 依次加入 50L 显色液 A 和 50L 显色液 B， 37避光孵育 15min ； 加50L终止液， 用酶标仪在450nm波长下测定各孔吸光度A值， 读值计算并判定结 果。 说 明 书 CN 102127531 A CN 102127536 A6/7 页 9 0051 实施例 ： 0052 一、 韩国新型鸭肝炎抗体 ELISA 检测试剂盒， 包括以下组分 ： 0053 1)ELISA 板条 (96 孔 ) ： 5 块 0054 2)10 浓缩洗涤液 ： 400mL( 用前 1 10 稀释 ) 0055 3) 。

38、样品稀释液 ： 200mL 0056 4) 羊抗鸭酶标二抗 ( 酶结合物工作液 ) ： 50mL 0057 5) 显色液 A ： 50mL 0058 6) 显色液 B ： 50mL 0059 7) 终止液 ： 60mL 0060 8) 阳性血清对照 (+) ： 2mL 0061 9) 阴性血清对照 (-) ： 2mL 0062 二、 操作步骤 ： 0063 1、 将待检血清用样品稀释液作 1 100 稀释， 按 100L/ 孔加入抗体检测板中， 同 时设阴性血清对照、 阳性血清对照， 37孵育 45min ； 0064 2、 弃去反应孔中的液体， 每孔加洗涤液 350L， 洗涤 3 5 次， 。

39、每次间隔 1min， 拍 干 ； 0065 3、 每孔加 100L 的酶结合物工作液， 37孵育 45min ； 0066 4、 重复步骤 2 ； 0067 5、 依次加入 50L 显色液 A 和 50L 显色液 B， 37避光孵育 15min ； 0068 6、 加 50L 终止液， 用酶标仪在 450nm 波长下测定各孔吸光度 A 值， 读值计算并判 定结果。 0069 三、 应用 0070 1、 特异性试验 0071 11 交叉试验 ： 用 VP1 重组蛋白建立的间接 ELISA 检测试剂盒分别检测鸭瘟、 番鸭 细小病毒病、 鸭新城疫、 鸭流感、 传统1型鸭肝炎(基因A型)、 韩国新型鸭。

40、肝炎(基因C型) 等阳性血清及韩国新型鸭肝炎阴性血清， 每样本 4 个重复， 进行交叉反应性测定， 检测结果 显示韩国新型鸭肝炎阳性血清为阳性结果， 其余均为阴性， 表明该检测试剂盒与上述病毒 无交叉反应 ； 0072 1.2 阻抑试验 ： 将韩国新型鸭肝炎阳性血清分别与等体积的韩国新型鸭肝炎病毒 (200TCID50/0.2ml) 和鸭瘟病毒 (200TCID50/0.2ml) 混合， 室温作用 30min， 将处理后的血清 与未作任何处理的血清分别按最佳反应条件进行阻抑试验测定， 结果表明韩国新型鸭肝炎 阳性血清只能被韩国新型鸭肝炎病毒特异性阻抑， 而不能被鸭瘟病毒阻抑。 0073 2、 。

41、敏感性试验 0074 10 份韩国新型鸭肝炎阳性血清分别从 1 2 开始倍比稀释， 其余条件按最佳反应 条件进行 ELISA 检测， 同时用病毒中和试验 (VN) 对其终点滴度进行测定。结果表明， ELISA 检测试剂盒的敏感性要明显高于中和试验 ( 如表 2 所示 )， 二者的相关系数为 0.985。 0075 表 2 敏感性试验 0076 说 明 书 CN 102127531 A CN 102127536 A7/7 页 10 0077 3、 重复性试验 0078 用两次包被的酶标板， 检测5份韩国新型鸭肝炎阳性血清和5份阴性血清， 每个样 品重复检测 5 次， 测定其变异系数 CV (CV。

42、 S.D./X100， S.D. ： 标准差， X ： 算术平均 值 )。结果表明变异系数最大为 5.12， 最小为 1.0。10 份血清变异系数都较小， 具有较 好的重复性。 0079 4、 临床应用 0080 临床应用检验的样品为试验样品 10 份和部分送检的样品 60 份。应用 ELISA 检测 试剂盒和血清中和试验 (VN) 同时检测送检样品， 比较两种方法的符合率。其中 ELISA 检测 试剂盒检出阳性血清为 30 份， 阳性检出率为 42.9， 中和试验检出阳性血清 29 份， 阳性检 出率为 41.4， 两种方法的符合率为 98.6 ( 如表 3 所示 )。 0081 表 3EL。

43、ISA 检测试剂盒与中和试验比较 0082 0083 注 ： 检出符合率 ( 共同阳性数 + 共同阴性数 )/ 总样品数 100 说 明 书 CN 102127531 A CN 102127536 A1/4 页 11 0001 0002 序 列 表 CN 102127531 A CN 102127536 A2/4 页 12 0003 序 列 表 CN 102127531 A CN 102127536 A3/4 页 13 0004 序 列 表 CN 102127531 A CN 102127536 A4/4 页 14 序 列 表 CN 102127531 A CN 102127536 A1/2 页 15 图 1 图 2 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 102127531 A CN 102127536 A2/2 页 16 图 5 图 6 说 明 书 附 图 CN 102127531 A 。