技术领域
本发明涉及能够水解有机磷酸酯(organophosphate，OP)分子 的酶。具体而言，本发明涉及水解OP杀虫剂的磷酸三酯酶 (phosphotriesterase enzyme)及其编码基因，该磷酸三酯酶鉴定自由 土壤中分离得到的放射形土壤杆菌(Agrobacterium radiobacter)菌株。 本发明还涉及该鉴定的磷酸三酯酶的突变体，所述的突变体具有改变 了的底物特异性。
背景技术
有机磷酸酯杀虫剂是环境以及一系列日用品中的不良污染物。最 具敏感性的领域包括土壤的污染、再循环的灌溉废水的污染(污染的 废水被下游的灌溉者使用或直接让其流出农场)、以及在农业和园艺 出口商品中存在超标的残余物。有机磷酸酯类中毒是接触此类化学品 的农业工人面临的一个问题，对于在化学战中接触有机磷酸酯类的军 事人员来说也是如此。此外，战略储备的有机磷神经毒剂也需要进行 解毒处理。因此，急需一些生物补救策略来清除或减少此类有机磷酸 酯的残余物和/或储备。
提出的方案之一涉及使用能够使有机磷酸酯残基固定或发生降 解的酶。这些酶例如可被用于生物反应装置通过其能够使被污染的水 达到合格，或是用于洗涤溶液中以便在对水果、蔬菜或动物产品进行 收获后杀虫能够降低残余物的水平和存留时间。适合用于对有机磷酸 酯残余物进行降解的酶包括来自细菌的OP水解酶(Mulbry，1992； Mulbry和Kearney，1991；Cheng等，1999；US5,484,728；US5,589,386)、 来自脊椎动物的OP水解酶(Wang等，1993；1998；Gan等，1991； Broomfield等，1999)、以及来自OP抗性昆虫的OP水解酶(WO 95/19440和WO97/19176)。符合要求的OP水解酶应该能够快速降解 有机磷酸酯残余物。
研究得最为深入的OP降解酶是细菌的有机磷酸酯二水解酶 (organophosphate dihydrolase，OPD)，其由保藏号为ATCC27551的黄 杆菌菌种(Flavobacterium sp.)和缺陷短波单胞菌MG(Brevundimonas diminuta MG)(Harper等，1988；Mulbry和Karns，1989)中的不同的 质粒上的相同的基因编码。OPD是一种同二聚体蛋白，能够水解很多 种磷酸三酯(氧OP和硫OP均可)(Dumas等，1989a，b)。其反应机制 直接或间接地涉及金属离子，优选为Zn++。OPD对于磷酸单酯或二酯 不具有可检测到的活性(Dumas等，1989a，b；1990)。
已经在大肠杆菌(Escherichia coli)(ePHP)、结核分枝杆菌 (Mycobacterium tuberculosis)(mtPHP)和肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)(mpPHP)的基因组中鉴定出了OPD同源物(磷酸三酯酶 同源蛋白(磷酸三酯酶homology proteins，PHP))，不过，仅对ePHP 的磷酸三酯酶活性进行了测试(Scanlan和Reid，1995；Buchbinder等， 1998)。在ePHP的组裂解物中未检测到其对任何一种测试的底物具有 活性，例如p-硝基苯乙酸酯、双(p-硝基苯)磷酸酯、对氧磷(paraoxon) 和p-硝基苯磷酸酯。
在脊椎动物中也鉴定出了OPD同源物(Davies等，1997)，尽管 其在这些有机体中的功能仍是未知的。OPD、ePHP、mtPHP和哺乳动 物的PHP在氨基酸水平具有27-30％的相同性，不过mpPHP的相同性 稍低。涉及与Zn++结合的氨基酸残基在迄今为止所鉴定到的磷酸三酯 酶家族的六种成员中是保守的(Buchbinder等，1998)。
自暴露于OP的细菌中已经分离出另外三种截然不同的OP水解 酶(Mulbry和Kams，1989；Mulbry，1992；Cheng等，1999)。其中的 两种已经得到了其序列信息，两者之间以及与OPD之间均不相关。 一种为来自交替单胞菌菌种(Alteromonas sp.)的氨酰基脯氨酸二肽 酶(prolidase)，通常在X-Pro二肽的水解中起作用。研究报道其对 于杀虫剂类OP的活性适中，不过其kcat/Km特异性常数尚未被报道 (Cheng等，1999)。另一种为来自诺卡氏菌菌种(Nocardia sp.)B-1 菌株的芳基二烷基磷酸酯酶(aryldialkylphosphatase)(ADPase)，其对 于乙基对硫磷(parathion)的转换数(turnover number)与报道的OPD 相比要低4500倍(Mulbry和Kams，1989；Mulbry，1992)。
对氧磷酶或PON1是在哺乳动物中发现的一种截然不同的OP 水解酶。与OPD相似，其为一种金属酶(其金属离子优选为Ca++)， 在血浆中与低密度脂蛋白结合，通常参与对氧化的脂质化合物的代谢 (Gan等，1991；Sorenson等，1995)。其对于对氧磷具有高度的活性， 特异性常数在106M-1sec-1左右(Doorn等，1999；Hong和Raushel，1999)。
还有证据显示在大量的脊椎动物、无脊椎动物以及微生物中存在 其他的、被称为二异丙基氟磷酸酯酶(diisopropyl fluorophosphatase) (DFPase)的酶(Wang等，1998；Hoskin等，1999；Billecke等，1999)。 这些酶在其生化特性的许多方面具有显著的不同，但其共同特征为对 于OP类化学武器毒剂都具有水解活性。仅有的一些序列信息提示它 们与上述所有其他的OP水解酶均无关联。
对OP具有抗性的丽蝇(blowfly)和家蝇是对氧OP样 chlorfenvinfos(CVP)和羧酸酯OP样马拉硫磷(malathion)具有活性 的酯酶的来源(Newcomb等，1997；Campbell等，1998；Claudianos 等，1999；WO 95/19440；WO 97/19176)。将丽蝇酯酶E3(及其家蝇 直向同源物(ortholog)，ALI)的第137位残基的Gly以Asp取代导 致其具有了对CVP的活性，而将其第251位残基的Trp以Leu/Ser取 代的突变导致其产生针对马拉硫磷的活性。但这些酶对其OP底物的 特异性常数要较OPD对对氧磷的特异性常数低几个数量级。
因此需要更多的能够用于生物补救策略的OP降解酶。
发明内容
本发明人已经建立了一种快速敏感的蝇毒磷(Coumaphos)(一 种硫OP杀虫剂)水解荧光分析法，并用该方法自被污染的土壤中分离 出一种能够将OP作为唯一磷源的细菌。16S rDNA测序将该细菌(分 离物230)鉴定为放射形土壤杆菌的一种菌株。本发明人还已经分离并 鉴定了具有这种蝇毒磷水解活性的酶，并提供了该酶在生物补救策略 中的用途。
在一个方面，本发明提供了一种基本上纯化的多肽，该多肽选自：
(i)包含SEQ ID NO：1的序列的多肽；
(ii)包含SEQ ID NO：2的序列的多肽；
(iii)包含SEQ ID NO：3的序列的多肽；
(iv)包含SEQ ID NO：4的序列的多肽；或
(v)包含与(i)至(iv)中任一序列的相同性大于90％的序列的多 肽，
其中所述的多肽能够水解有机磷酸酯分子。
优选的有机磷酸酯分子包括，但不限于，蝇毒磷、香豆磷 (coroxon)、对氧磷、对硫磷、对硫磷-甲基、亚胺硫磷(phosmet)、 倍硫磷(fenthion)、二嗪农(diazinon)、毒死蜱(chlorpyrifos)、 dMUP、DFP、乐果(dimethoate)、马拉硫磷和马拉氧磷(malaoxon)。 更优选地，所述的有机磷酸酯是亚胺硫磷或倍硫磷。
在一个优选的实施方案中，该多肽可纯化自放射形土壤杆菌菌 种。
在一个更优选的实施方案中，该肽与(i)至(iv)中任一多肽具有至 少95％的相同性，更优选地具有至少97％的相同性，而更进一步优选 地与(i)至(iv)中任一多肽具有至少99％的相同性。
在另一方面，本发明提供了一种基本上纯化的多肽，该多肽选自：
(i)包含SEQ ID NO：1的序列的多肽；
(ii)包含SEQ ID NO：2的序列的多肽；或
(iii)与(i)或(ii)的相同性大于90％的多肽。
在另一方面，本发明提供了一种融合多肽，其包含融合于至少一 种其他多肽序列的本发明的多肽。
优选地，所述的至少一种其他多肽选自：增强本发明的多肽的稳 定性的多肽，以及有助于对该融合多肽进行纯化的多肽。
优选地，所述的至少一种其他多肽是麦芽糖结合蛋白。
在另一方面，本发明提供了一种分离的多核苷酸，所述的多核苷 酸包含选自以下的序列：
(i)SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列；
(ii)SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列；
(iii)SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列；
(iv)SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列；
(v)编码本发明的多肽的序列；或
(vi)与(i)至(v)中任一序列具有至少90％的相同性的序列， 其中所述的多核苷酸编码能够水解有机磷酸酯分子的多肽。
优选地，所述的多核苷酸与上述(i)至(v)中任一序列具有至少 95％的相同性，更优选地具有至少97％的相同性，且进一步更优选地 具有至少99％的相同性。
在另一方面，本发明提供了一种包含本发明的多核苷酸的载体。
优选地，所述的载体适合于进行多核苷酸的复制和/或表达。所 述的载体可以是，例如，质粒、病毒或噬菌体，其具有复制起点、且 优选地具有用来表达该多核苷酸的启动子、以及任选地具有该启动子 的调节序列(regulator)。该载体可以含有一或多个选择标记，例如 细菌质粒的氨苄青霉素抗性基因或哺乳动物表达载体的新霉素抗性 基因。该载体可以在体外用于例如产生RNA，或者用来转染或转化宿 主细胞。
在另一方面，本发明提供了一种包含本发明的载体的宿主细胞。
在另一方面，本发明提供了用于制备本发明的多肽的方法，该方 法包括在可产生所述多肽的条件下培养本发明的宿主细胞，并回收所 述的多肽。此类细胞可被用于生产具有商业用途的量的所述被编码的 多肽。
在另一方面，本发明提供了用于水解有机磷酸酯分子的组合物， 该组合物包含本发明的多肽，以及一或多种可接受的载体。
在另一方面，本发明提供了用于水解有机磷酸酯分子的组合物， 该组合物包含本发明的宿主细胞，以及一或多种可接受的载体。
应该认识到，本发明可以用来水解样品中的有机磷酸酯。例如， 当作物被喷洒有机磷酸酯杀虫剂后，在被人食用之前，该有机磷酸酯 的残存物能够自种子、果实和蔬菜上面被水解去除。类似地，被有机 磷酸酯污染的土壤或水也可以用本发明的多肽进行处理。
因此，在另一方面，本发明提供了用来水解样品中的有机磷酸 酯分子的方法，该方法包括将所述的样品暴露于本发明的多肽。
优选地，该多肽被作为本发明的组合物而被提供。
此外，优选的是该方法进一步包括将该样品暴露于一种二价阳 离子。优选地，所述的二价阳离子是锌。
优选地，所述的样品选自土壤、水、生物物质、或上述物质的组 合。优选的生物学样品包括来自植物的物质例如种子、蔬菜或果实， 以及来自动物的物质例如肉。
优选的有机磷酸酯分子包括但不限于蝇毒磷、香豆磷、对氧磷、 对硫磷、对硫磷-甲基、亚胺硫磷、倍硫磷、二嗪农、毒死蜱、dMUP、 DFP、乐果、马拉硫磷和马拉氧磷。更优选地，所述的有机磷酸酯是 亚胺硫磷或倍硫磷。
样品可以任何可行的途径被暴露于所述的多肽。这包括将所述的 多肽直接提供给该样品，可以使用或不使用载体或赋形剂等等。所述 的多肽也可以宿主细胞的形式被提供，典型地为微生物，例如细菌或 真菌，其表达编码本发明的多肽的多核苷酸。通常，所述多肽将作为 本发明的组合物而被提供。
样品中存在的有机磷酸酯分子也可以通过将该样品暴露于产生 本发明的多肽的转基因植物而被水解。
因此，在另一方面，本发明提供了产生本发明的多肽的转基因 植物。
在另一方面，本发明用于水解样品中的有机磷酸酯分子的方法， 该方法包括将所述的样品暴露于本发明的转基因植物。
优选地，所述的样品是土壤。
此外，优选的是所述的多肽至少产生于该转基因植物的根部。
在另一方面，本发明提供了于2001年4月20日保藏于澳大利 亚政府分析实验室的、保藏号为NM01/21112的、一种分离的放射形 土壤杆菌菌株。
在另一方面，本发明提供了用于水解有机磷酸酯分子的组合物， 该组合物包含本发明的放射形土壤杆菌菌株，以及一或多种可接受的 载体。
在另一方面，本发明提供了用于水解样品中的有机磷酸酯分子的 方法，该方法包括将所述的样品暴露于本发明的放射形土壤杆菌菌 株。
本发明所公开的内容可以被轻易地用于分离其他能够水解有机 磷酸酯的细菌菌种/菌株。例如，可通过在此所揭示的荧光检测筛选方 法来分离其他的细菌菌种/菌株。或者，可基于本发明的多核苷酸来设 计探针和/或引物，用以鉴定产生天然存在的本发明的多肽的变体的细 菌。
因此，在另一方面，本发明提供了产生本发明的多肽的分离的细 菌。
优选地，所述的细菌是放射形土壤杆菌菌种。更优选地，该细菌 是放射形土壤杆菌的一种菌株。
在另一方面，本发明提供了产生本发明的多肽的、分离的、天然 存在的细菌在水解样品中的有机磷酸酯中的用途。
在另一方面，本发明提供了用于水解有机磷酸酯分子的聚合的 海绵剂(sponge)或泡沫剂(foam)，所述的泡沫剂或海绵剂包含固 定于聚合多孔支持物上的本发明的多肽。
优选地，所述的多孔支持物包含聚氨酯(polyurethane)。
在一个优选的实施方案中，所述的海绵剂或泡沫剂进一步包含 包埋或整合到所述多孔支持物的表面或内部的碳。
在另一方面，本发明提供了用于水解样品中的有机磷酸酯分子 的方法，该方法包括将所述的样品暴露于本发明的海绵剂或泡沫剂。
在另一方面，本发明提供了用于探测是否存在有机磷酸酯的生 物传感器，所述的传感器包含本发明的多肽以及用于探测有机磷酸酯 分子被所述的多肽水解的装置。
在另一方面，本发明提供了用于筛选水解有机磷酸酯分子的制剂 的方法，该方法包括
(i)将所述的有机磷酸酯暴露于候选制剂，并
(ii)测定自步骤(i)中产生的荧光信号，
其中所述的荧光信号表明了有机磷酸酯的水解。
优选地，所述的有机磷酸酯是蝇毒磷或香豆磷。
此外，优选的是所述的制剂是多肽或微生物。
本发明的多肽可以被诱变，且得到的突变体可用于从中筛选改 变的活性，例如为底物特异性的改变。
因此，在另一方面，本发明提供了产生多肽的方法，所述的多 肽具有增强的水解有机磷酸酯的能力或对有机磷酸酯的底物特异性 被改变，该方法包括
(i)在本发明的一种第一多肽中产生一或多个氨基酸的突变，
(ii)测定该突变体水解有机磷酸酯的能力，并
(iii)选择一种突变体，该突变体与所述的第一多肽相比具有增 强的水解有机磷酸酯的能力或对有机磷酸酯的底物特异性 被改变。
如实施例部分所述，已经成功地用该方法生产出了如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示的多肽。
优选地，该第一多肽为选自SEQ ID NO：1至4中的任一多肽。
在另一方面，本发明提供了由上述方法产生的多肽。
在说明书全文中出现的“包含”一词，其含义应理解为是指包括 了所述的一个元素、整数或步骤，或是一组元素、整数或步骤，但并 不排除任何其他元素、整数或步骤，或是其他组元素、整数或步骤。
以下将通过下面这些非限制性的图和实施例来对本发明进行描 述。
附图简述
图1：蝇毒磷的结构及其水解产物。
图2：opdA的DNA序列(SEQ ID NO：5)。编码信号肽结构域的区 域以粗体显示，其余部分的序列在此被称为SEQ ID NO：6。
图3：OpdA的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)。信号肽以粗体显示。
图4：OPD(SEQ ID NO：17)和OpdA之间的氨基酸序列比对。分 泌信号以粗体显示。
序列表注释：
SEQ ID NO：1--OpdA的多肽序列。
SEQ ID NO：2--减去信号序列的OpdA的多肽序列。
SEQ ID NO：3--OpdA1的多肽序列。
SEQ ID NO：4--OpdA2的多肽序列。
SEQ ID NO：5--编码OpdA的多核苷酸序列。
SEQ ID NO：6--编码减去信号序列的OpdA的多核苷酸序列。
SEQ ID NO：7--编码OpdA1的多核苷酸序列。
SEQ ID NO：8--编码OpdA2的多核苷酸序列。
SEQ ID NO：9至16--PCR引物。
SEQ ID NO：17--来自黄杆菌菌种的OPD的多肽序列。
具体实施方式
通用技术
除非另有说明，本发明所使用的重组DNA技术均为本领域人员 熟知的标准技术。有关此类技术的文献可参见例如J.Perbal的《A Practical Guide to Molecular Cloning》(John Wiley和Sons(1984))、 J.Sambrook等的《Molecular Cloning：A Laboratory Manual》(Cold Spring Harbour Laboratory Press(1989))、T.A.Brown(编)的《Essential Molecular Biology：A Practical Approach》第一和第二卷(IRL Press (1991))、D.M.Glover和B.D.Hames(编)的《DNA Cloning：A Practical Approach》第一至第四卷(IRL Press(1995和1996))、以及F.M.Ausubel 等(编)的《Current Protocols in Molecular Biology》(Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience(1988，包括迄今为止所有的更新 版))。
有机磷酸酯
有机磷酸酯是合成的有机磷酸酯和相关的化合物例如氨基磷酸 盐(phosphoroamidate)。其具有通式(RR′X)P＝O或(RR′X)P＝S，其中 R和R′是短链基团。对于用作杀虫剂的有机磷酸酯，X是良好的离去 基团(leaving group)，其对于造成乙酰胆碱酯酶的不可逆抑制是必 需的。
本发明的多肽水解有机磷酸酯的磷酸酯键。这些有机磷酸酯可以 是、但不限于氧和硫OP。有机磷酸酯可以具有芳香族或脂肪族离去 基团(X)。
尽管有机磷酸酯作为杀虫剂的用途是众所周知的，但有机磷酸酯 也被用作针对哺乳动物的神经毒气。因此，可以展望本发明的多肽也 能够用于水解杀虫剂以外的有机磷酸酯。
多肽
″基本上纯化的多肽″是指一种多肽，其通常已经自脂质、核酸、 其他多肽以及那些与其在天然状态下有关联的其他污染分子中分离 出来。优选地，所述的基本上纯化的多肽自与其在天然状态下有关联 的其他成分中被分离的程度为至少60％，更优选地为至少75％，最优 选地为至少90％。
通过FASTA(Pearson和Lipman，1988)分析(GCG程序)来测定多 肽的相同性的百分数，其使用默认设置和一长度为至少50个氨基酸 的查询序列，由此该FASTA分析可对两个序列在至少为50个氨基酸 的区域内进行比对。更优选地，该FASTA分析可对两个序列在至少 为100个氨基酸的区域内进行比对。进一步优选地，该FASTA分析 可对两个序列在至少为250个氨基酸的区域内进行比对。更进一步优 选地，该FASTA分析可对两个序列在至少为350个氨基酸的区域内 进行比对。
通过在核酸序列中造成核苷酸的适当的改变，或通过体外合成所 需的多肽，可以制备氨基酸序列突变的本发明的多肽。此类突变包括 例如氨基酸序列中的残基的缺失、插入或取代。可进行缺失、插入或 取代的组合以得到最终的构建体，条件是最终的蛋白产物具有所需的 特征。实施例8给出了本发明的突变的例子。
在设计氨基酸序列的突变时，突变位点的定位以及突变的性质取 决于所要对其进行修饰的特征。可对突变位点进行单个或系列修饰， 例如，通过(1)首先以可供选择的保守氨基酸进行取代，然后根据得到 的结果进行更多基团的选择，(2)使靶残基缺失或(3)在定位的位点附近 插入其他残基。
氨基酸序列的缺失通常为大约1至30个残基，更优选地为大约 1至10个残基且典型地为大约1至5个相邻的残基。
取代突变为多肽分子中的至少一个氨基酸残基被去掉并在其原 来的位置上插入一个不同的残基。进行取代诱变时最受关注的位点包 括被鉴定为活性位点的那些位点。其他受关注的位点是那些在各种物 种中具有相同性的特定残基。这些位点可能对生物学活性而言十分重 要。这些位点，特别是那些属于具有至少3个其他的相同性保守位点 的序列的位点，优选地以相对保守的方式进行取代。此类保守取代显 示于表1，标题为″代表性的取代″。
由于SEQ ID NO：1的序列与黄杆菌OPD酶的序列具有90％的相 同性，因此SEQ ID NO：1可以被用来设计黄杆菌OPD酶的突变体， 该酶具有所需的活性，但其相同性低于90％。更具体地，可改变那些 对于水解有机磷酸酯分子具有重要意义的氨基酸以与本发明的多肽 相一致，而其他那些不影响此活性的氨基酸也可以被改变以确保相同 性水平不会超过90％。此类OPD突变的例子包括L272F和/或H257Y 的氨基酸改变。此类突变体也属于本发明的范畴。
表1.代表性的取代
原有残基代表性取代Ala(A)val；leu；ile；glyArg(R)lysAsn(N)gln；his；Asp(D)gluCys(C)serGln(Q)asn；hisGlu(E)aspGly(G)pro.alaHis(H)asn；glnIle(I)leu；val；alaLeu(L)ile；val；met；ala；pheLys(K)argMet(M)leu；phe；Phe(F)leu；val；alaPro(P)glySer(S)thrThr(T)serTrp(W)tyrTyr(Y)trp；pheVal(V)ile；leu；met；phe，ala
此外，如果需要，非天然氨基酸或化学合成的氨基酸类似物也可 作为取代或添加而引入本发明的多肽。此类氨基酸包括、但不限于普 通氨基酸的D-异构体、2，4-二氨基丁酸、α-氨基异丁酸、4-氨基丁酸、 2-氨基丁酸、6-氨基己酸、2-氨基异丁酸、3-氨基丙酸、鸟氨酸、正亮 氨酸、正缬氨酸、羟脯氨酸、肌氨酸、瓜氨酸、homocitrulline、半胱 磺酸、t-丁基甘氨酸、t-丁基丙氨酸，苯基甘氨酸、环 己基丙氨酸、β- 丙氨酸、氟基-氨基酸、设计者氨基酸(designer amino acid)例如β- 甲基氨基酸，Cα-甲基氨基酸、Nα-甲基氨基酸、以及通常的氨基酸类似 物。
同样属于本发明范围的本发明的多肽是在合成过程中或合成后 被不同修饰的多肽，例如，通过生物素化、苄化、糖基化、乙酰化、 磷酸化、酰胺化、通过已知的保护/阻断基团进行衍生化、蛋白水解裂 解、连接抗体分子或其他细胞配体，等等。这些修饰可以增强本发明 的多肽的稳定性和/或生物学活性。
本发明的多肽能以多种途径产生，包括天然蛋白的产生和回收、 重组蛋白的产生和回收、以及蛋白的化学合成。在一个实施方案中， 通过在能够有效产生该多肽的条件下培养能够表达该多肽的细胞并 回收该多肽而产生本发明的分离的多肽。有效的培养条件包括、但不 限于，使得蛋白能够产生的有效的培养基、生物反应器、温度、pH 值和氧气条件。有效的培养基是指任何细胞能在其中生长以产生本发 明的多肽的培养基。该培养基典型地包含一种水性的培养基，其含有 可同化的(assimilable)碳、氮和磷源以及适量的盐、矿物质、金属 和其他营养物(例如维生素)。本发明的细胞可在常规的发酵生物反 应器、摇瓶、试管、微量滴定板以及培养皿中培养。可在适合于重组 细胞的温度、pH和氧气含量的条件下进行培养。此类培养条件已经 被本领域人员所掌握。
多核苷酸
″分离的多核苷酸″是指一种多核苷酸，其通常已经自那些与其 在天然状态下有关联的或是连接的多核苷酸序列中分离出来。优选 地，所述的分离的多核苷酸自与其在天然状态下有关联的其他成分中 被分离的程度为至少60％，更优选地为至少75％，最优选地为至少 90％。此外，术语″多核苷酸″在此可与术语″核酸分子″相互替代。
与SEQ ID NO：5至8相比，本发明的多核苷酸可具有一或多个 突变。此类突变可以是核苷酸残基的缺失、插入或取代。突变体可以 是天然存在的(也就是说，是自天然来源中分离的)或是合成的(例如， 通过在核酸上进行定点诱变产生)。因此，本发明的多核苷酸显然可以 是天然存在的或是重组的。
通过FASTA(Pearson和Lipman，1988)分析(GCG程序)来测定 多核苷酸的相同性的百分数，其使用默认设置和一长度为至少150个 核苷酸的查询序列，由此该FASTA分析可对两个序列在至少为150 个核苷酸的区域内进行比对。更优选地，该FASTA分析可对两个序 列在至少为300个核苷酸的区域内进行比对。更进一步优选地，该 FASTA分析可对两个序列在至少为1050个核苷酸的区域内进行比 对。
本发明的寡核苷酸可以是RNA、DNA或是RNA或DNA的衍 生物。此类寡核苷酸的最小的长度是寡核苷酸能够与本发明的核酸分 子上的与其互补的序列形成稳定的杂交体所需的长度。本发明包括能 够用作例如鉴定核酸分子的探针或用作产生核酸分子的引物的寡核 苷酸。
本发明的寡核苷酸和/或多核苷酸可在高严格性条件下与SEQ ID NO：5至8的序列选择性地杂交。在此，严格条件是指(1)洗脱使 用低离子强度和高温度，例如，0.015M NaCl/0.0015M枸橼酸钠/0.1％ NaDodSO4，温度为50℃；(2)杂交过程中使用变性剂如甲酰胺，例如 50％(vol/vol)甲酰胺和0.1％牛血清白蛋白，0.1％Ficoll，0.1％聚乙 烯吡咯烷酮，50mM磷酸盐缓冲液，pH为6.5和750mM NaCl，75mM 枸橼酸钠，稳定为42℃；或(3)使用50％甲酰胺，5x SSC(0.75M NaCl， 0.075M枸橼酸钠)，50mM磷酸钠(pH6.8)，0.1％焦磷酸钠，5x Denhardt′s溶液，超声裂解的鲑精DNA(50g/ml)，0.1％SDS以及10％ 硫酸右旋糖苷，温度为42℃，溶于0.2x SSC和0.1％SDS。
载体
本发明的一个实施方案包括一重组载体，其包括至少一种分离的 本发明的核酸分子，其被插入任何能够将该核酸分子输送至宿主细胞 的载体。该载体含有异源性核酸序列，其是在天然状态下不与本发明 的核酸分子邻近的核酸序列，且该核酸序列优选地产生于这样的一种 菌株，即该菌株不是产生所述核酸分子的菌株。该载体可以是RNA 或DNA、原核的或真核的，且典型地是病毒或质粒。
一种类型的重组载体包含了可操纵地连接于一种表达载体的本 发明的核酸分子。“可操纵地连接”是指一核酸分子插入一表达载体 后可使得该分子在转化入宿主细胞后能够表达。在此，表达载体是能 够转化宿主细胞并实现一特定核酸分子的表达的DNA或RNA载体。
优选地，表达载体还能够在宿主细胞内进行复制。表达载体可以是原 核的或真核的，且典型地是病毒或质粒。本发明的表达载体包括任何 在本发明的重组细胞中起作用(即指导基因表达)的载体，所述的重组 细胞包括细菌、真菌、体内寄生虫、节肢动物、其他动物以及植物的 细胞。优选的本发明的表达载体能够在细菌、酵母、植物和哺乳动物 的细胞中指导基因表达。
本发明的表达载体含有调节序列例如转录调控序列、翻译调控序 列、复制起点、以及其他与该重组细胞相适应并能对本发明的核酸分 子的表达进行调控的调节序列。具体地，本发明的重组分子包括转录 调控序列。转录调控序列是对转录的起始、延长和终止进行调控的序 列。特别重要的转录调控序列是那些对转录的起始进行调控的转录调 控序列，例如为启动子、增强子、操纵子和阻抑物序列。适当的转录 调控序列包括任何能够在至少一种的本发明的宿主细胞内起作用的 转录调控序列。本领域人员熟悉大量的此类转录调控序列。优选的转 录调控序列包括那些在细菌、酵母、植物和哺乳动物的细胞中起作用 的转录调控序列，例如、但不限于tac、lac、trp、trc、oxy-pro、omp/lpp、 rrnB、λ噬菌体、噬菌体T7、T71ac、噬菌体T3、噬菌体SP6、噬菌 体SP01、金属硫因(metallothionein)、α-杂交因子、Pichia醇氧化 酶、甲病毒属(alphavirus)亚基因组启动子(例如新培斯病毒Sindbis virus亚基因组启动子)、抗生素抗性基因、杆状病毒、玉米夜蛾 (Heliothis zea)昆虫病毒、痘病毒、疱疹病毒、浣熊痘病毒、其他痘 病毒、腺病毒、巨细胞病毒(例如中间早期启动子(intermediate early promoters))、猿猴病毒40、逆转录病毒、肌动蛋白、逆转录病毒长 末端重复序列、劳斯肉瘤病毒(Rous sarcoma virus)、热休克、磷酸 盐和硝酸盐转录调控序列以及其他能够在原核或真核细胞中调控基 因表达的序列。其他合适的转录调控序列包括组织特异性的启动子和 增强子。
本发明的重组分子还可以(a)含有分泌信号(即信号片段核酸序 列)，其使得被表达的本发明的多肽能够自产生该多肽的细胞中被分泌 和/或(b)含有融合序列，其使得本发明的核酸分子以融合蛋白的形式表 达。合适的信号片段的例子包括任何能够指导本发明的蛋白分泌的信 号片段。优选的信号片段包括、但不限于组织型纤溶酶原激活剂 (t-PA)、干扰素、白细胞介素、生长因子、组织相容性和病毒被膜糖 蛋白信号片段，以及天然的信号序列。此外，本发明的核酸分子可以 连接一融合片段，该融合片段能够将被编码的蛋白导向蛋白体 (proteosome)，例如一泛素融合片段。重组分子还可以包括位于本 发明的核酸分子的核酸序列的周围和/或内部的插入和/或非翻译序 列。
宿主细胞
本发明的另一实施方案包括一种包含用一或多种本发明的重组 分子转化的宿主细胞的重组细胞。可通过任何能将核酸分子插入细胞 的方法来将核酸分子转化入细胞。转化技术包括、但不限于转染、电 穿孔、微注射、脂质转染(lipofection)、吸附以及原生质融合。重组 细胞可维持单细胞状态，也可长成组织、器官或多细胞生物体。转化 的本发明的核酸分子可保持染色体外状态或整合入该转化(如重组)的 细胞的染色体的一或多个位点，以使得其被表达的能力能够保留。
适于进行转化的宿主细胞包括任何可用本发明的多核苷酸进行 转化的细胞。宿主细胞既可以是非转化的细胞，也可以是已经用至少 一种核酸分子转化的细胞(例如为编码本发明的一或多种蛋白的核酸 分子)。本发明的宿主细胞既可以是能够内源性地(即天然地)产生本发 明的蛋白，也可以是能够在用至少一种本发明的核酸分子转化后产生 这些蛋白。本发明的宿主细胞可以是任何能够产生至少一种本发明的 蛋白的细胞，且包括细菌、真菌(包括酵母)、寄生虫、节肢动物、 动物和植物细胞。优选的宿主细胞包括细菌、分枝杆菌、酵母、植物 和哺乳动物的细胞。更加优选的宿主细胞包括土壤杆菌、沙门氏菌 (Salmonella)、埃希氏菌(Escherichia)、牙孢杆菌(Bacillus)、 利斯特氏菌(Listeria)、酵母(Saccharomyces)、草地夜蛾(Spodoptera)、 分枝杆菌(Mycobacteria)、粉纹夜蛾(Trichoplusia)、BHK(仓鼠幼 子肾)细胞、MDCK细胞(用于犬科动物疱疹病毒培养的正常狗肾细胞 系)、CRFK细胞(用于猫科动物疱疹病毒培养的正常猫肾细胞系)、 CV-1细胞(非洲猴肾细胞系，用于例如培养浣熊痘病毒)、COS(如 COS-7)细胞、以及Vero细胞。特别优选的宿主细胞是E.coli，包括 E.coli K-12衍生菌；伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)；鼠伤寒沙门 氏菌(Salmonella typhimurium)，包括减毒株；草地夜蛾；粉纹夜蛾； BHK细胞；MDCK细胞；CRFK细胞；CV-1细胞；COS细胞；Vero 细胞；以及非肿瘤性的小鼠成肌细胞G8细胞(如ATCC CRL1246)。 其他的合适的哺乳动物细胞宿主包括其他的肾细胞系，其他成纤维细 胞系(例如人、小鼠、或鸡胚成纤维细胞系)、骨髓瘤细胞系、中国仓 鼠卵巢细胞、小鼠NIH/3T3细胞、LMTK细胞和/或HeLa细胞。
重组DNA技术可以用来提高所转化的多核苷酸分子的表达，例 如，通过操控多核苷酸分子在宿主细胞内的拷贝数、多核苷酸分子转 录的效率、其转录产物的翻译的效率、以及翻译后修饰的效率。可以 用来增强本发明的多核苷酸分子的表达的重组技术包括、但不限于， 将多核苷酸分子操控性连接于高拷贝数的质粒、将多核苷酸分子整合 进一或多个宿主细胞染色体中、为质粒加入载体稳定序列、对转录控 制信号(例如启动子、操纵子、增强子)进行替换或修饰、对翻译控制 信号(例如核糖体结合位点、Shine-Dalgarno序列)进行替换或修饰、 修饰本发明的多核苷酸分子以符合宿主细胞的密码子用法、以及造成 破坏转录产物的序列的缺失。可通过对编码本发明的重组蛋白的进行 片段选择、修饰或衍生化而提高该表达的蛋白的活性。
转基因植物
如WO 99/53037所述，可通过将样品暴露于表达一种合适的酶 的转基因植物而降低样品中的有机磷酸酯的水平。典型地，所述的样 品是土壤。相应地，本发明的多核苷酸可表达于一种转基因植物，特 别是该植物的根部，以水解该样品中的有机磷酸酯分子。
术语″植物″指的是整个植物、植物器官(例如叶、茎、根，等等)、 种子、植物细胞等等。预期可用于本发明的植物单子叶植物和双子叶 植物。双子叶植物的例子包括棉花、谷物、番茄、烟草、马铃薯、豆、 大豆，等等。
本发明中所限定的转基因植物包括植物(以及该植物的部分和细 胞)及其后代，其已经用重组DNA技术进行遗传修饰以使得该所需的 植物或植物器官中产生至少一种本发明的蛋白或是使其产生增加。
本发明的多肽可以组成性地表达于转基因植物的所有发育阶段。 依所用的植物或植物器官的不同，该蛋白可以阶段特异性的方式表 达。此外，根据不同的用途，该蛋白可以组织通讯员的形式表达。
植物品种的选择依据该植物或其部分的预期用途以及欲转化的 植物品种的“服从性(amenability)”而确定。
已知的或发现的可使得植物表达一种编码所需蛋白的基因的调 节序列可以用于本发明。依据所需的靶植物或靶器官而选择所用的调 节序列。此类调节序列可得自植物或植物病毒中，或是通过化学合成。 本领域人员熟知此类调节序列。
其他调节序列例如终止子序列和聚腺苷酸信号包括任何在植物 中具有此类功能的序列，本领域人员熟知如何选择。此类序列的一个 例子是根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的胭脂氨酸 (nopaline)合酶(nos)基因的3′侧翼区(flanking region)。
可用于将含有编码所需蛋白的DNA序列的表达构建体导入靶植 物的一些技术包括、但不限于，用钙/聚乙二醇方法转化原生质体、电 穿孔和微注射或(包被的)颗粒轰击(particle bombardment)。除了这 些所谓的直接DNA转化方法以外，还有许多涉及载体的转化相系统， 例如病毒和细菌的载体(例如来自土壤杆菌属)。经过筛选，这些经过 转化的原生质体、细胞和植物部分可以通过本领域已知的方法再生为 完整的植物。转化和/或再生技术的选择对本发明来说并不是至关重要 的。
组合物
本发明的组合物包括赋形剂，在此也称为″可接受的载体″。赋形 剂可以是被处理的动物、植物、植物或动物材料、或环境(包括土壤和 水样品)能够耐受的任何材料。赋形剂的例子包括水、盐水、Ringer′s 溶液、葡萄糖溶液、Hank′s溶液、以及其他的水性的生理学平衡的盐 溶液。非水性载体，例如也可使用固定油类(fixed oils)、芝麻油(sesame oil)、油酸乙酯或甘油三酯。其他有用的配方包括含有粘性增强剂(例 如羧基甲基纤维素钠、山梨醇或右旋糖苷)的悬液。赋形剂也可含有 小量的添加剂，例如增强等渗性(isotonicity)和化学稳定性的物质。 缓冲液的例子包括磷酸盐溶液、重碳酸盐溶液和Tris缓冲液，而防腐 剂的例子包括噻汞撒(thimerosal)或o-甲酚、福尔马林和苯甲基醇。 赋形剂还可用来增加组合物的半寿期，例如、但不限于，聚合的控释 载体、生物可降解植入体、脂质体、细菌、病毒、其他的细胞、油、 酯、以及甘油。
此外，本发明的多肽可以组合物的形式提供，该组合物提高有机 磷酸酯水解的速度和/或程度，或增加该多肽的稳定性。例如，该多肽 可被固定于聚氨酯基质(Gordon等，1999)，或装入合适的脂质体胶 囊(Petrikovics等，2000a和b)。该多肽也可加入到一种组合物中，该 组合物包含一种泡沫剂，例如为那些通常用于消防的泡沫剂(LeJeune 等，1998)。本领域人员能够理解，本发明的多肽可以被轻易地用于如 WO 00/64539中所公开的海绵剂或泡沫剂，其全文在此并入作为参考。
本发明的一个实施方案是一种控释配方制剂，其能够将本发明的 组合物缓慢释放入动物、植物、动物或植物材料、或是环境中(包括土 壤和水样品)。在此，开始配方制剂包含置于开始载体中的本发明的组 合物。合适的开始载体包括、但不限于，生物相容性聚合物、其他聚 合基质、胶囊、微胶囊、微颗粒、弹丸制剂、渗透泵、扩散装置、脂 质体、lipospheres、以及经皮输送系统。优选的控释配方制剂是生物 可降解的(即生物可腐蚀的(bioerodible))。
优选的本发明的控释配方制剂能够将本发明的组合物释放入喷 洒了有机磷酸酯杀虫剂的土壤或水中。该配方制剂优选地在大约1到 12个月的时期内释放。本发明的优选的控释配方制剂能够实现的处 理为优选地至少1个月，更优选地为至少3个月，更加优选地为至少 6个月，更加优选地为至少9个月，且更加优选地为至少12个月。
用于产生能够水解有机磷酸酯的有效的组合物所需的本发明的 多肽、载体或宿主细胞的浓度，取决于需要消除污染的样品的性质、 样品中的有机磷酸酯的浓度、以及该组合物的配方。组合物中的多肽、 载体或宿主细胞的有效浓度可轻易地经实验确定，本领域人员对此能 够理解。
生物传感器
生物传感器是分析装置，其典型地由一种生物学活性物质例如酶 和一种将生化反应转化为可定量的电信号的传感器构成，所述电信号 可被处理、传输和测量。Rekha等(2000)提供了有关已经用于检测有 机磷化合物的生物传感器的综述，其全文在此并入作为参考。本发明 的多肽能够适合用于此类生物传感器。
实施例
实施例1-富集土壤样品中的具有蝇毒磷水解活性的微生物 蝇毒磷水解的荧光分析
磷酸三酯酶催化有机磷酸酯(OP)分子中的磷酸酯键的裂解，产 生一种磷酸二酯和一种醇。对于蝇毒磷(3-氯-4-甲基-7-香豆酰二乙基 硫代磷酸酯)，经磷酸三酯酶水解产生二乙基硫代磷酸酯和荧光醇 chlorferon(3-氯-7-羟基-4-甲基香豆素；图1)。因此用荧光测定法，通 过测定激发波长为355nm和在460nm处的发射强度可反映chlorferon 的产生，从而测定蝇毒磷的水解。Chlorferon的荧光在0.01μM至2.5 μM范围内呈线形。
所有的荧光测定均使用POLARstar荧光计(BMG Technologies Pty Ltd，Australia)，使用96-孔白色微滴定板(具有PolySorp表面的 FluoroNunc板，Nalge Nunc Internationa1)，且最终的反应体积为100μl。 蝇毒磷和chlorferon(0.4mM)的储存液以20％甲醇制备。在100μM 蝇毒磷、0.5％TritonX-100和50mM Tris-HCl、pH8.0中对全细胞进 行粗分析。对细胞裂解物的蝇毒磷的水解进行分析时未加入Triton X-100。
用手持式长波长(大约340nm)UV灯(Gelman Sciences)来测定 细菌菌落和染色的聚丙稀酰胺凝胶的荧光。
富集培养物
磷酸二酯被磷酸三酯酶水解的产物可被很多细菌用作磷源 (Cook等，1978；Rosenberg和Alexander，1979)。由此建立了一种富 集培养物，其中自一个曾经暴露于二嗪农(二乙基硫OP)的庭园中取 1g土壤，将其作为50ml富集培养基(表2)的接种体，其中以蝇毒磷 作为唯一的磷源。
表2.蝇毒磷富集培养基的组合物
培养基(每升)微量元素溶液(每升)Tris 6.05g NH4Cl 1g FeCl2 20μg KCl 0.5g 醋酸钠 0.68g MgSO4 0.1g p-氨基安息香酸 0.9mg 烟酸 0.9mg 微量元素溶液 10ml 蝇毒磷 100mM pH7.0(NH4)6Mo7O24.4H2O 20mg H3BO3 50mg ZnCl2 30mg CoCl2.6H2O 3mg MnCl2.4H2O 10mg 醋酸铜 10mg
将10％的该富集培养物在50ml新鲜的富集培养基中进行两次次 级培养，该富集培养基中含有蝇毒磷作为唯一的磷源。随后，富集培 养基中的蝇毒磷被二嗪农(浓度为100mM)替换，继续进行次级培养， 方法如前。在28℃孵育3天后，将该富集培养物进一步进行次级培养， 培养基以100mM对硫磷(另一种二乙基硫OP)为唯一的磷源。注意 到，2天后培养物颜色变黄(原因可能在于产生了p-硝基酚 (p-nitrophenol))。该培养物随即用不含磷的培养基稀释并接种于低 盐LB培养皿中(10g/l胰蛋白胨，5g/l酵母提取物和2.5g/lNaCl)。 在28℃生长3天后，随机挑选大约100个菌落，再次划线培养以确保 使其纯化，然后使用如上所述的微滴定板分析来分析蝇毒磷水解活 性。室温放置8小时后测定荧光。一种分离物(命名为P230)显示出 显著的荧光，对这种分离物进行进一步的检测。这种分离物的菌落在 含有蝇毒磷的琼脂培养皿中也显示出荧光。
实施例2-分离物P230的鉴定
分离物230是一种Gram阴性、过氧化氢酶阴阳性、氧化酶阳性 的杆状细菌。为明确鉴定分离物230，对其16S rRNA基因进行了序 列分析。根据Rainey等(1992)的方法自分离物230中提取DNA。将 在低盐LB培养基(2ml)中于28℃培养过夜的一种P230培养物的细 胞在微量离心管中离心沉淀(12000rpm/2分钟)。将该细胞沉淀重悬于 400μl STE缓冲液(10mM Tris-HCl、100mM NaCl、1mM EDTA、 pH8.0)，加入5μl的新鲜配制的溶菌酶溶液(0.3μg/μl)。在37℃孵育 20分钟后，加入蛋白酶K(15μl的1％的溶液)和SDS(10μl的25％ 溶液)并将反应物在60℃孵育30分钟。再加入等体积的缓冲液饱和 的酚，然后加入等体积的氯仿顺序提取DNA制剂。
使用细菌通用引物27f(5’AGAGTTTGATCMTGGCTCAG3’) (SEQ ID NO：9)和1492r(5’TACGGYTACCTTGTTACGACTT3’) (SEQ ID NO：10)，通过PCR自提取的DNA中扩增该16S rRNA基因， 引物的命名基于E.coli 16S rRNA基因的编号方式(Lane，1991)。由此 得到了分离物230的大约1320bp的16S rRNA基因，使用FASTA运 算法进行序列相似性分析(Pearson和Lipman，1988)。分离物230的 16S rRNA基因与其他土壤杆菌菌株具有相似的序列(表3)。
表3.分离物230与各种土壤杆菌菌株的16S rRNA基因的核酸序列比 较
土壤杆菌菌株序列相同性(％)放射形土壤杆菌LMG383100土壤杆菌菌种LMG1193699.7放射形土壤杆菌菌种MSMC21199.5放射形土壤杆菌菌种LMG1191599.3
这些结果提示分离物230是一种土壤杆菌菌株。使用Biolog系 统(Oxoid)，根据厂商推荐的步骤来测定分离物230对碳源的利用。 将其对碳的利用情况与已知的土壤杆菌菌种进行比较(表4；Krieg和 Holt，1984)。该分离物能够利用蔗糖、鸟氨酸和葡萄糖作为碳源。这 一点，连同由Kovac方法(Kovac，1956)所测定的阳性氧化酶反应，提 示该分离物与根癌土壤杆菌(A.tumefaciens)代谢变种1或放射形土 壤杆菌(A.radiobacter)代谢变种1最为相似。
表4.分离物230和已知的土壤杆菌菌种的碳利用情况和氧化酶活性
根癌土壤杆菌代谢变种1具有肿瘤诱导质粒(tumour-inducing plasmid)，由此可与放射形土壤杆菌代谢变种1相区别。在番茄秧苗 上测试了菌株P230的肿瘤诱导能力，将含有大量细菌悬液的水加到 叶子上，并用无菌针穿过细菌悬液刺穿叶子表面，经过4周未见到肿 瘤迹象。作为阳性对照的根癌土壤杆菌C58在此期间内产生了肿瘤。 用一种处理过的根癌土壤杆菌C58菌株作为阴性对照，其在该植物上 产生的结果与分离物230相同。因此，分离物230被确定为一种放射 形土壤杆菌代谢变种1菌株。
实施例3-蝇毒磷水解活性的组成性表达
为明确放射形土壤杆菌P230的磷酸三酯酶活性是否为组成性地 表达而与是否存在OP无关，测定了在有或没有对硫磷存在的条件下， 放射形土壤杆菌P230培养物的对硫磷水解活性(表5)。通过用BioRad Model 3550-UV微孔板分光光度计在595nm处测定培养物的光密度 而监测其生长。根据Serdar等(1989)的步骤分析其对硫磷水解活性， 其涉及用BioRad Model3550-UV微孔板分光光度计在405nm测定由 对硫磷形成的p-硝基酚。反应混合物含有溶于50mM Tris-HCl(pH8.0) 中的880μM对硫磷(此反应物还含有5％甲醇)。表5显示对硫磷水 解活性在分离物230中的组成性的表达，且这种活性的大部分表达于 迟滞期的早期至中期。
实施例4-P230提取物的天然(Native)聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)
为了证明一种单独的酶参与了蝇毒磷水解，对放射形土壤杆菌 P230细胞提取物的天然凝胶进行蝇毒磷水解活性的染色。离心(8000 gx15分钟)沉淀放射形土壤杆菌P230在低盐LB培养基中的培养 物(50ml)，将细胞沉淀重悬于2ml50mM Tris-HCl(pH8.0)中。通 过超声将细胞裂解(15秒一次，供5次，4℃)，离心除去大的细胞碎 片或完整的细胞(8000gx15分钟)。将所得上清液的一部分(含5g 蛋白)以10％(29∶1丙稀酰胺∶双丙)SDS-PAGE凝胶分离。上样之前， 样品中既不加入SDS也不加入β-巯基乙醇，此外，样品也不进行常规 的SDS-PAGE的煮沸过程。电泳后，将凝胶在50mM Tris-HCl(pH8.0) 中平衡5分钟，然后在含有8M蝇毒磷的50mM Tris-HCl(pH8.0) 中进一步孵育5分钟。然后将凝胶在按如上所述在UV灯下进行观察。 检测到了一条明显的荧光条带，提示该P230分离物含有一种单独的 具有蝇毒磷水解活性的酶。该酶的表观分子量为66kDa。
表5.在有或没有对硫磷的条件下生长至595nm处的OD为0.280时 的P230培养物的对硫磷水解活性
培养物 对硫磷水解活性 (μmol/min/mg蛋白)+对硫磷3.36±0.18-对硫磷3.13±0.07
实施例5-克隆蝇毒磷水解活性的基因
克隆技术和DNA制剂
除非另有说明，采用标准的通用克隆技术，见Sambrook等(1989) 所述。按照Gardiner等(1996)的方法自放射形土壤杆菌P230中提取 染色体DNA。简言之，离心沉淀(5000g，20分钟)放射形土壤杆 菌P230的过夜培养物(100ml)，用10ml冰冷的STE缓冲液(见上) 洗涤两次，并重悬于10ml STE。加入溶菌酶(20mg)并将细胞在37℃ 孵育2小时。加入等体积的STE以及SDS(终浓度为2％[w/v])和RNase (终浓度为20μg/ml)，将细胞裂解物在42℃孵育1小时。然后加入蛋 白酶K(终浓度为50μg/ml)并将裂解物在55℃孵育直到溶液变得透 明。加入等体积的缓冲液饱和的酚/氯仿(1∶1)，将样品充分混合并在 4℃离心(5000g，1小时)。用扩口移液管将上层水相转移到干净的 试管中以避免对DNA造成剪切。加入3M醋酸钠(pH5.2)(0.1体积) 和冰冷的乙醇(2.5体积)以沉淀染色体DNA，将溶液轻柔地混合并在 -20℃放置1小时。使用“钩状”移液管将DNA转移。以70％的乙醇 洗涤沉淀物，并在空气中干燥5分钟。加入TE缓冲液(pH8.0；1ml)， 并将DNA在4℃溶解过夜。
在E.coli中构建文库
将37.5μg的放射形土壤杆菌P230的DNA用4、2、1、0.5和 0.25单位的Sau3AI限制性内切酶在37℃消化10分钟，以制备放射 形土壤杆菌P230的染色体DNA的Sau3AI部分消化物。将10-12kb 范围内的DNA片段自0.7％的琼脂糖凝胶上切下，并按照厂商的说明 书，用QIAGEN PCR纯化/凝胶提取试剂盒进行提取。使用Geneworks Ultraclean Plasmid miniprep试剂盒制备pBluescript KS+质粒DNA (Stratagene)，以BamHI在37℃消化1小时，并用牛小肠碱性磷酸酶 (Boehringer Mannheim)进行去磷酸化。然后用QIAquick PCR纯化试 剂盒(QIAGEN)去除该磷酸酶。将该大小级份的P230 DNA片段与该 经BamHI消化的、磷酸酶处理的pBluescript载体连接，其中使用T4 DNA连接酶，T4连接酶缓冲液由New England Biolabs提供。连接在 4℃进行20小时。
用改良的Hanahan转化方法(Sambrook等，1989)将连接的DNA 转化入E.coli DH10β。将该转化混合物接种到含有氨苄青霉素(100 μg/ml)、X-Gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷；40μg/ml)和IPTG(异 丙基-β-D-硫代半乳糖苷；40μg/ml)的LB琼脂培养皿，并在37℃孵育 过夜。大约得到350个白色的菌落。
用于在根癌土壤杆菌中表达的三亲代杂交体(Triparental mating) 由于编码放射形土壤杆菌中的OP水解活性的基因在E.coli中 的表达可能不足以使得在表达水平上进行鉴定，因此将上述来自E. coli文库的pBluescript质粒转移至一密切相关的菌株，根癌土壤杆菌 C58。根癌土壤杆菌C58是非OP水解性的土壤杆菌菌株(Zimmerer 等，1966)。简言之，将上述在含有氨苄青霉素、X-Gal和IPTG的LB 培养皿上的白色菌落点到不含任何添加成分的LB培养皿中。同时， 将含有接合(conjugative)、共合(cointegrative)质粒pR751::Tn813 (Bowen和Pemberton，1985)的根癌土壤杆菌C58和E.coli JM109 (Yanisch-Perron等，1985)点到相同培养皿的相同位置。其目的是要 使得该接合、共合质粒能够进入含有pBluescript-衍生物的E.coli DH10β，并形成共合体，然后能够将该共合体转移至根癌土壤杆菌 C58。
将该三亲代杂交体在28℃孵育过夜。然后将杂交体混合物刮下 并用于在微滴定板上对蝇毒磷水解活性进行分析。这包括将该杂交体 混合物重悬于含0.5％TritonX-100、100μM蝇毒磷和50mMTris-HCl (pH8.0)的分析缓冲液中。将微滴定板在室温孵育8小时，如上所 述测定荧光的量。一种杂交体混合物(含有克隆p65)显示出显著的荧 光。
E.coliDH10βp65无细胞提取物的蝇毒磷水解活性
自在含有氨苄青霉素(100μg/ml)的LB培养基中生长至迟滞期 中期的细胞中制备E.coli DH10β p65的无细胞提取物和仅含有 pBluescript载体的对照提取物。将50ml的培养物离心沉淀(8000gx 15分钟)，并重悬于2ml50mM Tris-HCl(pH8.0)。通过超声将 细胞裂解(15秒一次，供5次，4℃)，离心除去大的细胞碎片或完整 的细胞(8000gx15分钟)。取部分(含15μg蛋白)上清液用于分析蝇 毒磷水解活性。检测到荧光随时间而增强，并测定了酶的活性量。自 表6中可以看出，含有克隆p65的E.coli DH10β的无细胞提取物与空 载体对照相比显示出了显著的蝇毒磷水解活性。
编码OP水解活性的基因在克隆p65中的定位
用HindIII将克隆p65DNA完全消化，将得到的四种片段[5.5kb (含pBluescript载体)、4kb、3.5kb和1.4kb]在1％的琼脂糖凝胶上 进行分离并切下。将该片段用QIAquick PCR纯化试剂盒(QIAGEN) 进行提取并连接于如上所述制备的经HindIII消化的pBluescript DNA。将连接产物转化至E.coli DH10β并分析每个菌落的蝇毒磷水解 活性。几个含有4kb的HindIII片段的克隆显示出蝇毒磷水解活性， 这取决于pBluescript中的该片段相对于lac启动子的方向。
表6.E.coli DH10β p65的无细胞提取物和仅含有pBluescript载体的对 照提取物的蝇毒磷水解活性
菌株蝇毒磷水解活性(nmol/min/mg蛋白)E.coli DH10β(pBluescript)0.78±0.04E.coli DH10β(p65)3.30±0.07
实施例6-opdA的序列
采用互补于载体上的T3和T7启动子的引物和“引物步行(primer walking)”来测定上述4kb的HindIII片段的核苷酸序列。使用BigDye Terminator系统(Applied BioSystems)在Applied BioSystems ABI PRISM377自动化DNA测序仪上进行DNA测序。鉴定到了一个开 发阅读框(ORF)，其在具有活性的克隆中与lacZ启动子处于同一方 向，而在缺乏活性的克隆中与lacZ启动子处于相反方向。该ORF含 有1152个核苷酸(图2)，当经过翻译后会编码一个具有384个氨基酸 (图3)、分子量为41.4kDa的蛋白。
用FASTA运算法(Pearson和Lipman，1988)计算了序列相似性。 发现该ORF与opd(自保藏号为ATCC27551(Mulbry和Karns、1989) 的黄杆菌菌种中鉴定的磷酸三酯酶基因)具有88％的核苷酸序列相同 性。此外，自该ORF推断的氨基酸序列与黄杆菌OPD酶(图4)具有 90％的相同性。为此，将该ORF命名为“opdA”。
在黄杆菌opd的序列与放射形土壤杆菌P230的opdA序列(图 2和3)之间存在一些显著的差别。OpdA蛋白的推定的信号序列似乎 少一个氨基酸，同时信号裂解位点也不同。此外，该opdA基因的3′ 端附近的框移使OpdA增加了16个氨基酸。该区域经过多次测序以确 保opdA中的这些额外的碱基并非是由于测序错误产生的。
天然的OPD酶使一种同二聚体，每个单体亚基含有两个锌离子 (Benning等，1995)。OPD蛋白序列中254位和257位的两个组氨酸 残基位于存在于每个单体中的二金属活性位点附近，并被认为与底物 结合袋(substrate binding pocket)中的活性位点残基以及底物相互作 用。将这两个His分别用Arg和Leu取代，导致酶的二聚体仅具有两 个金属原子(diSioudi等，1999)。该OpdA蛋白在相当于OPD的His254 和His257位置上具有Arg和Tyr(图4)。因此预期该OpdA天然的 酶可能是每个二聚体仅具有两个金属离子，而不是如天然的OPD那 样是四个。
实施例7-纯化的OpdA蛋白的活性
为确认图3所示的ORF编码了具有OP水解活性的蛋白，将该 蛋白作为麦芽糖结合蛋白的融合蛋白进行表达和纯化。
OpdA和OPD作为融合蛋白的表达
使用New England Biolabs的pMAL蛋白融合和纯化系统在大肠 杆菌中表达OpdA和OPD蛋白，结果得到了麦芽糖结合蛋白(MBP) 融合蛋白的表达。
为将opdA基因克隆至pMAL-c载体，通过聚合酶链反应(PCR)， 分别使用上游引物 5’GATCGTCTGCAGCCAATCGGTACAGGCGATCTG(SEO ID NO： 11)和下游引物 5’GATCGTAAGCTTTCATCGTTCGGTATCTTGACGGGGAAT(SEQ ID NO：12)对opdA基因(不包括信号肽结构域)进行扩增。将一个 PstI克隆位点插入起始密码子，并将一个HindIII克隆位点插入终止密 码子(下划线标出的碱基)。随后将PCR片段克隆至pMAL-c的 PstI-HindIII克隆位点，产生重组质粒pmal-opdA。
将opd基因(Mulbry和Kams，1989)以相似的方式克隆至 pMAL-c2X载体(New England Biolabs)。将无信号肽结构域的opd基 因进行PCR扩增。上游寡核苷酸引物 5′GATCGTGGATCCTCGATCGGCACAGGCGATCGG(SEO ID NO： 13)和下游寡核苷酸引物 5’GATCGTAAGCTTTCATGACGCCCGCAAGGTCGG(SEO ID NO： 14)分别设计为在opd起始密码子处具有一个BamHI限制位点，且在 终止密码子处具有一个HindIII限制位点(下划线标出的碱基)。随后将 该PCR片段克隆至pMAL-c2X的BamHI-HindIII限制性位点以产生重 组质粒pFmal。
OpdA和OPD蛋白的纯化
将两种MBP融合蛋白在E.coli DH10β细胞中表达。当用0.1mM 异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷(thiogalactopyranoside)在37℃诱导 5小时使细胞达到中度迟滞期(OD600＝0.6)时，可使MBP融合蛋白的 产生达到最佳。将收集的细胞用超声裂解，并将可溶组分加到经50 mM Tris-HCl(pH7.5)平衡的直链淀粉树脂(amylose resin)(New England Biolabs)中，将MBP融合蛋白用溶于50mM Tris-HCl(pH7.5) 中的10mM麦芽糖进行洗脱。收集含有蝇毒磷水解活性的级份并用 Xa蛋白酶(10μg/ml；New England Biolabs)裂解5小时。经裂解的级 份然后通过DEAE sepharose离子交换树脂。经过裂解的OpdA和OPD 蛋白不与该树脂结合，随着外水体积(void volume)被洗脱下来。经 SDS-PAGE验证，该样品的级份是纯的。经纯化的样品中的蛋白的量 通过Gill和von Hippel(1989)的方法而计算。
OPD和OpdA的动力学分析
(i)底物
测定OpdA和OPD对下列底物的水解作用的动力学参数：蝇毒 磷、对硫磷(O，O-二乙基p-硝基苯硫代磷酸酯；Riedel de Haan)、对 硫磷-甲基(O，O-二甲基p-硝基苯硫代磷酸酯；Riedel de Haan)、对 氧磷(O，O-二乙基p-硝基苯磷酸酯；Sigma)、香豆磷(3-氯-4-甲基 -7-香豆酰二乙基磷酸酯；Alltech)、倍硫磷(O，O-二甲基O-[3-甲基 4-(甲硫)苯基]硫代磷酸酯；Riedel de Haan)、二嗪农(标记的-O，O- 二乙基-O-(2-异丙基-4-甲基-6-嘧啶)-硫代磷酸酯；Alltech)、dMUP (O，O-二甲基4-甲基-umbelliferyl phosphate；Alan Devonshire惠赠)、 毒死蜱(O，O-二乙基O-3，5，6-三氯-2-吡啶基硫代磷酸酯；Alltech)和 亚胺硫磷(S-[(1，3-二氢-1，3-二氧-2H-异吲哚-2-基)甲基O，O-二甲基 二硫代磷酸酯；Alltech]。
(ii)分析
所有的反应物均含有于甲醇的有机磷酸酯，除了亚胺硫磷，其溶 于丙酮。在合适的情况下，反应物中的丙酮或甲醇的浓度恒定于5％。 所有的反应均在50mM Tris-HCl(pH8.0)中于25℃进行。
用如上所述的荧光测定分析法来测定纯化的OPD和OpdA与蝇 毒磷和香豆磷的初始反应速率。
OPD和OpdA与dMUP的初始反应速率均以荧光测定分析法来 测定以对水解产物4-甲基7-羟基香豆素(umbelliferone)(Roth，1969) 进行定量。荧光测定使用的激发波长为355nm，而发射强度为460nm。
在405nm并采用消光系数为17000M-1cm-1(Dumas等，1989b)， 通过分光光度法对水解产物p-硝基酚的形成进行定量分析来测定两种 纯化的酶与对硫磷、对硫磷-甲基和对氧磷的初始反应速率。。
以分光光度法通过监测在252nm处的吸光度的衰减对OpdA与 倍硫磷的初始反应速率定量分析(Ibrahim和Cavagnol，1966)。通过将 底物与OPD孵育24小时后进行薄层层析(thin layer chromatography) 证实了OPD对倍硫磷和亚胺硫磷无水解作用。
以分光光度法通过监测在276nm处的吸光度的增加而测定 OpdA和OPD与毒死蜱的反应速率(Dumas等，1989b)。
通过使用DTNB(Ellman试剂；5’5dithio-bis-(2-nitro benzoic acid))对反应过程中形成的游离巯基进行定量分析来检测亚胺硫磷的 水解，方法在用于监测有机磷酸酯的P-S水解中有述(Lai等，1995)。 该方法包括将DTNB(80μl的1mg/ml溶液，溶于50mM磷酸钠 (pH7.5)和甲醇，1∶1(v/v))加入到在不同时间取出的20μl的反应物 样品中。
用放射性标记的二嗪农(乙烷-1-14C；14.8MBq/mmol)通过曾经 用于放射性标记的OP底物放射分配分析(Campbell等，1998)监测二 嗪农的水解。在反应的不同时间取部分样品(50μl)以150μl水稀释， 然后以500μl二氯甲(dichloromethane)提取，取上层水相(150μl)通 过液体闪烁进行定量分析。
结果
动力学分析的结果见表7。OpdA和OPD能够水解底物蝇毒磷、 香豆磷、对氧磷、对硫磷、对硫磷-甲基、二嗪农、毒死蜱和dMUP。 OpdA对于对硫磷-甲基和dMUP具有较高的kcat，而OPD不能水解亚 胺硫磷或倍硫磷。通过薄层层析也观察到后两种底物在24小时后仍 无水解(Munnecke和Hsieh，1976)。这包括用等体积的乙酸乙酯对100 μl含有0.4mM底物的反应物进行提取。用氮气将上层有机相轻柔吹 干，将剩下的残余物溶解于10μl丙酮，然后加到中性硅胶F254TLC 板(Alltech，NSW，Australia)，将该板用己烷-氯仿-甲醇(7∶2∶1)处理，然 后在短波长的紫外灯下观察。观察到OpdA能水解亚胺硫磷和倍硫 磷，而对于OPD则无水解发生。
总之，观察到OpdA和OPD之间存在一定程度的底物特异性的 差别，OpdA能水解倍硫磷和亚胺硫磷，而OPD则不能。此外，在 对于二甲基OP的kcat值方面，OpdA与OPD之间存在显著的差别， 与OPD相比，OpdA对甲基-对硫磷和dMUP具有较高的kcat。我们同 样可以预期OpdA与OPD(Dumas等，1989a；Yang等，1995)一样， 也能够水解OP神经毒剂。
如上所述，OPD蛋白序列中254位和257位的两个His残基位 于每个单体的二金属活性位点附近，并被认为与底物结合袋中的活性 位点残基和底物发生相互作用(Benning等，1995)。分别用Arg和Leu 取代这些His，得到的酶的每个单体仅具有一个金属离子，这提高了 其对较大的底物如内吸磷(demeton)的催化活性，但降低了其对较小 的底物例如对氧磷的催化活性(diSioudi等，1999)。
表7.纯化的OpdA和OPD酶对各种OP底物的动力学参数
推测所结合的金属离子的数量的变化可以增加结构的可变性并曾强 较大的底物与活性位点的接近，而同时降低对较小的底物的活性。 OpdA蛋白在相当于OPD的His254和His257的位置具有Arg和Tyr (图4)。因此，令人惊奇的是OpdA对甲基-对硫磷的kcat较OPD高， 而其对于较大的乙基-对硫磷底物的kcat与OPD相似。自蝇毒磷/dMUP 底物对也得到了类似的结果。显然，是OpdA与OPD的氨基酸序列的 不同，而非是在253/254和256/257上的残基的不同导致了催化活性 的改变。
实施例8-具有改变了的特异性的OpdA突变体的鉴定
将质粒pmal-opdA转化至E.coli突变株XL1-red。将该质粒在该 菌株中增殖120代，每24代提取质粒一次。将这些质粒随后转化至 E.coli DH10β并将转化混合物稀释到50ml的含氨苄青霉素的LB中。
当培养物的OD595达到0.3时，用0.1mM IPTG诱导融合蛋白 的表达，且诱导达5小时。然后离心沉淀培养物，重悬于2ml的无菌 50mM Tris-HCl(pH7.5)，加入马拉硫磷至终浓度为440μM。将该 分析混合物放置1小时，用Ellman试剂(DTNB)(Lai等，1995)测定 马拉硫磷的水解。
将具有活性的收集物稀释并接种于含氨苄青霉素的LB的培养 皿中。如上所述选择各个菌落测定其对马拉硫磷和乐果的水解活性。 选出两个菌落(命名为pmal-opdA1和pmal-opdA2)进行进一步的测 定。
测定了两个突变体的序列并与野生型的OpdA进行比较。OpdA1 含有4个突变(P42S、P134S、A170S和S237G)(SEQ ID NO：3)，而 OpdA2含有一个突变(A119D)(SEQ ID NO：4)。其编号系统基于包括 信号序列的OpdA的氨基酸残基的编号。并各加入一个号以与OPD的 编号一致。
在质粒pCY76中表达后，将OpdA以及两个突变体OpdA1和 OpdA2纯化。使用引物pETopdA5 (5’GATCGTGAATTCCATATGCCAATCGGTACA，其具有EcoRI位 点(下划线)和NdeI位点(双下划线))(SEQ ID NO：15)和pETopdA3 (5’GATCGTGGATCCTCATCGTTCGGTATCTTG，其具有BamHI位 点(下划线))(SEQ ID NO：16)，通过PCR对基因进行扩增。用EcoRI 和BamHI对PCR片段进行消化，并与经类似消化的pBluescript连 接。该载体中的片段的序列已被确认。用NdeI-BamHI对该pBS-衍生 体进行消化，并与经NdeI-BglII-消化的pCY76连接。将阳性克隆置 于500ml的LB中。培养物生长24小时后，将其在4℃离心沉淀(7000 gx15分钟)。将沉淀重悬于4ml50mM Tis-HCl(pH7.5)，并以超 声裂解(Harcourt等，2002)。将无细胞提取物加到经50mM Tris-HCl (pH7.5)预平衡的DEAE sepharose柱上。OpdA及变体不与该柱结 合，收集洗脱液，将其加到经50mM Tris-HCl(pH7.5)预平衡的肝 素sepharose柱上(Pharmacia)。OpdA及变体被该柱结合，并用50mM Tris-HCl(pH7.5)/0.1M NaCl进行洗脱。然后，用SDS-PAGE验证 OpdA的纯度。测定这些蛋白对于脂肪性OP、乐果、马拉硫磷、马拉 氧磷和DFP(diisopropyl fluorophosphate)的动力学(表8)。两种突变体 均对乐果、马拉硫磷和马拉氧磷具有活性，而野生型OpdA则对其无 活性。此外，这些突变体对DFP的活性较野生型的OpdA高。
表8.纯化的OpdA与突变体OpdA1和OpdA2对不同底物的动力学参 数
1nd＝未测定
本领域人员应当认识到可以对如上所述这些本发明的特定的实 施方案进行多种的变化和改良而不脱离本发明的精神和范围。因此， 这些实施方案仅应被视为是用于说明而非是对于本发明的任何限制。
所有的出版物均以其全文并入在此作为参考。
纳入本发明说明书的任何文献、记录、材料、装置、文章等等中 的讨论均仅仅用来提供本发明的背景。不应当认为以上材料的任何或 是所有构成了存在于澳大利亚的、在本申请的各项权利要求的优先权 之前的、与本发明相关的现有技术基础或是公知常识。
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