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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710868096.7 (22)申请日 2017.09.22 (71)申请人 河南科技大学 地址 471003 河南省洛阳市涧西区西苑路 48号 (72)发明人 宋月芹孙会忠侯小改宋鹏 (74)专利代理机构 郑州睿信知识产权代理有限 公司 41119 代理人 牛爱周 (51)Int.Cl. C12N 1/02(2006.01) C12N 1/20(2006.01) C12Q 1/04(2006.01) (54)发明名称 一种产普鲁兰酶土著菌株的原位富集方法、 筛选方法 (5。
2、7)摘要 本发明涉及一种产普鲁兰酶土著菌株的原 位富集方法、 筛选方法。 本发明的产普鲁兰酶土 著菌株的原位富集方法包括： 将粘附有支链淀粉 的衬质埋入土壤， 富集后取出衬质， 收集衬质表 面的土壤， 得菌株富集土壤。 筛选方法还包括： 将 菌株富集土壤与无菌水混匀后离心， 取上层悬液 进行梯度稀释， 取梯度稀释液涂布分离平板进行 培养， 培养后进行鉴定。 本发明最大的特点是以 支链淀粉为初始诱导底物， 对产普鲁兰酶土著菌 株进行土壤中的原位富集， 可以使产普鲁兰酶种 群数量在原生态环境条件下得到增加， 尤其是可 以使一些具有产普鲁兰酶活性的弱势种群得到 一定的增殖， 进而提高目的菌株的检出率。
3、。 权利要求书1页 说明书5页 序列表1页 附图1页 CN 107541465 A 2018.01.05 CN 107541465 A 1.一种产普鲁兰酶土著菌株的原位富集方法， 其特征在于： 包括： 将粘附有支链淀粉的 衬质埋入土壤， 富集后取出衬质， 收集衬质表面的土壤， 得菌株富集土壤。 2.根据权利要求1所述的原位富集方法， 其特征在于： 所述埋入土壤富集的时间为8- 12d。 3.根据权利要求1所述的原位富集方法， 其特征在于： 所述衬质为脱脂棉。 4.根据权利要求1所述的原位富集方法， 其特征在于： 所述粘附有支链淀粉的衬质的制 备包括： 1)取支链淀粉溶于无菌水中， 得支链淀粉溶。
4、液； 2)取灭菌的衬质浸泡于支链淀粉溶液中， 充分吸附， 即得。 5.根据权利要求1所述的原位富集方法， 其特征在于： 所述埋入土壤的具体操作为： 在 采样环境土壤中挖出一个坑穴， 在坑穴中洒入无菌水， 取粘附有支链淀粉的衬质， 将衬质置 于穴底， 并用挖坑穴时的原位土将脱脂棉覆盖。 6.根据权利要求1所述的原位富集方法， 其特征在于： 取出衬质， 抖落多余土壤后再收 集衬质表面土壤。 7.采用如权利要求1所述原位富集方法的产普鲁兰酶土著菌株筛选方法， 其特征在于： 包括： 将菌株富集土壤与无菌水混匀后离心， 取上层悬液进行梯度稀释， 取梯度稀释液涂布 分离平板进行培养， 培养后进行鉴定。 8。
5、.根据权利要求7所述的产普鲁兰酶土著菌株筛选方法， 其特征在于： 所述鉴定为滴加 卢氏碘液进行鉴定， 有水解圈的为普鲁兰酶阳性菌株。 9.根据权利要求7所述的产普鲁兰酶土著菌株筛选方法， 其特征在于： 所述培养为于30 恒温倒置培养36-60h。 10.根据权利要求7、 8或9所述的产普鲁兰酶土著菌株筛选方法， 其特征在于： 所述分离 平板为加入普鲁兰糖的细菌培养基平板。 权利要求书 1/1 页 2 CN 107541465 A 2 一种产普鲁兰酶土著菌株的原位富集方法、 筛选方法 技术领域 0001 本发明涉及一种产普鲁兰酶土著菌株的原位富集方法、 筛选方法， 属于细菌富集 筛选技术领域。 。
6、背景技术 0002 微生物是自然界生物资源和物质循环的重要组成部分， 普遍认为， 人们所认知的 微生物种类仅是实际存量的1-10， 有人甚至认为不到0.1， 因此， 野生微生物资源的 筛选仍然是一项长期而艰巨的工作。 淀粉是人们生活中消耗量巨大的一种多糖化合物， 天 然淀粉由10-30的直链淀粉和70-90支链淀粉组成， 而淀粉利用率的高低主要取决 于对支链淀粉利用率的高低。 支链淀粉中含有的 -1， 6糖苷键难以水解， 成为淀粉高效利用 中的瓶颈问题， 而普鲁兰酶专性水解淀粉中的 -1， 6糖苷键。 0003 产普鲁兰酶菌株的筛选方法目前主要还是通过平板培养， 在筛选过程中虽然有增 加材料多。
7、样性和培养基成分优化等方面的探索改良措施， 但产普鲁兰酶菌株的筛选并未获 得实质性突破。 现有技术中常采用直接取土壤进行筛选鉴定的方法， 如烤烟根际土壤产普 鲁兰酶菌株的分离鉴定及产酶活性(湖南农业科学， 朱金峰、 孙会忠等)； 或取土壤进行室内 富集后， 再进行筛选鉴定。 传统的产普鲁兰酶土著菌株的富集方法一般也能分离到少数菌 株， 但存在的问题也显而易见， 这些不足集中体现在： (1)分离方法太过程序化和单一， 分离 到的菌株重复率极高， 多样性差， 鲜有创新性研究结果； (2)分离培养前进行一定时间的富 集培养显然比不进行富集的针对性更强， 效果略好， 但离体富集也有样品的富集环境与自 。
8、然环境仍然存在着本质上不同的天然缺陷。 任何微生物都有其依赖的生境， 生境改变自然 会导致种群组成改变， 尤其是对一些弱势或稀有种群， 不当的处理更容易造成分离过程中 的丢失。 0004 由于现有技术中产普鲁兰酶菌株筛选的检出率并不高， 即便是可以筛选出个别产 普鲁兰酶菌株， 但菌株的多样性远不够丰富， 重复筛选情况突出， 而且生物活性普遍偏低， 绝大部分工业开发和应用潜力不高。 增加产普鲁兰酶野生菌株的多样性及获得高活性菌株 仍然是人们渴望实现的重要研究目标。 发明内容 0005 本发明的目的是提供一种产普鲁兰酶土著菌株的原位富集方法， 该方法可以提高 土著产普鲁兰酶菌株筛出的多样性和检出率。
9、。 0006 本发明还提供了采用上述原位富集方法的产普鲁兰酶土著菌株筛选方法。 0007 为了实现上述目的， 本发明所采用的技术方案是： 0008 一种产普鲁兰酶土著菌株的原位富集方法， 包括： 将粘附有支链淀粉的衬质埋入 土壤， 富集后取出衬质， 收集衬质表面的土壤， 得菌株富集土壤。 0009 优选的， 所述埋入土壤富集的时间为8-12d。 0010 在本发明技术方案中， 最大的特点是以支链淀粉为初始诱导底物， 对产普鲁兰酶 说明书 1/5 页 3 CN 107541465 A 3 土著菌株进行土壤中的原位富集， 可以使产普鲁兰酶种群数量在原生态环境条件下得到增 加， 尤其是可以使一些具有。
10、产普鲁兰酶活性的弱势种群得到一定的增殖， 进而提高目的土 著菌株的检出率。 本发明技术创新的基本原理是： 微生物赖以生存的土壤是一个极其复杂 的特殊环境， 这个环境无法实现人工的百分百拟合， 在原土壤环境中实现特定微生物种群 的富集符合微生物与土壤环境协同进化原理； 支链淀粉含有 -1， 6糖苷键， 以其为底物在原 生态位环境条件下， 更容易使产普鲁兰酶土著菌株得到富集， 进而增加产普鲁兰酶菌株的 多样性。 0011 优选的， 所述衬质为脱脂棉。 原位富集过程中以脱脂棉作为支链淀粉的衬质， 一是 可以增加单位面积内支链淀粉与微生物接触的机会， 二是脱脂棉短期内不易腐烂， 且无毒 害作用， 便于。
11、精确收集富集土壤。 0012 本发明的衬质也可以选用本领域符合条件(衬质选用的原则是天然物、 透气、 不易 腐烂、 短期内不改变土壤的理化环境、 能高温灭菌)的衬质载体。 0013 所述粘附有支链淀粉的衬质的制备包括： 0014 1)取15-20g支链淀粉溶于50mL无菌水中， 得支链淀粉溶液； 0015 2)取4-6g灭菌的衬质浸泡于支链淀粉溶液中， 充分吸附， 得粘附有支链淀粉的衬 质。 0016 所述埋入土壤的具体操作为： 在采样环境土壤中挖出一个选定深度的坑穴， 在坑 穴中洒入无菌水， 取粘附有支链淀粉的衬质， 将衬质整理成扁平长方体， 平展置于穴底， 并 用挖坑穴时的原位土将脱脂棉覆。
12、盖。 0017 所述埋入土壤的具体操作为： 在采样环境土壤中挖出一个5-10cm深的坑穴， 在坑 穴中洒入100-150mL无菌水， 取粘附有支链淀粉的衬质， 将衬质整理成扁平长方， 平展置于 穴底， 并用挖坑穴时的原位土将脱脂棉覆盖。 原位富集过程中浸有支链淀粉的脱脂棉置土 的环境和深度可以结合试验目的和意向进行多样化处理， 一定程度上克服了传统筛选试验 中取样的盲目性、 偶然性和低效率， 从而使试验变得更加可控和高效。 0018 优选的， 取出衬质， 抖落多余土壤后再收集衬质表面土壤。 由于衬质在土中埋的时 间比较长， 在取出时会带有块状土壤， 这些附带的土壤未与脱脂棉接触， 因此存在的产。
13、普鲁 兰酶菌株较少， 因此将这些土抖落后， 取与脱脂棉表面的土壤即可。 0019 采用上述原位富集方法的产普鲁兰酶土著菌株筛选方法， 包括： 将菌株富集土壤 与无菌水混匀后离心， 取上层悬液进行梯度稀释， 取梯度稀释液涂布分离平板进行培养， 培 养后进行鉴定。 0020 优选的， 将菌株富集土壤与无菌水混匀后离心， 取上层悬液进行10倍梯度稀释， 取 10-4、 10-5、 10-6梯度稀释液涂布分离平板进行培养， 培养后进行鉴定。 0021 上述的产普鲁兰酶土著菌株筛选方法， 包括： 称取5g富集土壤加入装有45mL无菌 水及玻璃珠的锥形瓶中， 室温下于150r/min震荡30min， 静置。
14、5min， 取上层菌悬液进行10倍 梯度稀释， 取10-4、 10-5、 10-6梯度稀释液涂布分离平板进行培养， 培养后进行鉴定。 梯度稀释 涂板， 可以避免由于菌株过多造成的菌株过于密集难以区分的现象。 其中玻璃珠的作用为 辅助震荡溶解， 加入适量即可。 0022 所述鉴定为滴加卢氏碘液进行鉴定， 有水解圈的为普鲁兰酶阳性菌株。 所述培养 为于30恒温倒置培养36-60h。 所述分离平板为加入普鲁兰糖的细菌培养基平板。 说明书 2/5 页 4 CN 107541465 A 4 0023 原位富集将是土著微生物资源分离筛选的必然趋势， 本发明技术方案目的明确， 效果可靠， 制备过程便于操作。。
15、 可以用作土著细菌富集， 也可以推广到放线菌和真菌等微生 物资源的富集筛选工作中。 附图说明 0024 图1为试验例1中筛选菌株水解圈示意图。 具体实施方式 0025 下面结合具体实施例对本发明做进一步的详细说明。 0026 实施例1 0027 本实施例中产普鲁兰酶土著菌株的原位富集方法， 包括： 0028 A.底物处理 0029 在超净工作台中取5g灭菌脱脂棉放入装有15g支链淀粉和50mL无菌水的灭菌烧杯 中， 并翻动脱脂棉， 尽量使支链淀粉渗入和粘附于脱脂棉， 将前处理好的脱脂棉块无菌保 存。 0030 B.置土原位富集 0031 在采样环境土壤(洛阳郊区洛河两岸荒地土壤)中挖出一个5c。
16、m深的坑穴， 在坑穴 中洒入100mL无菌水， 取出步骤A处理好的脱脂棉块， 将棉块整理成长方形(以不断裂为准)， 平展置于穴底， 并用挖坑穴时的原位土将脱脂棉覆盖。 经过8d的原位富集， 小心取出脱脂棉 块， 抖落多余土壤后， 在超净工作台中收集脱脂棉表面土壤作为稀释涂板培养的土样。 0032 本实施例中产普鲁兰酶土著菌株筛选方法， 包括： 0033 称取5g上述富集土壤加入装有45mL无菌水及少量玻璃珠的锥形瓶中， 室温下于 150r/min震荡30min， 静置5min， 取上层菌悬液进行10倍梯度稀释， 取10-4、 10-5、 10-6梯度稀 释液涂布分离平板(普鲁兰糖作为底物)进行。
17、培养。 30恒温倒置培养48h。 滴加卢氏碘液检 测菌落是否具有水解圈， 有水解圈的为能产普鲁兰酶的菌株。 0034 分离平板中培养基的配方为： 糯米淀粉10-12g/L， 蛋白胨8g/L， 酵母粉2g/L， MgSO47H2O 0.5g/L， K2HPO4 1g/L， 琼脂18g/L， pH 7.0。 0035 实施例2 0036 本实施例中产普鲁兰酶土著菌株的原位富集方法， 包括： 0037 A.底物处理 0038 在超净工作台中取5g灭菌脱脂棉放入装有20g支链淀粉和50mL无菌水的灭菌烧杯 中， 并翻动脱脂棉， 尽量使支链淀粉渗入和粘附于脱脂棉， 将前处理好的脱脂棉块无菌保 存。 00。
18、39 B.置土原位富集 0040 在采样环境土壤(洛阳郊区玉米田耕作层土壤)中挖出一个10cm深的坑穴， 在坑穴 中洒入150mL无菌水， 取出步骤A处理好的脱脂棉块， 将棉块整理成长方形(以不断裂为准)， 平展置于穴底， 并用挖坑穴时的原位土将脱脂棉覆盖。 经过12d的原位富集， 小心取出脱脂 棉块， 抖落多余土壤后， 在超净工作台中收集脱脂棉表面土壤作为稀释涂板培养的土样。 0041 本实施例中产普鲁兰酶土著菌株筛选方法， 包括： 说明书 3/5 页 5 CN 107541465 A 5 0042 称取5g富集土壤加入装有45mL无菌水及少量玻璃珠的锥形瓶中， 室温下于180r/ min震。
19、荡30min， 静置10min， 取上层菌悬液进行10倍梯度稀释， 取10-4、 10-5、 10-6梯度稀释液 涂布分离平板(普鲁兰糖作为底物)进行培养。 30恒温倒置培养48h。 滴加卢氏碘液检测菌 落是否具有水解圈， 有水解圈的为能产普鲁兰酶的菌株。 0043 分离平板中培养基的配方为： 糯米淀粉10-12g/L， 蛋白胨8g/L， 酵母粉2g/L， MgSO47H2O 0.5g/L， K2HPO4 1g/L， 琼脂18g/L， pH 7.0。 0044 对比例1 0045 本对比例中产普鲁兰酶土著菌株筛选方法， 包括： 0046 1)样品采集： 将与实施例1相同的洛阳郊区洛河两岸荒地土。
20、壤采回到实验室； 0047 2)富集方法： 室内摇床富集。 0048 取土样10g， 用100mL无菌生理盐水浸泡lh， 摇匀， 吸1.0mL于50mL富集培养基(糯米 淀粉10-12g/L， 蛋白胨8g/L， 酵母粉2g/L， MgSO47H2O 0.5g/L， K2HPO4 1g/L， pH 7.0)的三 角瓶中， 室温或32条件下振荡富集培养18h-20h， 取培养液进行10倍梯度稀释， 取10-4-10 -6梯度稀释液涂布分离平板培养。 0049 分离平板中培养基的配方为： 糯米淀粉10-12g/L， 蛋白胨8g/L， 酵母粉2g/L， MgSO47H2O 0.5g/L， K2HPO4。
21、 1g/L， 琼脂18g/L， pH 7.0。 0050 对比例2 0051 本对比例中产普鲁兰酶土著菌株筛选方法， 包括： 0052 1)样品采集： 将与实施例2相同的洛阳郊区玉米田耕作层土壤采回到实验室； 0053 2)富集方法： 室内摇床富集。 0054 取土样10g， 用100mL无菌生理盐水浸泡lh， 摇匀， 吸1.0mL于50mL富集培养基(糯米 淀粉10-12g/L， 蛋白胨8g/L， 酵母粉2g/L， MgSO47H2O 0.5g/L， K2HPO4 1g/L， pH 7.0)的三 角瓶中， 室温或32条件下振荡富集培养18h-20h， 取培养液进行10倍梯度稀释， 取10-4。
22、-10 -6梯度稀释液涂布分离平板培养。 0055 分离平板中培养基的配方为： 糯米淀粉10-12g/L， 蛋白胨8g/L， 酵母粉2g/L， MgSO47H2O 0.5g/L， K2HPO4 1g/L， 琼脂18g/L， pH 7.0。 0056 试验例1 0057 以洛阳郊区洛河两岸荒地土壤为例， 采用实施例1及对比例的产普鲁兰酶土著菌 株筛选方法， 分离菌株。 0058 实施例1中的方法设置3次重复， 每个稀释梯度分别取0.1mL涂布3个平板， 统计分 析具有明显区别特征的菌落数。 菌落统计数如表2所示， 实施例1的筛选结果如图1-A所示； 对比例的筛选结果如图1-C所示， 实验结果表明。
23、使用本发明技术分离筛选产普鲁兰酶土著 菌株获得的具有水解圈的菌落数明显多于对照组。 0059 将鉴定获得的菌株进行划线纯化， 然后用普鲁兰糖鉴别培养基(配方为： 普鲁兰糖 1.5g/L， 蛋白胨8g/L， 酵母粉2g/L， MgSO47H2O 0.5g/L， K2HPO4 1g/L， 琼脂18g/L， pH 7.0。 ) 鉴定这些菌株对普鲁兰糖的降解效果， 实施例1的筛选菌株鉴定结果如图1-B所示， 对比例1 的筛选菌株鉴定结果如图1-D所示。 从图中可以看出本发明的筛选方法筛选得到的菌株对 于普鲁兰糖的降解效果较好。 这说明本发明技术方法是有效的， 可行的， 是一项值得推广应 用的产普鲁兰酶。
24、土著菌株分离筛选技术。 说明书 4/5 页 6 CN 107541465 A 6 0060 表1产普鲁兰酶土著菌株原位富集后的分离效果 0061 设置具有区别特征的菌落数具有水解圈的菌落数 对比例32 实施例1(重复1)84 实施例1(重复2)115 实施例1(重复3)95 0062 试验例2 0063 以洛阳郊区玉米田耕作层土壤为例， 采用实施例2及对比例的产普鲁兰酶土著菌 株筛选方法， 分离菌株。 0064 实施例2中的筛选方法设置3次重复， 每个稀释梯度分别取0.1mL涂布3个平板， 统 计分析具有明显区别特征的菌落数。 采用细菌的通用引物(F： 5 -AGAGTTTGATCCTGGCT。
25、CAG- 3 ， R： 5 -AAGGAGGTGWTCCARCC-3 )对分离到的具有普鲁兰酶活性菌株的16S rDAN进行扩 增， 将扩增产物测序， 根据测序的序列结果分析鉴定菌株的种属， 结果如表2所示。 0065 表2产普鲁兰酶土著菌株原位富集后的分离效果 0066 0067 从表2可以看出， 从采用本发明技术方法分离到的菌落中， 鉴定出分属于不同属的 5种菌株； 对比例方法分离到普鲁兰酶活性菌株则分属于两个属。 进一步说明本发明技术方 法是有效、 可行的， 具有明显优势。 说明书 5/5 页 7 CN 107541465 A 7 河南科技大学 一种产普鲁兰酶土著菌株的原位富集方法、 筛选方法 2 SIPOSequenceListing 1.0 20 DNA 人工序列 16S rDAN正向引物序列 1 agagtttgat cctggctcag 20 17 DNA 人工序列 16S rDAN反向引物序列 2 aaggaggtgw tccarcc 17 序列表 1/1 页 8 CN 107541465 A 8 图1 说明书附图 1/1 页 9 CN 107541465 A 9 。