一种甘油三酯水解酶基因有效 shRNA 的筛选方法 【技术领域】
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种甘油三酯水解酶基因有效 shRNA 的筛 选方法。背景技术
RNA 干扰是通过双链 RNA(dsRNA) 介导的遗传干涉现象，它能够特异、有效地 降解 mRNA，从而引起基因的沉默。 自 2001 年 《Nature》 杂志上首次报道在哺乳动物 细胞中通过 siRNA 成功诱导了靶基因的特异性表达沉默后， RNA 干扰技术就开始作为一 项特异性基因沉默工具在哺乳动物细胞上广泛应用。 2003 年 Rubinson 等报道用病毒系统 在原代培养的细胞、干细胞及转基因小鼠上都取得了 RNA 干扰成功，更大大扩展了这项 技术的应用范围。 目前，RNAi 已发展成为调控生物基因表达的遗传学工具，广泛应用于 功能依赖性遗传筛选、基因功能研究等后基因组计划研究中，并有望成为潜在的基因治 疗工具。 甘油三酯 (TG) 是脂肪的主要存在形式，其水解过程是机体主要的能量来源。 2004 年，来自于三个不同的实验室的 Zimmermann， Jenk ins 和 Villena 等人，同时发现 了一种性质相似的脂肪酶，分别命名为 ：adiposetriglyceride lipas e(ATGL)， desnutrin 和 phospholipase A2ξ(iPLA2ξ)，经结构和功能研究表明这三种蛋白实为一种脂肪酶，并 将其统一命名为甘油三酯水解酶 (adipose triglyceride lipase，ATGL)。Zimmermann 等对不 同物种的 ATGL 进行研究发现，其氨基酸序列中都存在一个 GXSXG( 氨基乙酸 -X- 丝氨 酸 -X- 氨基乙酸 ) 模序，并且其中间的丝氨酸位点与 ATGL 的活性有关。 此外，在 ATGL 的 N 端还发现一个 α/β 折叠区域 (COG1752) 和一个 Patatin 结构域 (Pfam01734)，这些 结构都是与脂肪酶活性密切相关的保守性区域。 对 ATGL 缺陷型小鼠的研究发现，体内 脂肪组织含量明显提高，并且在多个组织中表现出甘油三酯堆积的现象 ；同时，心脏由 于堆积过量脂质，引起心脏功能紊乱，并最终导致死亡。
在动物细胞中应用 RNA 干扰技术的另一关键在于有效 siRNA 序列的筛选。 但 是截至目前，筛选有效的 RNAi 的序列继而构建其腺病毒载体，尚属空白。
因此，现有技术存在缺陷，需要改进完善。
发明内容 本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种甘油三酯水解酶 基因有效 shRNA 的筛选方法。
本 发 明 的 方 法 包 括 以 下 步 骤 ：A1 ：编 码 目 的 shRNA 的 单 链 DNA 寡 核 苷 酸 片 段 的 设 计、 合 成 ；A2 ：pENTR/CMV-GFP/U6-shRNA 载 体 的 构 建 ；A3 ： pDsRed1-C1-ATGL 载体的构建 ；A4 ：shRNA 有效序列的筛选。
所述的方法，其中优选的，所述步骤 A1 具体执行以下操作 ：根据本实验室克隆 得到的西农萨能羊 ATGL 序列，设计三条 ATGL-siRNA 及 1 条阴性对照序列，在 siRNA
基础上，将 19bp 的寡核苷酸以正反向组合，中间添加 GAGTACTG 的发夹环序列间隔， 使寡核苷酸内部形成发夹结构，每对寡核苷酸两端分别带有 BamH I 和 Xho I 酶切位点， 其中正义链的 3’ 端添加 TTTTTT 终止信号，得到 shRNA 的正、反义链模板。
所述的方法，其中优选的，所述步骤 A2 具体执行以下操作 ：A21 ：单链寡核苷 酸退火反应生成双链 ；将合成的单链寡核苷酸序列用灭菌无离子水溶解成浓度为 200μM 的溶液，然后进行退火反应，退火条件是 ：95℃ ×4 分钟，取出置室温逐渐冷却，即获 得浓度为 50μM 的双链寡核苷酸序列，分别标记为 ：ds422、 ds600、 ds1148 ；再分别取 少量稀释成浓度为 5nM 的工作浓度，A22 ：连接反应 - 构建穿梭载体 ；用 BamH I 及 Xho I 双酶切 pRNTR/CMV-GFP/U6 载体并切胶回收，然后将所述 ds422、所述 ds600 和所述 ds 1148 分别与 pRNTR/CMV-GFP/U6 载体酶切回收产物连接反应，反应条件为 4℃连接 过夜，得到连接产物 ；A23 ：连接产物转化 ；取 10μL 所述连接产物加入 100μL 感受 态 DH5α 细菌，冰浴 30 分钟，42 ℃热激 90 秒，置冰浴 12 分钟，加入 600μL LB 培养 液，37℃温和震荡培养 45 分钟，将细菌涂布于含 50μg/mL 卡那霉素的琼脂平板上，置 于 37℃温箱孵育 ；A24 ：筛选穿梭载体克隆。
所述的方法，其中优选的，所述连接反应体系为如下 ：pENTRTM/U6，2μL ； ds oligos(5nM)，1μL ；5× 退 火 缓 冲 液，4μL ；T4DNA 连 接 酶，1μL ；不 含 DNase/ Rnase 的水，12μL ；总体积 20.0μL。
所述的方法，其中优选的，所述步骤 A24 具体执行以下操作 ：(1) 穿梭载体克隆 的质粒酶切鉴定 ：ds oligos 的黏性末端与试剂盒提供的线性载体 pENTRTM/U6 的黏性末 端互补，经连接反应后，形成环形质粒 ；于卡那霉素琼脂平板上挑取单克隆菌落，转种 于 4mL 的含 50μg/mL 卡那霉素的 LB 培养液中，37℃振荡培养 12-16 小时，取菌液 2mL 提取质粒，大小符合的再进行 Sca I 及 EcoR V 双酶切鉴定，产物以 1.2％的琼脂糖凝胶电 泳观察 ；(2) 穿梭载体克隆的测序鉴定 ：取 (1) 中双酶切鉴定正确的单克隆菌液，送南京 金思瑞生物技术有限公司以 ABI377 型 DNA 自动荧光序列分析仪进行序列测定，引物为 测序引物 U6 或 M13。
所 述 的 方 法， 其 中 优 选 的， 所 述 步 骤 A3 具 体 执 行 以 下 操 作 ：A31 ：构 建 pDsRed1-C1-ATGL 克隆载体 ；将回收的目的基因片段与 pGM-T 载体连接，16℃保温过 夜，连接产物转化感受态 E.coliDH5α 菌株，涂布于含氨苄青霉素和 X-gal/I PTG 的 LB 培 养平皿中，于 37℃培养过夜，挑取白色单菌落摇菌，同时进行菌落 PCR，反应结束后取 10μL 反应液进行 1％琼脂糖凝胶电泳鉴定 ；将阳性克隆菌液利用碱裂解法抽提质粒，然 后用 Xho I 和 Sal I 内切酶进行双酶切鉴定，酶切反应体系如下 ：10×H Buffer，2.0μL ； Xho I，0.7μL ；Sal I，0.7μL ；pGM-T-gATGL1A1，10.0μL ；ddH2O，6.6μL ； 总 体 积 20.0μL ；37℃水浴反应过夜，取全部反应液在 1％琼脂糖凝胶上电泳，回收带有设计 酶切位点的目的基因片段 ；A32 ：构建 pDsRed1-C1-ATGL 表达载体。
所 述 的 方 法， 其 中 优 选 的， 所 述 步 骤 A 32 具 体 执 行 以 下 操 作 ：(1) 配 制 pDsRed1-C1 酶切反应体系并进行 37℃水浴反应过夜 ；(2) 酶切反应结束后，取全部反应 液进行 1％琼脂糖凝胶电泳，回收 pDsRed1-C1 载体酶切后的线性化片段 ；(3) 将载体片 段与目的基因片段连接，16℃反应过夜 ；(4) 将 pDsRed1-C1-ATGL 转化至 E.coli DH5α 感受态细胞，涂布含卡那霉素的平皿，37℃孵育过夜，挑取单菌落摇菌，同时进行菌落PCR 鉴定，然后提取质粒，进行酶切鉴定。
所述的方法，其中优选的，所述酶切反应体系为 ：10×H Buffer，2.0μL ；Xho I，0.7μL ；Sal I，0.7μL ；pDsRed1-C1-ATGL，5.0μL ；ddH2O，11.6μL ； 总 体 积 20.0μL。
所述的方法，其中优选的，所述步骤 A4 具体执行以下操作 ：A41 ：去内毒素质 粒提取 ；A42 ：细胞的复苏 ；A43 细胞传代培养 ：A44 ：细胞转染。
所述的方法，其中优选的，所述步骤 A41 具体执行以下操作 ：(1) 柱平衡 ：向 吸附柱中加入 500μL 的平衡液，吸附柱放入收集管中，12000rpm(13400×g) 离心 1 分 钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中 ；(2) 取 5-15mL 过夜培养的菌液 加入离心管中，12000rpm(13400×g) 离心 1 分钟，吸除上清液 ；(3) 向留有菌体沉淀的 离心管中加入 500μL 已加入 RNaseA 的溶液 P1，使用涡旋振荡器彻底悬浮细菌细胞沉 淀 ；(4) 向离心管中加入 500μL 溶液 P2，温和地上下翻转 6-8 次使菌体充分裂解 ；(5) 向离心管中加入 700μL 溶液 P3，立即温和地上下翻转 6-8 次，充分混匀，出现白色絮 状沉淀，12000rpm(13400×g) 离心 10 分钟，在离心管底部形成沉淀，收集上清液 ；(6) 将 (5) 中收集的上清液分次加入过滤柱，过滤柱放入收集管中，12000rpm(13400×g) 离 心 2 分钟，将离心后收集管中得到的溶液分次加入吸附柱中 ；(7)12000rpm(13400×g) 离 心 1 分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中 ；(8) 向吸附柱中加入 500μl 去 蛋白液，12000rpm(13400×g) 离心 1 分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管 中 ；(9) 按照 3 倍体积向漂洗液中加入无水乙醇，向吸附柱中加入 700μL 所述漂洗液， 12000rpm(13400×g) 离心 1 分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中 ；(10) 向吸附柱中加入 500μL 漂洗液，12000rpm(13400×g) 离心 1 分钟，倒掉收集管中的废 液 ；(11) 将吸附柱重新放回收集管中置于 12000rpm(13400×g) 离心 2 分钟，将吸附柱中 残余的漂洗液去除 ；(12) 将吸附柱置于一干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴 加 100-300μL 洗脱缓冲液，室温放置 2 分钟，12000rpm(13400×g) 离心 1 分钟后将质粒 溶液收集到离心管中。
所述的方法，其中优选的，所述步骤 A42 具体执行以下操作 ：(1) 从液氮罐中取 出 1 支冻存的 HEK293 细胞，立即放入 38℃水浴锅中，至细胞完全融化 ；(2) 将冻存管内 容物转入 10mL 离心管中，加入 4mL 含 10％ FBS 的 DMEM，洗脱冻存时加入的 DMSO ； (3)1400rpm，离心 10 分钟，弃掉上清液 ；(4) 加入 2.0mL 含 10％ FBS 的 DMEM，吹匀， 转移入塑料培养瓶中，在所述离心管中再次加入 2.0mL 含 10 ％ FBS 的 DMEM，吹匀， 将残余细胞转入所述塑料培养瓶中 ；(5) 拧松培养瓶瓶盖，置 37℃，5％ CO2 培养箱中培 养。
所述的方法，其中优选的，所述步骤 A43 具体执行以下操作 ：(1) 将培养瓶内培 养基吸弃，加入 1mL 培养基清洗后吸弃，以除去血清 ；(2) 加入 1mL 0.25％的 ATV，置 于镜下观察，当细胞饱满后吸弃 ATV ；(3) 加入 2mL 含 10％ FBS 的 DMEM，吹打贴壁 细胞，使细胞均匀分散，将细胞悬液分装至 2-3 个新培养瓶中，置 37℃，5％ CO2 培养箱 培养。
所 述 的 方 法， 其 中 优 选 的， 所 述 步 骤 A44 具 体 执 行 以 下 操 作 ：将 低 血 清 Opti-MEM 培 养 液 及 LipofectamineTM2000 于 室 温 条 件 下 平 衡 ；按 2 ∶ 1 比 例 将LipofectamineTM2000 及质粒分别加入 250μL 低血清 Opti-MEM 中，轻弹管壁使混匀，室 温静置 5min，将质粒 DNA/ 低血清 Opti-MEM 混合物加入 LipofectamineTM2000 低血清 Opti-MEM 混合物中，轻弹管壁使之混匀，室温孵育 20min ；将转染复合物均匀、缓慢地 加入细胞培养皿中，轻旋培养皿混匀液体，将细胞放入 37℃细胞培养箱孵育。
本发明在构建重组腺病载体之前先在 HEK 293 细胞中验证所设计序列的干扰 效果，以节省时间及成本，将干扰载体及靶基因表达载体分别用绿色荧光和红色荧光标 记，共转染 HEK 293 细胞，通过在荧光显微镜下观察绿色荧光及红色荧光的强度就可以 判断干扰载体的转染效率及靶基因的干扰效率，由于采用红光和绿光两种不同荧光分别 标记干扰载体及靶基因，使得干扰序列筛选过程省时高效，结果更直观可靠，而且可以 同时筛选多条序列。 附图说明
图 1 为 pRNTR/CMV-GFP/U6-shRNA 质粒凝胶电泳分析
图 2 为 pRNTR/CMV-GFP/U6-shRNA 酶切鉴定
图 3 为 pGM-T-ATGL 双酶切鉴定 图 4 为 pDsRed1-C1-ATGL 阳性转化子的 PCR 鉴定 ；
图 5 为 pDsRed1-C1-ATGL 酶切鉴定 ；
图 6 为 RNA 干扰序列的筛选 (200×)，其中 A 组、 B 组、 C 组、 D 组分别为 shRNA-NC、 shRNA-422、 shRNA-1148、 shRNA-600 序 列 的 干 扰 效 果 检 测 ；1(A1、 B1、 C1、 D1)、2(A2、 B2、 C2、 D2) 分 别 为 pENTR/CMV-GFP/U6-shRNA 干 扰 载体与 pDsRed1-C1-ATGL 靶基因表达载体共转染 HEK 293 细胞 48 小时后荧光显微 镜 下 绿 色 荧 光 及 红 色 荧 光 表 达 情 况 ；3(A3、 B3、 C3、 D3) 为 对 照 组， 即 单 独 转 染 pDsRed1-C1-ATGL 靶基因表达载体 48 小时后荧光显微镜下红色荧光表达情况。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例，对本发明进行详细说明。
第一步 ：编码目的 shRNA 的单链 DNA 寡核苷酸片段的设计、合成 ；
根 据 本 实 验 室 克 隆 得 到 的 西 农 萨 能 羊 ATGL 序 列， 利 用 在 线 siRNA 选 择 程 序 (http://jura.wi.mit.edu/bioc/siRNAext/home.php) 设 计 三 条 ATGL-siRNA 及 1 条 阴 性 对 照 序 列， 即 s i RNA-422 ：TCCGGAGCTGCCTGCTGAA(SEQID NO ： 1) ；siRNA -600 ：CCTCATCCCCCCTTCCTTC ( SEQ ID NO ：2) ；siRNA -1148 ： CCACGGCCATGATGGTGCC ( SEQ I D NO ：3) ； 阴 性 对 照 siRNA - NC ： ACTACCGTTGTTATAGGTG(SEQ ID NO ：4)。 在 siRNA 基础上，将 19bp 的寡核苷酸以 正反向组合，中间添加 GAGTACTG( 含 Sca I 酶切位点，以便载体构建中进行鉴定 ) 的发 夹环序列间隔，使寡核苷酸内部可形成发夹结构，每对寡核苷酸两端分别带有 BamH I 和 Xho I 酶切位点，其中正义链的 3’端添加 TTTTTT 终止信号，即得到 shRNA 的正、反义 链模板，见表 1 ：
表 1ATGL 特异的编码 shRNA 的寡核苷酸序列
第二步 ：pENTR/CMV-GFP/U6-shRNA 载体的构建 ；
2.1 单链寡核苷酸退火反应生成双链 ；
先将合成的单链寡核苷酸序列用灭菌无离子水溶解成浓度为 200μM 的溶液， 然后进行退火反应，退火反应体系为 ：退火条件是 ：95 ℃ ×4min，取出置室温逐渐冷 却，即获得浓度为 50μM 的双链寡核苷酸序列 (dsoligos)，分别标记为 ：ds422、ds600、 ds1148。 再分别取少量稀释成浓度为 5nM 的工作浓度，为进行连接反应准备，其余 置 -20℃保存。
200μM 正义链 5μL
200μM 反义链 5μL
10× 退火缓冲液 2μL
不含 DNase/Rnase 的水 8μL
总体积 20.0μL
2.2 连接反应 - 构建穿梭载体
用 BamH I 及 Xho I 双酶切 pRNTR/CMV-GFP/U6 载体并切胶回收，然后将退火 产物浓度为 5nM 的 ds422、 ds600、 ds1148 分别与 pRNTR/CMV-GFP/U6 载体酶切回收 产物连接，连接反应体系为如下 ：
pENTRTM/U6 2μL dsoligos(5nM) 1μL 5× 退火缓冲液 4μL T4DNA 连接酶 1μL 不含 DNase/Rnase 的水 12μL总体积 20.0μL
反应条件为 4℃连接过夜，之后进行转化或置 -20℃保存。
2.3 连接产物转化
取 10μL 连接产物加入 100μL 感受态 DH5α 细菌，冰浴 30 分钟，42℃热激 90 秒，快速置冰浴 1-2 分钟，加入 600μL LB 培养液，37℃温和震荡培养 45 分钟。 将细菌 涂布于含 50μg/mL 卡那霉素的琼脂平板上，置于 37℃温箱孵育。
2.4 筛选穿梭载体克隆
(1) 穿梭载体克隆的质粒酶切鉴定
ds oligos 的黏性末端与试剂盒提供的线性载体 pENTRTM/U6 的黏性末端互补， 经连接反应后，形成环形质粒。 于卡那霉素琼脂平板上挑取单克隆菌落，转种于 4mL 的 含 50μg/mL 卡那霉素的 LB 培养液中，37 ℃振荡培养 12-16 小时，取菌液 2mL 提取质 粒，大小符合的再进行 Sca I 及 EcoR V 双酶切鉴定，产物以 1.2 ％的琼脂糖凝胶电泳观 察。
(2) 穿梭载体克隆的测序鉴定
取双酶切鉴定正确的单克隆菌液，送南京金思瑞生物技术有限公司以 ABI 377 型 DNA 自动荧光序列分析仪进行序列测定，引物为测序引物 U6( 或 M13)。
第三步 ：pDsRed1-C1-ATGL 载体的构建
3.1 构建 pDsRed1-C1-ATGL 克隆载体
将回收的目的基因片段与 pGM-T 载体连接，16℃保温过夜，连接产物转化感受 态 E.coliDH5α 菌株，涂布于含氨苄青霉素和 X-gal/IPTG 的 LB 培养平皿中，于 37℃培 养过夜，挑取白色单菌落摇菌，同时进行菌落 PCR，反应结束后取 10μL 反应液进行 1％ 琼脂糖凝胶电泳鉴定。 将阳性克隆菌液利用碱裂解法抽提质粒，然后用 Xho I 和 Sal I 内 切酶进行双酶切鉴定，酶切反应体系如下 ：
10×H Buffer 2.0μL
Xho I 0.7μL
Sal I 0.7μL
pGEM-T-gATGL1A1 10.0μL
ddH2O 6.6μL
Total 20.0μL
37℃水浴反应过夜，取全部反应液在 1％琼脂糖凝胶上电泳，回收带有设计酶切 位点的目的基因片段。
3.2 构建 pDsRed1-C1-ATGL 表达载体
由于目的基因片段两端带有 Xho I 与 Sal I 内切酶酶切位点，将 pDsRed1-C1 进行 同样的双酶切反应，回收载体片段并与基因片段连接。
(1) 配制 pDsRed1-C1 酶切反应体系并进行 37℃水浴反应过夜 ；
10×H Buffer 2.0μL
Xho I 0.7μL
Sal I 0.7μL
pDsRed1-C1 5.0μL
ddH2O 11.6μL
总体积 20.0μL
(2) 酶 切 反 应 结 束 后， 取 全 部 反 应 液 进 行 1 ％ 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳， 回 收 pDsRed1-C1 载体酶切后的线性化片段 ；
(3) 将载体片段与目的基因片段连接，16℃反应过夜 ；
(4) 将 pDsRed1-C1-ATGL 转化至 E.coli DH5α 感受态细胞，涂布含卡那霉素的 平皿，37℃孵育过夜，挑取单菌落摇菌，同时进行菌落 PCR 鉴定，然后提取质粒，进行 酶切鉴定，酶切反应体系如上所述。
第四步 ：shRNA 有效序列的筛选 ；
4.1 挑取 pDsRed1-C1-ATGL 阳性单克隆及 4 个 pRNTR/CMV-GFP/U6-shRNA 干扰载体 ( 包括阴性对照 ) 分别接种于 4mL LB 培养基中 (10μg/mL kan)，37℃、200rpm 摇菌过夜，按 1 ∶ 50 比例转摇至 10mL LB 培养基中，37℃、230rpm 摇菌 16h，提取去内 毒素质粒。 具体操作步骤如下 ：
溶液 P1 在使用前先加入 RNa seA，混匀，置于 2-8℃保存，第一次使用前应按照 试剂瓶标签的说明先在漂洗液中加入无水乙醇。
(1) 柱平衡步骤 ：向吸附柱中加入 500μL 的平衡液，吸附柱放入收集管中， 12000rpm(13400×g) 离心 1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中，尽 量使用当天处理过的柱子。
(2) 取 5-15mL 过夜培养的菌液加入离心管中，12000rpm(13400×g) 离心 1min， 尽量吸除上清 ；优选的，菌液较多时可以通过几次离心将菌体沉淀收集到一个离心管 中，菌体量以能够充分裂解为佳，过多的菌体裂解不充分会降低质粒的提取效率 ；
(3) 溶液 P1 中加入 RNaseA，向留有菌体沉淀的离心管中加入 500μL 溶液 P1， 使用涡旋振荡器彻底悬浮细菌细胞沉淀 ；
注意 ：务必彻底悬浮细菌沉淀，如果有未彻底混匀的菌块，会影响裂解，导致 提取量和纯度偏低 ；
(4) 向离心管中加入 500μL 溶液 P2，温和地上下翻转 6-8 次使菌体充分裂解。 需要指出的是注意，上述步骤中要温和地混合，不要剧烈震荡，以免污染基因组 DNA ； 此时菌液应变得清亮粘稠，所用时间不应超过 5min，以免质粒受到破坏 ；如果未变得清 亮，可能由于菌体过多，裂解不彻底，应减少菌体量 ；
(5) 向离心管中加入 700μL 溶液 P3，立即温和地上下翻转 6-8 次，充分混匀， 此时会出现白色絮状沉淀，12000rpm(13400×g) 离心 10min，此时在离心管底部形成沉
淀。 需要注意 ：P3 加入后应立即混合，避免产生局部沉淀 ；如果上清中还有微小白色沉 淀，可再次离心后取上清 ；
(6) 将 上 一 步 收 集 的 上 清 液 分 次 加 入 过 滤 柱， 过 滤 柱 放 入 收 集 管 中， 12000rpm(13400×g) 离心 2min，小心地将离心后收集管中得到的溶液分次加入吸附柱 中，吸附柱放入收集管中，另外，如果过滤柱中有残余的液体说明步骤 (5) 吸取的上清 中杂质过多，可以延长离心的时间 ；如果离心后收集管底部有少量的沉淀，尽量地吸取 上清 ；
(7)12000rpm(13400×g) 离心 1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集 管中 ；
(8) 向吸附柱中加入 500μl 去蛋白液，12,000rpm(13400×g) 离心 1min，倒掉收 集管中的废液，将吸附柱放入收集管中 ；
(9) 向吸附柱中加入 700μL 漂洗液，漂洗液使用前应按照 3 倍体积加入无水乙 醇，12000rpm(13400×g) 离心 1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中 ；优 选的，加入漂洗液后，室温静置 2-5min，可更好地去除杂质 ；
(10) 向吸附柱中加入 500μL 漂洗液，12000rpm(13400×g) 离心 1min，倒掉收 集管中的废液 ； (11) 将吸附柱重新放回收集管中置于 12000rpm(13400×g) 离心 2min，目的是 将吸附柱中残余的漂洗液去除。 优选的，漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应 ( 酶 切、 PCR 等 ) 实验，为确保下游实验不受残留乙醇的影响，将吸附柱开盖，置于室温放 置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液 ；
(12) 将 吸 附 柱 置 于 一 个 干 净 的 离 心 管 中， 向 吸 附 膜 的 中 间 部 位 悬 空 滴 加 100-300μL 洗脱缓冲液，室温放置 2min，12000rpm(13400×g) 离心 1min 后将质粒溶液 收集到离心管中 ；优选的，为了增加质粒的回收效率，可将得到的溶液重新加入离心吸 附柱中，重复步骤 (12) ；洗脱液的 pH 值对于洗脱效率有很大影响 ；若用水做洗脱液， 应保证其 pH 值在 7.0-8.5 范围内， pH 值低于 7.0 会降低洗脱效率 ；洗脱缓冲液体积不应 少于 100μL，体积过小影响回收效率，且 DNA 产物应保存在 -20℃，防止降解。
4.2 细胞的复苏 ；
(1) 从液氮罐中取出 1 支冻存的 HEK293 细胞，立即放入 38℃水浴锅中，至细胞 完全融化为止 ；
(2) 将冻存管内容物转入 10mL 离心管中，加入 4mL 含 10％ FBS 的 DMEM，洗 脱冻存时加入的 DMSO ；
(3)1200rpm，离心 10min，弃掉上清 ；
(4) 加入 2.5mL 含 10％ FBS 的 DMEM，吹匀，转移入是塑料培养瓶中，在离心 管中再次加入 2.5mL 含 10％ FBS 的 DMEM，吹匀，将残余细胞转入同一塑料培养瓶中 ；
(5) 拧松培养瓶瓶盖，置 37℃，5％ CO2 培养箱中培养。
4.3 细胞传代培养
(1) 将培养瓶内培养基吸弃，加入 1mL 培养基清洗后吸弃，以除去血清 ；
(2) 加入 1mL 0.25％的 ATV，置于镜下观察，当细胞饱满后吸弃 ATV ；
(3) 加入 2mL 含 10％ FBS 的 DMEM，吹打贴壁细胞，使细胞均匀分散，将细胞
悬液分装至 2-3 个新培养瓶中，置 37℃，5％ CO2 培养箱培养。
4.4 细胞转染
转染前一天，接种生长状况良好的 293 细胞于六孔细胞培养板中，每孔细胞数 大约 5×105 个 ；次日，待细胞生长至 90％融合度时将构建好的 4 个 pRNTR/CMV-GFP/ U6-shRNA 干扰载体分别与含目标基因的 pDsRed1-C1-ATGL 质粒共转染 293 细胞，同时 设空白对照、单独转染仅含目标基因质粒的对照，整个筛选重复进行 3 次 ；转染体系为 pRNTR/CMV-GFP/U6-shRNA 质粒 3μg，pDsRed1-C1-ATGL 质粒 1μg，转染过程参照 Invitrogen 公司的 LipofectamineTM 2000 试剂使用说明书 ；转染 48h 后，在荧光显微镜下 观察荧光的表达情况。
转染过程如下 ：将低血清 Opt i-MEM 培养液及 LipofectamineTM 2000 于室温条 件下平衡 ；10μL 的 LipofectamineTM2000 及 5μg 质粒 ( 按 2 ∶ 1 比例，即 2μL Lipofec tamineTM2000 ∶ 1μg 质粒 DNA) 分别加入 250μL 低血清 Opti-MEM 中，轻弹管壁使混 匀，室温静置 5min，将质粒 DNA/ 低血清 Opti-MEM 混合物加入 LipofectamineTM2000 低 血清 Opti-MEM 混合物中，轻弹管壁使之混匀，室温孵育 20min ；将转染复合物均匀、缓 慢地加入细胞培养皿中，轻旋培养皿混匀液体，将细胞放入 37℃细胞培养箱孵育 ；转染 后 6-8h 更换新鲜培养液。 第五步 ：结果验证 ；
5.1pRNTR/CMV-GFP/U6-shRNA 载体的构建 ；
退火后得到的 shRNA-422、 shRNA-600， shRNA-1148 及 shRNA-NC 双链寡核 苷酸与 pRNTR/CMV-GFP/U6 载体进行连接、转化、涂平板、挑单克隆、抽提质粒后， 结果见图 1 ；经过 Sca I 及 EcoR V 双酶切后出现 2 个片段，大小与预期结果相吻合， 见图 2 ；测序结果表明 pRNTR/CMV-GFP/U6-s hRNA-422、 pRNTR/CMV-GFP/U6-s hRNA-600、 pRNTR/CMV-GFP/U6-shRNA-1148、 pRNTR/CMV-GFP/U6-shRNA-NC 载体中插入的序列与所设计的序列完全一致，证明载体构建成功。
5.2pDsRed1-C1-ATGL 载体的构建 ；
5.2.1pGEM-T-ATGL 阳性转化子的菌液 PCR 筛选与双酶切鉴定 ；
利用 ATGL 基因的菌液，利用 ATGLF1 和 ATGLR1 引物进行菌液 PCR 扩增，经 1％琼脂糖凝胶电泳，出现 1461bp 的目的基因片段，对阳性克隆提取质粒后，利用 SalI 和 XhoI 内切酶进行双酶切分析，经 1％琼脂糖凝胶电泳，见图 3，获得 1461bp 的目的基因 片段，回收目的片段并将其与 pDsRed1-C1 载体连接。
5.2.2pDsRed1-C1-ATGL 阳性转化子的菌落 PCR 筛选与双酶切鉴定 ；
连 接 至 pDsRed1-C1 载 体 上 的 ATGL 基 因， 利 用 pDsRedATGLF1 和 pDsRedATGLR1 引物进行菌落 PCR 扩增后，经 1％琼脂糖凝胶电泳出现 1461bp 的目的基 因片段，结果见图 4 ；提取质粒后进行双酶切分析，经 1％琼脂糖凝胶电泳，获得目的基 因片段，结果见图 5，表明已成功构建 pDsRed1-C1-ATGL 载体。
5.3shRNA 序列的筛选 ；
将表达干扰序列的在 pRNTR/CMV-GFP/U6-shRNA 载体分别与含相应甘油三 酯水解酶基因片段的载体 (pDsRed1-C1-ATGL) 共转染 293 细胞 48h 后，在荧光显微镜 下观察到各组中绿色荧光蛋白表达量基本相同，但与阴性对照相比 pRNTR/CMV-GFP/
U6-shRNA-422、 pRNTR/CMV-GFP/U6-shRNA-1148 转 染 组 红 色 荧 光 蛋 白 表 达 量 有 所 降 低， 其 中 pRNTR/CMV-GFP/U6-shRNA-600 转 染 组 降 低 最 为 明 显 ；pRNTR/ CMV-GFP/U6-shRNA-NC 组与不转染干扰载体的对照组基本相同，见图 6 ；试验中红色 荧光蛋白与甘油三酯水解酶基因部分功能域形成融合蛋白，因此红色荧光蛋白表达量降 低说明设计的干扰序列对甘油三酯水解酶基因具有干扰效果。
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种甘油三酯水解酶基因有效 shRNA 的筛 选方法。背景技术
RNA 干扰是通过双链 RNA(dsRNA) 介导的遗传干涉现象，它能够特异、有效地 降解 mRNA，从而引起基因的沉默。 自 2001 年 《Nature》 杂志上首次报道在哺乳动物 细胞中通过 siRNA 成功诱导了靶基因的特异性表达沉默后， RNA 干扰技术就开始作为一 项特异性基因沉默工具在哺乳动物细胞上广泛应用。 2003 年 Rubinson 等报道用病毒系统 在原代培养的细胞、干细胞及转基因小鼠上都取得了 RNA 干扰成功，更大大扩展了这项 技术的应用范围。 目前，RNAi 已发展成为调控生物基因表达的遗传学工具，广泛应用于 功能依赖性遗传筛选、基因功能研究等后基因组计划研究中，并有望成为潜在的基因治 疗工具。 甘油三酯 (TG) 是脂肪的主要存在形式，其水解过程是机体主要的能量来源。 2004 年，来自于三个不同的实验室的 Zimmermann， Jenk ins 和 Villena 等人，同时发现 了一种性质相似的脂肪酶，分别命名为 ：adiposetriglyceride lipas e(ATGL)， desnutrin 和 phospholipase A2ξ(iPLA2ξ)，经结构和功能研究表明这三种蛋白实为一种脂肪酶，并 将其统一命名为甘油三酯水解酶 (adipose triglyceride lipase，ATGL)。Zimmermann 等对不 同物种的 ATGL 进行研究发现，其氨基酸序列中都存在一个 GXSXG( 氨基乙酸 -X- 丝氨 酸 -X- 氨基乙酸 ) 模序，并且其中间的丝氨酸位点与 ATGL 的活性有关。 此外，在 ATGL 的 N 端还发现一个 α/β 折叠区域 (COG1752) 和一个 Patatin 结构域 (Pfam01734)，这些 结构都是与脂肪酶活性密切相关的保守性区域。 对 ATGL 缺陷型小鼠的研究发现，体内 脂肪组织含量明显提高，并且在多个组织中表现出甘油三酯堆积的现象 ；同时，心脏由 于堆积过量脂质，引起心脏功能紊乱，并最终导致死亡。
在动物细胞中应用 RNA 干扰技术的另一关键在于有效 siRNA 序列的筛选。 但 是截至目前，筛选有效的 RNAi 的序列继而构建其腺病毒载体，尚属空白。
因此，现有技术存在缺陷，需要改进完善。
在动物细胞中应用 RNA 干扰技术的另一关键在于有效 siRNA 序列的筛选。 但 是截至目前，筛选有效的 RNAi 的序列继而构建其腺病毒载体，尚属空白。
因此，现有技术存在缺陷，需要改进完善。
发明内容 本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种甘油三酯水解酶 基因有效 shRNA 的筛选方法。
本 发 明 的 方 法 包 括 以 下 步 骤 ：A1 ：编 码 目 的 shRNA 的 单 链 DNA 寡 核 苷 酸 片 段 的 设 计、 合 成 ；A2 ：pENTR/CMV-GFP/U6-shRNA 载 体 的 构 建 ；A3 ： pDsRed1-C1-ATGL 载体的构建 ；A4 ：shRNA 有效序列的筛选。
所述的方法，其中优选的，所述步骤 A1 具体执行以下操作 ：根据本实验室克隆 得到的西农萨能羊 ATGL 序列，设计三条 ATGL-siRNA 及 1 条阴性对照序列，在 siRNA
本 发 明 的 方 法 包 括 以 下 步 骤 ：A1 ：编 码 目 的 shRNA 的 单 链 DNA 寡 核 苷 酸 片 段 的 设 计、 合 成 ；A2 ：pENTR/CMV-GFP/U6-shRNA 载 体 的 构 建 ；A3 ： pDsRed1-C1-ATGL 载体的构建 ；A4 ：shRNA 有效序列的筛选。
所述的方法，其中优选的，所述步骤 A1 具体执行以下操作 ：根据本实验室克隆 得到的西农萨能羊 ATGL 序列，设计三条 ATGL-siRNA 及 1 条阴性对照序列，在 siRNA
基础上，将 19bp 的寡核苷酸以正反向组合，中间添加 GAGTACTG 的发夹环序列间隔， 使寡核苷酸内部形成发夹结构，每对寡核苷酸两端分别带有 BamH I 和 Xho I 酶切位点， 其中正义链的 3’ 端添加 TTTTTT 终止信号，得到 shRNA 的正、反义链模板。
所述的方法，其中优选的，所述步骤 A2 具体执行以下操作 ：A21 ：单链寡核苷 酸退火反应生成双链 ；将合成的单链寡核苷酸序列用灭菌无离子水溶解成浓度为 200μM 的溶液，然后进行退火反应，退火条件是 ：95℃ ×4 分钟，取出置室温逐渐冷却，即获 得浓度为 50μM 的双链寡核苷酸序列，分别标记为 ：ds422、 ds600、 ds1148 ；再分别取 少量稀释成浓度为 5nM 的工作浓度，A22 ：连接反应 - 构建穿梭载体 ；用 BamH I 及 Xho I 双酶切 pRNTR/CMV-GFP/U6 载体并切胶回收，然后将所述 ds422、所述 ds600 和所述 ds 1148 分别与 pRNTR/CMV-GFP/U6 载体酶切回收产物连接反应，反应条件为 4℃连接 过夜，得到连接产物 ；A23 ：连接产物转化 ；取 10μL 所述连接产物加入 100μL 感受 态 DH5α 细菌，冰浴 30 分钟，42 ℃热激 90 秒，置冰浴 12 分钟，加入 600μL LB 培养 液，37℃温和震荡培养 45 分钟，将细菌涂布于含 50μg/mL 卡那霉素的琼脂平板上，置 于 37℃温箱孵育 ；A24 ：筛选穿梭载体克隆。
所述的方法，其中优选的，所述连接反应体系为如下 ：pENTRTM/U6，2μL ； ds oligos(5nM)，1μL ；5× 退 火 缓 冲 液，4μL ；T4DNA 连 接 酶，1μL ；不 含 DNase/ Rnase 的水，12μL ；总体积 20.0μL。
所述的方法，其中优选的，所述步骤 A24 具体执行以下操作 ：(1) 穿梭载体克隆 的质粒酶切鉴定 ：ds oligos 的黏性末端与试剂盒提供的线性载体 pENTRTM/U6 的黏性末 端互补，经连接反应后，形成环形质粒 ；于卡那霉素琼脂平板上挑取单克隆菌落，转种 于 4mL 的含 50μg/mL 卡那霉素的 LB 培养液中，37℃振荡培养 12-16 小时，取菌液 2mL 提取质粒，大小符合的再进行 Sca I 及 EcoR V 双酶切鉴定，产物以 1.2％的琼脂糖凝胶电 泳观察 ；(2) 穿梭载体克隆的测序鉴定 ：取 (1) 中双酶切鉴定正确的单克隆菌液，送南京 金思瑞生物技术有限公司以 ABI377 型 DNA 自动荧光序列分析仪进行序列测定，引物为 测序引物 U6 或 M13。
所 述 的 方 法， 其 中 优 选 的， 所 述 步 骤 A3 具 体 执 行 以 下 操 作 ：A31 ：构 建 pDsRed1-C1-ATGL 克隆载体 ；将回收的目的基因片段与 pGM-T 载体连接，16℃保温过 夜，连接产物转化感受态 E.coliDH5α 菌株，涂布于含氨苄青霉素和 X-gal/I PTG 的 LB 培 养平皿中，于 37℃培养过夜，挑取白色单菌落摇菌，同时进行菌落 PCR，反应结束后取 10μL 反应液进行 1％琼脂糖凝胶电泳鉴定 ；将阳性克隆菌液利用碱裂解法抽提质粒，然 后用 Xho I 和 Sal I 内切酶进行双酶切鉴定，酶切反应体系如下 ：10×H Buffer，2.0μL ； Xho I，0.7μL ；Sal I，0.7μL ；pGM-T-gATGL1A1，10.0μL ；ddH2O，6.6μL ； 总 体 积 20.0μL ；37℃水浴反应过夜，取全部反应液在 1％琼脂糖凝胶上电泳，回收带有设计 酶切位点的目的基因片段 ；A32 ：构建 pDsRed1-C1-ATGL 表达载体。
所 述 的 方 法， 其 中 优 选 的， 所 述 步 骤 A 32 具 体 执 行 以 下 操 作 ：(1) 配 制 pDsRed1-C1 酶切反应体系并进行 37℃水浴反应过夜 ；(2) 酶切反应结束后，取全部反应 液进行 1％琼脂糖凝胶电泳，回收 pDsRed1-C1 载体酶切后的线性化片段 ；(3) 将载体片 段与目的基因片段连接，16℃反应过夜 ；(4) 将 pDsRed1-C1-ATGL 转化至 E.coli DH5α 感受态细胞，涂布含卡那霉素的平皿，37℃孵育过夜，挑取单菌落摇菌，同时进行菌落PCR 鉴定，然后提取质粒，进行酶切鉴定。
所述的方法，其中优选的，所述酶切反应体系为 ：10×H Buffer，2.0μL ；Xho I，0.7μL ；Sal I，0.7μL ；pDsRed1-C1-ATGL，5.0μL ；ddH2O，11.6μL ； 总 体 积 20.0μL。
所述的方法，其中优选的，所述步骤 A4 具体执行以下操作 ：A41 ：去内毒素质 粒提取 ；A42 ：细胞的复苏 ；A43 细胞传代培养 ：A44 ：细胞转染。
所述的方法，其中优选的，所述步骤 A41 具体执行以下操作 ：(1) 柱平衡 ：向 吸附柱中加入 500μL 的平衡液，吸附柱放入收集管中，12000rpm(13400×g) 离心 1 分 钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中 ；(2) 取 5-15mL 过夜培养的菌液 加入离心管中，12000rpm(13400×g) 离心 1 分钟，吸除上清液 ；(3) 向留有菌体沉淀的 离心管中加入 500μL 已加入 RNaseA 的溶液 P1，使用涡旋振荡器彻底悬浮细菌细胞沉 淀 ；(4) 向离心管中加入 500μL 溶液 P2，温和地上下翻转 6-8 次使菌体充分裂解 ；(5) 向离心管中加入 700μL 溶液 P3，立即温和地上下翻转 6-8 次，充分混匀，出现白色絮 状沉淀，12000rpm(13400×g) 离心 10 分钟，在离心管底部形成沉淀，收集上清液 ；(6) 将 (5) 中收集的上清液分次加入过滤柱，过滤柱放入收集管中，12000rpm(13400×g) 离 心 2 分钟，将离心后收集管中得到的溶液分次加入吸附柱中 ；(7)12000rpm(13400×g) 离 心 1 分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中 ；(8) 向吸附柱中加入 500μl 去 蛋白液，12000rpm(13400×g) 离心 1 分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管 中 ；(9) 按照 3 倍体积向漂洗液中加入无水乙醇，向吸附柱中加入 700μL 所述漂洗液， 12000rpm(13400×g) 离心 1 分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中 ；(10) 向吸附柱中加入 500μL 漂洗液，12000rpm(13400×g) 离心 1 分钟，倒掉收集管中的废 液 ；(11) 将吸附柱重新放回收集管中置于 12000rpm(13400×g) 离心 2 分钟，将吸附柱中 残余的漂洗液去除 ；(12) 将吸附柱置于一干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴 加 100-300μL 洗脱缓冲液，室温放置 2 分钟，12000rpm(13400×g) 离心 1 分钟后将质粒 溶液收集到离心管中。
所述的方法，其中优选的，所述步骤 A42 具体执行以下操作 ：(1) 从液氮罐中取 出 1 支冻存的 HEK293 细胞，立即放入 38℃水浴锅中，至细胞完全融化 ；(2) 将冻存管内 容物转入 10mL 离心管中，加入 4mL 含 10％ FBS 的 DMEM，洗脱冻存时加入的 DMSO ； (3)1400rpm，离心 10 分钟，弃掉上清液 ；(4) 加入 2.0mL 含 10％ FBS 的 DMEM，吹匀， 转移入塑料培养瓶中，在所述离心管中再次加入 2.0mL 含 10 ％ FBS 的 DMEM，吹匀， 将残余细胞转入所述塑料培养瓶中 ；(5) 拧松培养瓶瓶盖，置 37℃，5％ CO2 培养箱中培 养。
所述的方法，其中优选的，所述步骤 A43 具体执行以下操作 ：(1) 将培养瓶内培 养基吸弃，加入 1mL 培养基清洗后吸弃，以除去血清 ；(2) 加入 1mL 0.25％的 ATV，置 于镜下观察，当细胞饱满后吸弃 ATV ；(3) 加入 2mL 含 10％ FBS 的 DMEM，吹打贴壁 细胞，使细胞均匀分散，将细胞悬液分装至 2-3 个新培养瓶中，置 37℃，5％ CO2 培养箱 培养。
所 述 的 方 法， 其 中 优 选 的， 所 述 步 骤 A44 具 体 执 行 以 下 操 作 ：将 低 血 清 Opti-MEM 培 养 液 及 LipofectamineTM2000 于 室 温 条 件 下 平 衡 ；按 2 ∶ 1 比 例 将LipofectamineTM2000 及质粒分别加入 250μL 低血清 Opti-MEM 中，轻弹管壁使混匀，室 温静置 5min，将质粒 DNA/ 低血清 Opti-MEM 混合物加入 LipofectamineTM2000 低血清 Opti-MEM 混合物中，轻弹管壁使之混匀，室温孵育 20min ；将转染复合物均匀、缓慢地 加入细胞培养皿中，轻旋培养皿混匀液体，将细胞放入 37℃细胞培养箱孵育。
本发明在构建重组腺病载体之前先在 HEK 293 细胞中验证所设计序列的干扰 效果，以节省时间及成本，将干扰载体及靶基因表达载体分别用绿色荧光和红色荧光标 记，共转染 HEK 293 细胞，通过在荧光显微镜下观察绿色荧光及红色荧光的强度就可以 判断干扰载体的转染效率及靶基因的干扰效率，由于采用红光和绿光两种不同荧光分别 标记干扰载体及靶基因，使得干扰序列筛选过程省时高效，结果更直观可靠，而且可以 同时筛选多条序列。 附图说明
图 1 为 pRNTR/CMV-GFP/U6-shRNA 质粒凝胶电泳分析
图 2 为 pRNTR/CMV-GFP/U6-shRNA 酶切鉴定
图 3 为 pGM-T-ATGL 双酶切鉴定 图 4 为 pDsRed1-C1-ATGL 阳性转化子的 PCR 鉴定 ；
图 5 为 pDsRed1-C1-ATGL 酶切鉴定 ；
图 6 为 RNA 干扰序列的筛选 (200×)，其中 A 组、 B 组、 C 组、 D 组分别为 shRNA-NC、 shRNA-422、 shRNA-1148、 shRNA-600 序 列 的 干 扰 效 果 检 测 ；1(A1、 B1、 C1、 D1)、2(A2、 B2、 C2、 D2) 分 别 为 pENTR/CMV-GFP/U6-shRNA 干 扰 载体与 pDsRed1-C1-ATGL 靶基因表达载体共转染 HEK 293 细胞 48 小时后荧光显微 镜 下 绿 色 荧 光 及 红 色 荧 光 表 达 情 况 ；3(A3、 B3、 C3、 D3) 为 对 照 组， 即 单 独 转 染 pDsRed1-C1-ATGL 靶基因表达载体 48 小时后荧光显微镜下红色荧光表达情况。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例，对本发明进行详细说明。
第一步 ：编码目的 shRNA 的单链 DNA 寡核苷酸片段的设计、合成 ；
根 据 本 实 验 室 克 隆 得 到 的 西 农 萨 能 羊 ATGL 序 列， 利 用 在 线 siRNA 选 择 程 序 (http://jura.wi.mit.edu/bioc/siRNAext/home.php) 设 计 三 条 ATGL-siRNA 及 1 条 阴 性 对 照 序 列， 即 s i RNA-422 ：TCCGGAGCTGCCTGCTGAA(SEQID NO ： 1) ；siRNA -600 ：CCTCATCCCCCCTTCCTTC ( SEQ ID NO ：2) ；siRNA -1148 ： CCACGGCCATGATGGTGCC ( SEQ I D NO ：3) ； 阴 性 对 照 siRNA - NC ： ACTACCGTTGTTATAGGTG(SEQ ID NO ：4)。 在 siRNA 基础上，将 19bp 的寡核苷酸以 正反向组合，中间添加 GAGTACTG( 含 Sca I 酶切位点，以便载体构建中进行鉴定 ) 的发 夹环序列间隔，使寡核苷酸内部可形成发夹结构，每对寡核苷酸两端分别带有 BamH I 和 Xho I 酶切位点，其中正义链的 3’端添加 TTTTTT 终止信号，即得到 shRNA 的正、反义 链模板，见表 1 ：
表 1ATGL 特异的编码 shRNA 的寡核苷酸序列
第二步 ：pENTR/CMV-GFP/U6-shRNA 载体的构建 ；
2.1 单链寡核苷酸退火反应生成双链 ；
先将合成的单链寡核苷酸序列用灭菌无离子水溶解成浓度为 200μM 的溶液， 然后进行退火反应，退火反应体系为 ：退火条件是 ：95 ℃ ×4min，取出置室温逐渐冷 却，即获得浓度为 50μM 的双链寡核苷酸序列 (dsoligos)，分别标记为 ：ds422、ds600、 ds1148。 再分别取少量稀释成浓度为 5nM 的工作浓度，为进行连接反应准备，其余 置 -20℃保存。
200μM 正义链 5μL
200μM 反义链 5μL
10× 退火缓冲液 2μL
不含 DNase/Rnase 的水 8μL
总体积 20.0μL
2.2 连接反应 - 构建穿梭载体
用 BamH I 及 Xho I 双酶切 pRNTR/CMV-GFP/U6 载体并切胶回收，然后将退火 产物浓度为 5nM 的 ds422、 ds600、 ds1148 分别与 pRNTR/CMV-GFP/U6 载体酶切回收 产物连接，连接反应体系为如下 ：
pENTRTM/U6 2μL dsoligos(5nM) 1μL 5× 退火缓冲液 4μL T4DNA 连接酶 1μL 不含 DNase/Rnase 的水 12μL总体积 20.0μL
反应条件为 4℃连接过夜，之后进行转化或置 -20℃保存。
2.3 连接产物转化
取 10μL 连接产物加入 100μL 感受态 DH5α 细菌，冰浴 30 分钟，42℃热激 90 秒，快速置冰浴 1-2 分钟，加入 600μL LB 培养液，37℃温和震荡培养 45 分钟。 将细菌 涂布于含 50μg/mL 卡那霉素的琼脂平板上，置于 37℃温箱孵育。
2.4 筛选穿梭载体克隆
(1) 穿梭载体克隆的质粒酶切鉴定
ds oligos 的黏性末端与试剂盒提供的线性载体 pENTRTM/U6 的黏性末端互补， 经连接反应后，形成环形质粒。 于卡那霉素琼脂平板上挑取单克隆菌落，转种于 4mL 的 含 50μg/mL 卡那霉素的 LB 培养液中，37 ℃振荡培养 12-16 小时，取菌液 2mL 提取质 粒，大小符合的再进行 Sca I 及 EcoR V 双酶切鉴定，产物以 1.2 ％的琼脂糖凝胶电泳观 察。
(2) 穿梭载体克隆的测序鉴定
取双酶切鉴定正确的单克隆菌液，送南京金思瑞生物技术有限公司以 ABI 377 型 DNA 自动荧光序列分析仪进行序列测定，引物为测序引物 U6( 或 M13)。
第三步 ：pDsRed1-C1-ATGL 载体的构建
3.1 构建 pDsRed1-C1-ATGL 克隆载体
将回收的目的基因片段与 pGM-T 载体连接，16℃保温过夜，连接产物转化感受 态 E.coliDH5α 菌株，涂布于含氨苄青霉素和 X-gal/IPTG 的 LB 培养平皿中，于 37℃培 养过夜，挑取白色单菌落摇菌，同时进行菌落 PCR，反应结束后取 10μL 反应液进行 1％ 琼脂糖凝胶电泳鉴定。 将阳性克隆菌液利用碱裂解法抽提质粒，然后用 Xho I 和 Sal I 内 切酶进行双酶切鉴定，酶切反应体系如下 ：
10×H Buffer 2.0μL
Xho I 0.7μL
Sal I 0.7μL
pGEM-T-gATGL1A1 10.0μL
ddH2O 6.6μL
Total 20.0μL
37℃水浴反应过夜，取全部反应液在 1％琼脂糖凝胶上电泳，回收带有设计酶切 位点的目的基因片段。
3.2 构建 pDsRed1-C1-ATGL 表达载体
由于目的基因片段两端带有 Xho I 与 Sal I 内切酶酶切位点，将 pDsRed1-C1 进行 同样的双酶切反应，回收载体片段并与基因片段连接。
(1) 配制 pDsRed1-C1 酶切反应体系并进行 37℃水浴反应过夜 ；
10×H Buffer 2.0μL
Xho I 0.7μL
Sal I 0.7μL
pDsRed1-C1 5.0μL
ddH2O 11.6μL
总体积 20.0μL
(2) 酶 切 反 应 结 束 后， 取 全 部 反 应 液 进 行 1 ％ 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳， 回 收 pDsRed1-C1 载体酶切后的线性化片段 ；
(3) 将载体片段与目的基因片段连接，16℃反应过夜 ；
(4) 将 pDsRed1-C1-ATGL 转化至 E.coli DH5α 感受态细胞，涂布含卡那霉素的 平皿，37℃孵育过夜，挑取单菌落摇菌，同时进行菌落 PCR 鉴定，然后提取质粒，进行 酶切鉴定，酶切反应体系如上所述。
第四步 ：shRNA 有效序列的筛选 ；
4.1 挑取 pDsRed1-C1-ATGL 阳性单克隆及 4 个 pRNTR/CMV-GFP/U6-shRNA 干扰载体 ( 包括阴性对照 ) 分别接种于 4mL LB 培养基中 (10μg/mL kan)，37℃、200rpm 摇菌过夜，按 1 ∶ 50 比例转摇至 10mL LB 培养基中，37℃、230rpm 摇菌 16h，提取去内 毒素质粒。 具体操作步骤如下 ：
溶液 P1 在使用前先加入 RNa seA，混匀，置于 2-8℃保存，第一次使用前应按照 试剂瓶标签的说明先在漂洗液中加入无水乙醇。
(1) 柱平衡步骤 ：向吸附柱中加入 500μL 的平衡液，吸附柱放入收集管中， 12000rpm(13400×g) 离心 1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中，尽 量使用当天处理过的柱子。
(2) 取 5-15mL 过夜培养的菌液加入离心管中，12000rpm(13400×g) 离心 1min， 尽量吸除上清 ；优选的，菌液较多时可以通过几次离心将菌体沉淀收集到一个离心管 中，菌体量以能够充分裂解为佳，过多的菌体裂解不充分会降低质粒的提取效率 ；
(3) 溶液 P1 中加入 RNaseA，向留有菌体沉淀的离心管中加入 500μL 溶液 P1， 使用涡旋振荡器彻底悬浮细菌细胞沉淀 ；
注意 ：务必彻底悬浮细菌沉淀，如果有未彻底混匀的菌块，会影响裂解，导致 提取量和纯度偏低 ；
(4) 向离心管中加入 500μL 溶液 P2，温和地上下翻转 6-8 次使菌体充分裂解。 需要指出的是注意，上述步骤中要温和地混合，不要剧烈震荡，以免污染基因组 DNA ； 此时菌液应变得清亮粘稠，所用时间不应超过 5min，以免质粒受到破坏 ；如果未变得清 亮，可能由于菌体过多，裂解不彻底，应减少菌体量 ；
(5) 向离心管中加入 700μL 溶液 P3，立即温和地上下翻转 6-8 次，充分混匀， 此时会出现白色絮状沉淀，12000rpm(13400×g) 离心 10min，此时在离心管底部形成沉
淀。 需要注意 ：P3 加入后应立即混合，避免产生局部沉淀 ；如果上清中还有微小白色沉 淀，可再次离心后取上清 ；
(6) 将 上 一 步 收 集 的 上 清 液 分 次 加 入 过 滤 柱， 过 滤 柱 放 入 收 集 管 中， 12000rpm(13400×g) 离心 2min，小心地将离心后收集管中得到的溶液分次加入吸附柱 中，吸附柱放入收集管中，另外，如果过滤柱中有残余的液体说明步骤 (5) 吸取的上清 中杂质过多，可以延长离心的时间 ；如果离心后收集管底部有少量的沉淀，尽量地吸取 上清 ；
(7)12000rpm(13400×g) 离心 1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集 管中 ；
(8) 向吸附柱中加入 500μl 去蛋白液，12,000rpm(13400×g) 离心 1min，倒掉收 集管中的废液，将吸附柱放入收集管中 ；
(9) 向吸附柱中加入 700μL 漂洗液，漂洗液使用前应按照 3 倍体积加入无水乙 醇，12000rpm(13400×g) 离心 1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中 ；优 选的，加入漂洗液后，室温静置 2-5min，可更好地去除杂质 ；
(10) 向吸附柱中加入 500μL 漂洗液，12000rpm(13400×g) 离心 1min，倒掉收 集管中的废液 ； (11) 将吸附柱重新放回收集管中置于 12000rpm(13400×g) 离心 2min，目的是 将吸附柱中残余的漂洗液去除。 优选的，漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应 ( 酶 切、 PCR 等 ) 实验，为确保下游实验不受残留乙醇的影响，将吸附柱开盖，置于室温放 置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液 ；
(12) 将 吸 附 柱 置 于 一 个 干 净 的 离 心 管 中， 向 吸 附 膜 的 中 间 部 位 悬 空 滴 加 100-300μL 洗脱缓冲液，室温放置 2min，12000rpm(13400×g) 离心 1min 后将质粒溶液 收集到离心管中 ；优选的，为了增加质粒的回收效率，可将得到的溶液重新加入离心吸 附柱中，重复步骤 (12) ；洗脱液的 pH 值对于洗脱效率有很大影响 ；若用水做洗脱液， 应保证其 pH 值在 7.0-8.5 范围内， pH 值低于 7.0 会降低洗脱效率 ；洗脱缓冲液体积不应 少于 100μL，体积过小影响回收效率，且 DNA 产物应保存在 -20℃，防止降解。
4.2 细胞的复苏 ；
(1) 从液氮罐中取出 1 支冻存的 HEK293 细胞，立即放入 38℃水浴锅中，至细胞 完全融化为止 ；
(2) 将冻存管内容物转入 10mL 离心管中，加入 4mL 含 10％ FBS 的 DMEM，洗 脱冻存时加入的 DMSO ；
(3)1200rpm，离心 10min，弃掉上清 ；
(4) 加入 2.5mL 含 10％ FBS 的 DMEM，吹匀，转移入是塑料培养瓶中，在离心 管中再次加入 2.5mL 含 10％ FBS 的 DMEM，吹匀，将残余细胞转入同一塑料培养瓶中 ；
(5) 拧松培养瓶瓶盖，置 37℃，5％ CO2 培养箱中培养。
4.3 细胞传代培养
(1) 将培养瓶内培养基吸弃，加入 1mL 培养基清洗后吸弃，以除去血清 ；
(2) 加入 1mL 0.25％的 ATV，置于镜下观察，当细胞饱满后吸弃 ATV ；
(3) 加入 2mL 含 10％ FBS 的 DMEM，吹打贴壁细胞，使细胞均匀分散，将细胞
悬液分装至 2-3 个新培养瓶中，置 37℃，5％ CO2 培养箱培养。
4.4 细胞转染
转染前一天，接种生长状况良好的 293 细胞于六孔细胞培养板中，每孔细胞数 大约 5×105 个 ；次日，待细胞生长至 90％融合度时将构建好的 4 个 pRNTR/CMV-GFP/ U6-shRNA 干扰载体分别与含目标基因的 pDsRed1-C1-ATGL 质粒共转染 293 细胞，同时 设空白对照、单独转染仅含目标基因质粒的对照，整个筛选重复进行 3 次 ；转染体系为 pRNTR/CMV-GFP/U6-shRNA 质粒 3μg，pDsRed1-C1-ATGL 质粒 1μg，转染过程参照 Invitrogen 公司的 LipofectamineTM 2000 试剂使用说明书 ；转染 48h 后，在荧光显微镜下 观察荧光的表达情况。
转染过程如下 ：将低血清 Opt i-MEM 培养液及 LipofectamineTM 2000 于室温条 件下平衡 ；10μL 的 LipofectamineTM2000 及 5μg 质粒 ( 按 2 ∶ 1 比例，即 2μL Lipofec tamineTM2000 ∶ 1μg 质粒 DNA) 分别加入 250μL 低血清 Opti-MEM 中，轻弹管壁使混 匀，室温静置 5min，将质粒 DNA/ 低血清 Opti-MEM 混合物加入 LipofectamineTM2000 低 血清 Opti-MEM 混合物中，轻弹管壁使之混匀，室温孵育 20min ；将转染复合物均匀、缓 慢地加入细胞培养皿中，轻旋培养皿混匀液体，将细胞放入 37℃细胞培养箱孵育 ；转染 后 6-8h 更换新鲜培养液。 第五步 ：结果验证 ；
5.1pRNTR/CMV-GFP/U6-shRNA 载体的构建 ；
退火后得到的 shRNA-422、 shRNA-600， shRNA-1148 及 shRNA-NC 双链寡核 苷酸与 pRNTR/CMV-GFP/U6 载体进行连接、转化、涂平板、挑单克隆、抽提质粒后， 结果见图 1 ；经过 Sca I 及 EcoR V 双酶切后出现 2 个片段，大小与预期结果相吻合， 见图 2 ；测序结果表明 pRNTR/CMV-GFP/U6-s hRNA-422、 pRNTR/CMV-GFP/U6-s hRNA-600、 pRNTR/CMV-GFP/U6-shRNA-1148、 pRNTR/CMV-GFP/U6-shRNA-NC 载体中插入的序列与所设计的序列完全一致，证明载体构建成功。
5.2pDsRed1-C1-ATGL 载体的构建 ；
5.2.1pGEM-T-ATGL 阳性转化子的菌液 PCR 筛选与双酶切鉴定 ；
利用 ATGL 基因的菌液，利用 ATGLF1 和 ATGLR1 引物进行菌液 PCR 扩增，经 1％琼脂糖凝胶电泳，出现 1461bp 的目的基因片段，对阳性克隆提取质粒后，利用 SalI 和 XhoI 内切酶进行双酶切分析，经 1％琼脂糖凝胶电泳，见图 3，获得 1461bp 的目的基因 片段，回收目的片段并将其与 pDsRed1-C1 载体连接。
5.2.2pDsRed1-C1-ATGL 阳性转化子的菌落 PCR 筛选与双酶切鉴定 ；
连 接 至 pDsRed1-C1 载 体 上 的 ATGL 基 因， 利 用 pDsRedATGLF1 和 pDsRedATGLR1 引物进行菌落 PCR 扩增后，经 1％琼脂糖凝胶电泳出现 1461bp 的目的基 因片段，结果见图 4 ；提取质粒后进行双酶切分析，经 1％琼脂糖凝胶电泳，获得目的基 因片段，结果见图 5，表明已成功构建 pDsRed1-C1-ATGL 载体。
5.3shRNA 序列的筛选 ；
将表达干扰序列的在 pRNTR/CMV-GFP/U6-shRNA 载体分别与含相应甘油三 酯水解酶基因片段的载体 (pDsRed1-C1-ATGL) 共转染 293 细胞 48h 后，在荧光显微镜 下观察到各组中绿色荧光蛋白表达量基本相同，但与阴性对照相比 pRNTR/CMV-GFP/
U6-shRNA-422、 pRNTR/CMV-GFP/U6-shRNA-1148 转 染 组 红 色 荧 光 蛋 白 表 达 量 有 所 降 低， 其 中 pRNTR/CMV-GFP/U6-shRNA-600 转 染 组 降 低 最 为 明 显 ；pRNTR/ CMV-GFP/U6-shRNA-NC 组与不转染干扰载体的对照组基本相同，见图 6 ；试验中红色 荧光蛋白与甘油三酯水解酶基因部分功能域形成融合蛋白，因此红色荧光蛋白表达量降 低说明设计的干扰序列对甘油三酯水解酶基因具有干扰效果。
应当理解的是，本说明书就具体操作步骤为例对本发明进行详细说明，而对本 领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都 应属于本发明所附权利要求的保护范围。13CN 102021190 A CN 102021204 A
序列表1/7 页
14CN 102021190 A CN 102021204 A序列表2/7 页
15CN 102021190 A CN 102021204 A序列表3/7 页
16CN 102021190 A CN 102021204 A序列表4/7 页
17CN 102021190 A CN 102021204 A序列表5/7 页
18CN 102021190 A CN 102021204 A序列表6/7 页
19CN 102021190 A CN 102021204 A序列表7/7 页