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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 (10)授权公告号 (45)授权公告日 (21)申请号 201611155054.0 (22)申请日 2016.12.14 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 106699751 A (43)申请公布日 2017.05.24 (73)专利权人 山东大学 地址 250100 山东省济南市历城区山大南 路27号 (72)发明人 胡玮李荀王川东陆地王艳 吴一波李星陈子慧 (74)专利代理机构 济南圣达知识产权代理有限 公司 37221 代理人 李健康 (51)Int.Cl. C07D 417/12(2006.01) A61Q 1。
2、1/00(2006.01) A61P 31/04(2006.01) A61P 1/02(2006.01) A01P 1/00(2006.01) (56)对比文件 WO 9805332 A1,1998.02.12, WO 2014179144 A1,2014.11.06, 审查员 万玥 (54)发明名称 一种新型化合物XQH-3-7及其在抗变形链球 菌及抑制其生物膜形成中的应用 (57)摘要 本发明公开了一种新型噻唑类化合物， 该化 合物编号为XQH-3-7， 分子式为C16H17N5O4S2， 分子 量为391.47， 中文名称为N-(5-硝基噻唑-2-基)- 1-(苯基甲硫酰胺)哌啶-4-甲。
3、酰胺。 实验证实本 发明的化合物对浮游状态下的变形链球菌模式 菌株和临床菌株均呈现出良好的抑菌活性和杀 菌活性。 同时， 当培养基中化合物XQH-3-7终浓度 达到4mg/L时对变形链球菌生物膜的抑制率达到 96以上。 本发明涉及的化合物分子量小、 结构 相对简单， 抑菌实验证实具有抑制性强、 杀伤效 果好等特点， 能够显著抑制变形链球菌浮游细胞 和生物膜的形成， 有望作为预防龋齿的新型靶向 候选药物。 权利要求书1页 说明书5页 CN 106699751 B 2019.01.15 CN 106699751 B 1.一种噻唑类化合物XQH-3-7， 其特征在于： 该化合物化学分子式为C16H1。
4、7N5O4S2， 中文名 称为N-(5-硝基噻唑-2-基)-1-(苯基甲硫酰胺)哌啶-4-甲酰胺， 英文名称为N-(3- bromophenyl)-4-(2-(5-nitrothiazol-2-yl)amino)-2-oxoethyl)piperazine-1- carboxamide， 分子量为391.47， 其化学结构如式(1)所示： 2.权利要求1所述噻唑类化合物XQH-3-7在制备抑制和杀伤变形链球菌模式菌株和临 床菌株的浮游细胞药物中的应用。 3.权利要求1所述噻唑类化合物XQH-3-7在制备抑制变形链球菌模式菌株和临床菌株 生物膜的形成药物中的应用。 4.权利要求1所述噻唑类化合物。
5、XQH-3-7在制备口腔变形链球菌生物膜抑制剂中的应 用。 5.权利要求1所述噻唑类化合物XQH-3-7在制备防治龋齿的靶向药物中的应用。 6.权利要求1所述噻唑类化合物XQH-3-7作为抑菌添加成分在制备牙膏、 漱口水或消毒 液中的应用。 权利要求书 1/1 页 2 CN 106699751 B 2 一种新型化合物XQH-3-7及其在抗变形链球菌及抑制其生物 膜形成中的应用 技术领域 0001 本发明涉及一种噻唑类化合物， 尤其涉及一种新型噻唑类化合物XQH-3-7及其在 抗变形链球菌及抑制其生物膜形成中的应用。 该化合物可以抑制口腔中牙周细菌的生长， 可用于防治龋齿， 属于口腔疾病防治药物。
6、制备技术领域。 背景技术 0002 相比于浮游(planktonic)的生长方式， 绝大多数的细菌在自然环境中更倾向于采 取生物膜(biofilm)的方式进行生长。 所谓的生物膜(也被称之为生物被膜)是指细菌利用 自身分泌的大分子胞外基质将自身细胞包裹起来并附着于有生命或无生命物体表面的一 类高度组织化的细胞群体。 生物膜中存在大分子物质包括蛋白质、 多糖、 DNA、 RNA、 肽聚糖、 脂和磷脂等物质。 人体口腔中也存在着大量的微生物， 他们利用口腔中残留的碳水化合物 和唾液以生物膜的形式寄居在人体牙齿的表面。 正常情况下， 口腔中的微生物在牙齿表面 处于一种相对稳定的生理平衡状态， 一旦这。
7、种平衡被打破就会引发龋齿(Selwitz et al., 2007)。 0003 龋齿俗称虫牙、 蛀牙， 是一种细菌诱发的可导致牙釉质、 牙本质脱矿分解的慢性疾 病。 该病发病率高、 涉猎范围广， 尤其是在青少年和儿童中比较常见。 龋齿患者对冷热酸甜 等刺激变得异常敏感并伴随着疼痛(Fejerskov and Kidd,2009)。 严重者会引发牙髓病、 根 尖病等一系列并发症， 甚至失去整个牙齿进而影响身体健康和生活质量。 龋齿现已成为严 重危害人类身体健康的主要口腔疾病之一(Pitts,2004)。 在龋齿的形成过程中， 变形链球 菌(Streptococcus mutans)起着至关重要。
8、的作用。 0004 变形链球菌是一类兼性厌氧的革兰氏阳性菌， 是人体口腔中主要的致龋齿菌之 一。 变形链球菌不仅可以通过代谢产生大量的酸性物质腐蚀牙釉质， 而且能够通过产生葡 聚糖转移酶将口腔内残留的蔗糖转变为葡聚糖。 葡聚糖粘附到牙齿后很难被清除， 并且能 够选择性地吸附口腔中其他细菌， 形成菌斑。 菌斑中的细菌代谢产生酸性产物长期作用于 牙齿会使牙齿脱矿产生齿洞， 久而久之便会形成龋齿(Lemos et al.,2013)。 0005 因此， 寻找能够抑制变形链球菌浮游细胞和生物膜形成的新型化合物将有助于人 们开发新的预防龋病的治疗措施及相关药物。 发明内容 0006 针对现有技术的需求，。
9、 本发明的目的是提供一种新型噻唑类化合物XQH-3-7及其 在抗变形链球菌及抑制其生物膜形成中的应用。 0007 本发明所述噻唑类化合物XQH-3-7， 其特征在于： 该化合物化学分子式为 C16H17N5O4S2， 中文名称为N-(5-硝基噻唑-2-基)-1-(苯基甲硫酰胺)哌啶-4-甲酰胺， 英文名 称为N-(3-bromophenyl)-4-(2-(5-nitrothiazol-2-yl)amino)-2-oxoethyl) piperazine-1-carboxamide， 分子量为391.47， 其化学结构如式(1)所示： 说明书 1/5 页 3 CN 106699751 B 3 0。
10、008 0009 上述化合物易溶于二甲基亚砜(DMSO)， 难溶于水。 0010 上述化合物XQH-3-7的合成路线见如下反应式： 0011 0012 其中： (a)HOBT， EDCI， 三乙胺， 室温； (b)乙酸乙酯氯化氢饱和溶液， 室温； (d)三光 气， 无水乙酸乙酯， 0到回流； (e)三乙胺， 无水四氢呋喃， 0到室温。 根据常用的标准干燥 方法干燥所用到的各种溶剂。 0013 本发明所述噻唑类化合物XQH-3-7在制备抑制和杀伤变形链球菌(Streptococcus mutans)模式菌株和临床菌株的浮游细胞药物中的应用。 0014 本发明所述噻唑类化合物XQH-3-7在制备抑。
11、制变形链球菌(Streptococcus mutans)模式菌株和临床菌株生物膜的形成药物中的应用。 0015 本发明所述噻唑类化合物XQH-3-7在制备口腔变形链球菌(Streptococcus mutans)生物膜抑制剂中的应用。 0016 本发明所述噻唑类化合物XQH-3-7在制备防治龋齿的靶向药物中的应用。 0017 本发明所述噻唑类化合物XQH-3-7作为抑菌添加成分在制备牙膏、 漱口水或消毒 液中的应用。 0018 测试时用DMSO将化合物XQH-3-7溶解， 配成终浓度为1024mg/L的母液贮存。 0019 本发明测定了化合物XQH-3-7对变形链球菌模式菌株和临床菌株的抑制效。
12、果。 0020 结果显示， 化合物XQH-3-7对浮游状态下的变形链球菌具有很好的抑菌活性和杀 菌活性， 其对变形链球菌UA159菌株的最小抑菌浓度为4mg/L， 最小杀菌浓度为32mg/L， 半数 最大抑制浓度(IC50)为0.918mg/L。 当培养基中化合物XQH-3-7终浓度达到4mg/L时对变形链 球菌UA159菌株生物膜的抑制率为96.62。 化合物XQH-3-7对变形链球菌6715-13菌株的最 小抑菌浓度为4mg/L， 最小杀菌浓度为32mg/L， 半数最大抑制浓度(IC50)为0.546mg/L。 当培 养基中化合物XQH-3-7终浓度达到4mg/L时对变形链球菌6715-1。
13、3菌株生物膜的抑制率为 96.18。 0021 其中， 所使用的变形链球菌UA159菌株为模式菌株， 在NCBI数据库(http:/ www.ncbi.nlm.nih.gov/)中的参考基因组编号为NC_004350。 本发明所使用的变形链球菌 6715-13菌株为临床菌株， 分离自患有龋齿病人的口腔当中。 其最适的培养基优选脑心浸液 (Brain Heart Infusion)培养基(Brain infusion solids 12.5g/L， Beef heart 说明书 2/5 页 4 CN 106699751 B 4 infusion solids 5.0g/L， Proteose p。
14、eptone 10.0g/L， Glucose 2.0g/L， Sodium chloride 5.0g/L， Di-sodium phosphate 2.5g/L， pH 7.40.2)， 最适的培养条件优选厌 氧， 37静置培养。 0022 本发明公开的噻唑类化合物XQH-3-7分子量小、 结构相对简单， 抑菌实验证实具有 抑制性强、 杀伤效果好等特点， 能够显著抑制变形链球菌浮游细胞和生物膜的形成， 具有预 防龋病的潜力， 有望作为预防龋齿的新型靶向候选药物。 具体实施方式 0023 下面结合本发明提供的一种新型噻唑类化合物XQH-3-7进一步描述其在杀伤、 抑 制变形链球菌浮游细胞及其。
15、生物膜形成过程中的应用。 所述内容是对本发明的解释而不是 限定。 0024 实施例1： 化合物XQH-3-7的制备 0025 化合物XQH-3-7的合成路线见如下反应式： 0026 0027 其中： (a)HOBT， EDCI， 三乙胺， 室温； (b)乙酸乙酯氯化氢饱和溶液， 室温； (d)三光 气， 无水乙酸乙酯， 0到回流； (e)三乙胺， 无水四氢呋喃， 0到室温。 根据常用的标准干燥 方法干燥所用到的各种溶剂。 0028 具体反应过程描述如下： 0029 (1)中间体4-叔丁基-(5-硝基噻唑-2-基)氨基甲酰-1-羧酸(1)的制备。 0030 将1-Boc-4-哌啶甲酸(1eq)溶。
16、解于N,N二甲基甲酰胺， 再分别加入HOBt(1.2eq)和 EDCI(1.2eq)， 滴加三乙胺(1.2eq)。 滴加完毕， 再加入5-硝基2-氨基噻唑(1.2eq)， 在常温下 反应过夜， 向反应液中加200ml的蒸馏水， 水相用乙酸乙酯萃取三次(3200ml)， 合并有机 相用饱和NaCl洗两次(2100ml)， 无水硫酸镁干燥， 然后用旋转蒸发仪蒸发浓缩得粗品。 粗 品经硅胶色谱柱柱纯化分离(二氯甲烷:甲醇v:v， 200:1)得到黄色固体， 产率75。 0031 (2)中间体2-(4-氨基-1-基)-N-(5-硝基噻唑-2-基)哌啶-4-甲酰胺(2)的制备 0032 将乙酰氯慢慢滴入。
17、无水乙醇中(v:v,4:5)， 生成HCl和乙酸乙酯， 再将上一步中间 体溶于其中,在常温下搅拌15分钟， 用TLC检测反应完全， 蒸干溶剂， 得黄色固体， 粗产品产 率100， 未经处理直接进行下一步。 0033 (3)N-(5-硝基噻唑-2-基-)-1-(苯基甲酰巯基)哌啶-4-酰(XQH-3-7)的制备 0034 在0将中间体3(1eq)和三乙胺(1.2eq)溶解于无水四氢呋喃中， 再逐滴滴加苯基 异硫氰酸酯(1.2eq)， 搅拌3h， 用TLC检测反应， 蒸出四氢呋喃， 向反应液中加50ml的蒸馏水， 说明书 3/5 页 5 CN 106699751 B 5 水相用乙酸乙酯萃取三次(3。
18、50ml)， 合并有机相用饱和氯化钠溶液洗两次(250ml)， 无 水硫酸镁干燥30分钟， 然后经真空蒸发浓缩得粗品。 粗品经硅胶色谱柱(200-300目)纯化分 离， (二氯甲烷:甲醇v:v,50:1)作为洗脱剂， 得到类白色固体， 产率61。 0035 1H NMR(400MHz,DMSO-d6)： 13.19(s,1H),9.31(s,1H),8.64(s,1H),7.29(d,J 6.0Hz,4H),7.10(d,J2.6Hz,1H),4.72(d,J13.3Hz,2H),3.20(t,J11.7Hz,2H),2.92 (t,J12.9Hz,1H),1.94(d,J11.2Hz,2H)。
19、,1.74-1.60(m,2H).ppm； ESI-MS:390.1M-H. 0036 实施例2： 变形链球菌的准备 0037 (1)培养变形链球菌的培养基为脑心浸液(Brain Heart Infusion)培养基(品牌 OXOID， 货号CM1135)， 培养基主要成分为Brain infusion solids 12.5g/L， Beef heart infusion solids 5.0g/L， Proteose peptone 10.0g/L， Glucose 2.0g/L， Sodium chloride 5.0g/L， Di-sodium phosphate 2.5g/L， pH。
20、 7.40.2。 如需配置成固体， 需要添 加琼脂粉15g/L。 115灭菌30min， 冷却后待用。 0038 (2)培养变形链球菌生物膜的培养基为脑心浸液-蔗糖培养基， 即在脑心浸液培养 基中添加终浓度为1的蔗糖。 蔗糖需事先配成20贮存液并用0.22 m的无菌滤器过滤除 菌。 0039 (3)用无菌接种环将变形链球菌模式菌株UA159和分离自龋齿病人口腔中的变形 链球菌菌株6715-13在含有脑心浸液琼脂固体培养基的平板上进行划线， 倒置于37的厌 氧培养箱中培养直至出现明显的单菌落。 0040 (4)用无菌的接种铲刮取变形链球菌UA159和6715-13菌株， 分别转接到装有脑心 浸液。
21、液体培养基的试管中， 在37的厌氧培养箱中静置， 培养至液体浑浊。 0041 (5)用紫外可见分光光度计检测变形链球菌在600nm下的吸光度值(OD600nm)。 0042 (6)用分析天平精确称量化合物XQH-3-7， 加入DMSO将其溶解， 然后用孔径为0.22 m的无菌滤器过滤除菌， 配成终浓度为1024mg/L的贮存液， 存放于-20待用。 0043 实施例3： 化合物XQH-3-7对变形链球菌浮游细胞的活性检测 0044 (1)按照实施例2中描述的方法准备变形链球菌菌液和化合物XQH-3-7， 将培养制 对数期的变形链球菌UA159和6715-13菌液(OD600nm0.81.0)用。
22、脑心浸液培养基稀释至终 浓度为5105cfu/ml待用。 0045 (2)采用微量肉汤稀释法检测化合物XQH-3-7对变形链球菌UA159和6715-13浮游 细胞的最小抑菌浓度。 即将倍比稀释后不同浓度的化合物XQH-3-7溶液分别加到无菌的96 孔板中， 第1至第11孔为加药液的实验组， 第12孔为不加药作为生长对照组， 每个孔中变形 链球菌菌液终浓度为5105cfu/ml， 此时， 第1孔至第12孔药物浓度分别为256、 128、 64、 32、 16、 8、 4、 2、 1、 0.5、 0.25、 0 g/ml。 以在小孔内完全抑制细菌生长的最低浓度定位最小抑菌浓 度(MIC)。 00。
23、46 (3)将小孔内的菌液均匀涂布到脑心浸液琼脂固体培养基上后， 在37厌氧培养 箱中倒置培养24小时， 以没有细菌生产的最低浓度定位最小杀菌浓度(MBC)。 0047 (4)用酶标仪检测每个小孔内在600nm下的吸光度值， 计算每个药物浓度条件下细 胞的抑制率， 计算公式为抑制率(1-实验组/生长对照组)100， 所得数据使用SPSS统 计软件计算半数最大抑制浓度(IC50)， 实验结果如表1所示。 0048 表1.化合物XQH-3-7对变形链球菌UA159和6715-13浮游细胞的活性检测 说明书 4/5 页 6 CN 106699751 B 6 0049 0050 MIC： 最小抑菌浓度。
24、； MBC： 最小杀菌浓度； IC50： 半数最大抑制浓度 0051 从表1我们可以看出， 化合物XQH-3-7对变形链球菌UA159和6715-13浮游细胞具有 很好的抑菌活性和杀伤活性。 化合物XQH-3-7对变形链球菌UA159浮游细胞的活性要明显好 于变形链球菌6715-13。 0052 实施例4： 化合物XQH-3-7对变形链球菌生物膜的抑制活性 0053 (1)按照实施例2和3中描述的方法准备变形链球菌菌液和化合物XQH-3-7， 用脑心 浸液-蔗糖培养基将处于对数期的变形链球菌稀释至终浓度为5105cfu/ml待用。 0054 (2)向无菌的96孔板中加入(1)中的菌液150 l。
25、， 并以加入化合物XQH-3-7的孔(终 浓度4mg/L)作为实验组， 以不加化合物XQH-3-7的孔作为对照组。 放于37厌氧培养箱中静 置培养40小时。 0055 (3)将每个孔中的浮游细胞移走， 并用大量的水冲洗未吸附的细胞。 0056 (4)向每个孔中加入0.1的结晶紫溶液200 l， 在室温的条件下静置5min进行染 色， 然后移除结晶紫溶液， 并用大量水冲洗掉除去未吸附的结晶紫。 0057 (5)向每个孔中加入33的乙酸溶液200 l溶解吸附的结晶紫， 然后使用酶标仪检 测590nm下的吸光度值， 计算生物膜的抑制率， 计算公式同实施例1。 0058 结果显示， 当培养基中化合物XQH-3-7终浓度达到4mg/L时对变形链球菌UA159菌 株生物膜的抑制率为96.62， 对变形链球菌6715-13菌株生物膜的抑制率为96.18。 说明书 5/5 页 7 CN 106699751 B 7 。