牛尾菜甾体皂苷提取物及其制备方法和用途 【技术领域】
本发明属于医药领域，涉及牛尾菜甾体皂苷提取物及其制备方法，还涉及牛尾菜甾体皂苷提取物在制备预防和/或治疗类风湿性关节炎产品中的用途。
背景技术
类风湿性关节炎是一种常见的以关节组织慢性炎症性病变为主要表现的自身免疫性疾病。其主要的病理变化为关节滑膜细胞浸润，滑膜翳形成，软骨与骨组织的侵蚀。类风湿性关节炎治疗的目的是阻止病程发展，即阻止关节炎症和破坏进程，预防功能丧失。虽然治疗措施很多，但药物治疗仍是基础。目前治疗药物包括非甾体抗炎药、甾体抗炎药和疾病调修抗风湿病药，但这些药物均存在明显的不良反应。随着对炎症过程、分子遗传学和生物技术发展，对病原学机制的认识不断深入，研究者努力寻找具有特异性的治疗药物。主要以炎性细胞因子为靶点、以炎症介质为靶点、以免疫活性细胞表面抗原为靶点、以信号转导通路为靶点。
百合科菝葜属植物牛尾菜Smilax riparia A.DC的根和根茎资源丰富，具有补气活血，舒筋通络之功效，主治气虚浮肿，筋骨疼痛，偏瘫，头晕头痛，咳嗽吐血，骨结核，白带[江苏新医学院.中药大辞典，上海科学技术出版社，1985：427.]。Sashida Y等从牛尾菜中分离鉴定了2个甾体皂苷类化合物新替告皂苷元3-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖苷，新替告皂苷元3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(1→4)-[α-L-吡喃鼠李糖基-(1→6)]-β-D-吡喃葡萄糖苷][Sashida Y，et al.Phytochemistry，31(7)：2439-2443.]；Li J等从牛尾菜中分离鉴定了2个甾体皂苷类化合物3-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-[α-L-吡喃鼠李糖基-(1→6)]-β-D-吡喃葡萄糖-3β，20α-二醇-5α-呋甾-22(23)-烯-26-O-β-D-吡喃葡萄糖苷，3-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-[α-L-吡喃鼠李糖基-(1→6)]-β-D-吡喃葡萄糖-3β，16β-二醇-5α-孕甾-20-酮-16-O-[5-羟基-4-甲基-戊酸-5-O-β-D-吡喃葡萄糖酯][Li J，et al.Chem Pharm Bull，54(10)：1451-1454.]。目前未见高含量牛尾菜甾体皂苷提取物，特别是其中含有4种新化合物的一种或多种的产品；未见有关牛尾菜甾体皂苷在预防和/或治疗类风湿性关节炎生物活性方面的研究报道。
【发明内容】
本发明的目的是开发利用迄今为止应用尚不广泛的百合科菝葜属植物牛尾菜Smilaxriparia A.DC，尤其是其甾体皂苷类成分。
本案发明人通过对牛尾菜进行细致深入的研究，发明了牛尾菜甾体皂苷提取物提取分离纯化方法，进一步对提取物化学成分进行了研究，分离鉴定了提取物中含量高的化合物4种，均为新化合物，制得的提取物经药理活性研究证明，具有抗类风湿性关节炎作用，因而完成了本发明。
本发明提供一种牛尾菜甾体皂苷提取物及其制备方法和用途。
本发明的牛尾菜甾体皂苷提取物中甾体皂苷重量百分含量为50～95％。
本发明提供牛尾菜甾体皂苷提取物的制备方法，该方法包括以下步骤：
a)牛尾菜粗粉用第一溶剂回流提取，滤过，提取液合并，提取液减压浓缩；
b)将步骤a)获得的提取物加水溶解，经大孔吸附树脂柱色谱，用水洗脱至洗脱液近无色，弃去洗脱液；
c)用第二溶剂洗脱至洗脱液近无色，弃去洗脱液；
d)用第三溶剂洗脱至洗脱液近无色，收集洗脱液；
e)将步骤d)获得的洗脱液，经脱色树脂柱D941色谱，用第四溶剂洗脱，收集洗脱液，减压浓缩、干燥得牛尾菜甾体皂苷提取物。
在以上步骤中，其中步骤a)的第一溶剂为0～100％乙醇水溶液；步骤b)大孔吸附树脂包括非极性或弱极性大孔吸附树脂。步骤c)的第二溶剂为10～50％乙醇水溶液，步骤d)的第三溶剂为60～90％乙醇水溶液，步骤e)的第四溶剂为90％乙醇水溶液。
本发明提供牛尾菜甾体皂苷提取物的制备方法，优选的包括以下步骤：
a)牛尾菜粗粉加50～70％乙醇回流提取，滤过，提取液合并，减压回收乙醇；
b)将步骤a)获得的提取物加水溶解，经大孔吸附树脂柱D101色谱，用水洗脱至洗脱液近无色，弃去洗脱液；
c)用30％乙醇洗脱至洗脱液近无色，弃去洗脱液；
d)用70％乙醇洗脱至洗脱液近无色，收集洗脱液；
e)将步骤d)获得的洗脱液，经脱色树脂柱D941色谱，6倍柱体积90％乙醇洗脱，收集洗脱液，减压浓缩、干燥得牛尾菜甾体皂苷提取物。
本发明的牛尾菜甾体皂苷提取物，从牛尾菜根和根茎中提取，从中分离得到4种新化合物，化学结构鉴定如下：
化合物(1)：16-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(22S)-胆甾-5-烯-3β，16β，22-三醇-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-[α-L-吡喃鼠李糖基-(1→6)]-β-D-吡喃葡萄糖苷
无定形固体，Liebermann-Burchard反应呈蓝绿色，Molish反应呈紫色，1H-NMR和13C-NMR谱显示甾体皂苷类化合物的特征，推测化合物(1)为甾体皂苷类化合物。
HR-ESI MS显示准分子离子峰m/z 1033.5499[M-H]-，结合13C-NMR和DEPT数据推测分子式为C51H86O21(计算值C51H85O21相对分子质量1033.5583)。1H-NMR谱示有甲基质子信号δ0.90(3H，s)，0.94(3H，d，J＝6.2Hz)，0.95(3H，d，J＝6.0Hz)，0.99(3H，s)，1.21(3H，d，J＝7.2Hz)，与氧相连的次甲基质子信号δ3.82(1H，m)，4.31(1H，m)，4.53(1H，m)，烯氢质子信号δ5.28(1H，br d)。13C-NMR示有51个碳信号，其中27个甾体母核碳信号，结合DEPT和HMQC谱推测结构中含有5个CH3，9个CH2，10个CH(其中3个与氧相连δ73.23，78.20，82.68，1个烯碳δ121.87)，3个季碳(其中1个烯碳δ140.96)。综合解析以上数据并和文献[Yin J，et al.J Nat Prod，2003，66：646-650]对照，推测化合物(1)苷元为(22S)-胆甾-5-烯-3β，16β，22-三醇，比较16-O-β-D-吡喃葡萄糖-(22S，25S)-胆甾-5-烯-3β，16β，22，26-四醇-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-[α-L-吡喃鼠李糖基-(1→4)]-β-D-吡喃葡萄糖苷和26-O-β-D-吡喃葡萄糖-(22R，25R)-胆甾-5-烯-3β，16β，22，26-四醇-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖苷C-22化学位移进一步证实22S构型[Sang S M，et al.Food Chem，2003，：499-506.；Hayes P Y，et al.Phytochemistry，2008，68：623-630.]，NOESY谱显示16-H/22-H相关信号，进一步证实16-OH相对构型为β构型。
1H-NMR示有四个糖端基质子信号δ4.74(1H，d，J＝7.8Hz)，4.89(1H，d，J＝7.2Hz)，5.37(1H，br s)和5.64(1H，br s)，两个鼠李糖特征甲基质子信号δ1.65(3H，d，J＝6.2Hz)和1.71(3H，d，J＝6.2Hz)；13C-NMR示有四个糖端基碳信号δ102.01，102.83，102.89和107.00，两个鼠李糖特征甲基碳信号δ18.51和18.66。化合物(1)经酸水解后HPLC法鉴定结构中存在D-葡萄糖和L-鼠李糖[Guo H z，et al.Phytochemistry，2004，65：481-484.]；1H-NMR显示葡萄糖端基质子偶和常数J＝7.2和J＝7.8Hz推测葡萄糖为β构型，13C-NMR显示鼠李糖C-5位化学位移分别为δ69.84和70.61推测鼠李糖为α构型[Shao B，et al.Phytochemistry，2007，68：623-630.]。综合解析1H-NMR，13C-NMR，DEPT，HMQC，HMBC谱并和文献对照，化合物(1)糖部分数据与Riparoside A相同[Li J，et al.Chem PharmBull，2006，10：1451-1454.]。HMBC谱显示葡萄糖端基质子δ4.74与苷元16位碳δ82.68远程相关信号，推测结构中存在16-O-β-D-吡喃葡萄糖基。HMBC谱显示葡萄糖端基质子δ4.89与苷元3位碳δ78.20，鼠李糖端基质子δ5.64与葡萄糖2位碳δ79.50，鼠李糖端基质子δ5.37与葡萄糖6位碳δ67.08远程相关信号，推测结构中存在3-O-α-L鼠李糖-(1→2)-[α-L-鼠李糖-(1→6)]-β-D-吡喃葡萄糖基。综合分析以上数据，鉴定化合物(1)为16-O-β-D-吡喃葡萄糖-(22S)-胆甾-5-烯-3β，16β，22-三醇-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-[α-L-吡喃鼠李糖基-(1→6)]-β-D-吡喃葡萄糖苷。该化合物未见文献报道。1H-NMR和13C-NMR数据数据见表1。
表1化合物(1)1H-NMR和13C-NMR数据(C5D5N)
化合物(2)：26-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(25S)-呋甾-5，20(22)-二烯-3β，26-二醇-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-[α-L-吡喃鼠李糖基-(1→6)]-βD-吡喃葡萄糖苷
无定形固体，Liebermann-Burchard反应呈蓝绿色，Molish反应呈紫色，Ehrlich试剂反应呈红色，1H-NMR和13C-NMR谱显示甾体皂苷类化合物的特征，推测化合物(2)为呋甾皂苷类化合物。
HR-ESI MS显示准分子离子峰m/z 1029.5331[M-H]-，结合13C-NMR数据推测分子式为C51H82O21(计算值C51H81O21相对分子质量1029.5270)。1H-NMR谱示有甲基质子信号δ0.72(3H，s)，0.92(3H，s)，1.05(3H，d，J＝6.6Hz)，1.64(3H，s)，与氧相连的次甲基质子信号δ3.97(1H，m)，4.81(1H，m)与氧相连的偕质子信号δ3.50(1H，dd，J＝9.4，7.0Hz)和4.07(1H，dd，J＝9.0，6.0Hz)。13C-NMR示有51个碳信号，其中27个甾体母核碳信号，结合HMQC谱推测结构中含有4个CH3，10个CH2(其中1个与氧相连δ75.25)，8个CH(其中2个与氧相连δ78.49，84.53，1个烯碳δ121.67)，5个季碳(其中3个烯碳δ103.54，141.08，152.52)。NMR谱示有5，20(22)-二烯-呋甾皂苷元的典型特征δ1.64(3H，s，H-21)质子信号，δ103.54(C-20)，121.67(C-6)，141.08(C-5)，152.52(C-22)碳信号[YokosukaA，et al.J Nat Prod，2002，65：1293-1298.]。H2-26谐质子的化学位移差值δa-δb＝0.57，推测25S构型，而25R构型化学位移差值δa-δb＜0.48[Agrawal P K.Steroids，2005，70：715-724.]，13C-NMR谱示有δ33.77(C-25)，75.25(C-26)和17.21(C-27)碳信号进一步证实25S构型[YokosukaA，et al.J Nat Prod，2002，65：1293-1298.；Dong M，etal.Tetrahedron，2001，74：501-506.]。综合解析以上数据并和文献对照[Yokosuka A，et al.J Nat Prod，2002，65：1293-1298.]，鉴定化合物(2)苷元为(25S)-呋甾-5，20(22)-二烯-3β，26-二醇。
1H-NMR示有四个糖端基质子信号δ4.84(1H，d，J＝7.8Hz)，4.91(1H，d，J＝7.8Hz)，5.37(1H，br s)和5.65(1H，br s)，两个鼠李糖特征甲基质子信号δ1.67(3H，d，J＝6.2Hz)和1.71(3H，d，J＝6.2Hz)；13C-NMR示有四个糖端基碳信号δ101.99，102.80，102.88和105.19，两个鼠李糖特征甲基碳信号δ18.50和18.67。化合物(2)经酸水解后HPLC法鉴定结构中存在D-葡萄糖和L-鼠李糖[Guo H Z，et al.Phytochemistry，2004，65：481-484.]；1H-NMR显示葡萄糖端基质子偶和常数J＝7.8Hz推测葡萄糖为β构型，13C-NMR显示鼠李糖C-5位化学位移分别为δ69.83和70.61推测鼠李糖为α构型[Shao B，et al.Phytochemistry，2007，68：623-630.]。综合解析1H-NMR，13C-NMR，HMQC，HMBC谱并和文献对照，化合物(2)糖部分数据与Riparoside A相同[Li J，et al.Chem Pharm Bull，2006，10：1451-1454.]。HMBC谱显示葡萄糖端基质子δ4.84与苷元26位碳δ75.25远程相关信号，推测结构中存在26-O-β-D-吡喃葡萄糖基。HMBC谱显示葡萄糖端基质子δ4.91与苷元3位碳δ78.49，鼠李糖端基质子δ5.37与葡萄糖6位碳δ67.08，鼠李糖端基质子δ5.65与葡萄糖2位碳δ79.50远程相关信号，推测结构中存在3-O-α-L鼠李糖-(1→2)-[α-L-鼠李糖-(1→6)]-β-D-吡喃葡萄糖基。综合分析以上数据，鉴定化合物(2)为26-O-β-D-吡喃葡萄糖-(25S)-呋甾-5，20(22)-二烯-3β，26-二醇-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-[α-L-吡喃鼠李糖基-(1→6)]-β-D-吡喃葡萄糖苷。该化合物未见文献报道。1H-NMR和13C-NMR数据数据见表2。
表2化合物(2)1H-NMR和13C-NMR数据(C5D5N)
化合物(3)：26-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(25S)-5α-呋甾-20(22)-烯-3β，26-二醇-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-[α-L-吡喃鼠李糖基-(1→6)]-β-D-吡喃葡萄糖苷
无定形固体，Liebermann-Burchard反应呈蓝绿色，Molish反应呈紫色，Ehrlich试剂反应呈红色，1H-NMR和13C-NMR谱显示甾体皂苷类化合物的特征，推测化合物(3)为呋甾皂苷类化合物。
HR-ESI MS显示准分子离子峰m/z 1031.5412[M-H]-，结合13C-NMR和DEPT数据推测分子式为C51H84O21(计算值C51H83O21相对分子质量1031.5427)。1H-NMR谱示有甲基质子信号δ0.70(3H，s)，0.71(3H，s)，1.06(3H，d，J＝6.7Hz)，1.65(3H，s)，与氧相连的次甲基质子信号δ3.97(1H，m)，4.81(1H，m)，与氧相连的偕质子信号δ3.52(1H，dd，J＝9.5，6.9Hz)和4.09(1H，dd，J＝9.4，5.8Hz)。13C-NMR示有51个碳信号，其中27个甾体母核碳信号，结合DEPT和HMQC谱推测结构中含有4个CH3，11个CH2(其中1个与氧相连δ75.37)，8个CH(其中2个与氧相连δ78.03，84.67)，4个季碳(其中2个烯碳δ103.77，152.53。NMR谱示有20(22)-烯-呋甾皂苷元的典型特征δ1.65(3H，s，H-21)质子信号，δ103.77(C-20)，152.53(C-22)碳信号[Yokosuka A，et al.J Nat Prod，2002，65：1293-1298.]。H2-26谐质子的化学位移差值δa-δb＝0.57，推测25S构型，而25R构型化学位移差值δa-δb＜0.48[Agrawal P K.Steroids，2005，70：715-724.]，13C-NMR谱示有δ33.83(C-25)，75.37(C-26)和17.32(C-27)碳信号进一步证实25S构型[Oleszek W，et al.JAgric Food Chem，2001，49：4392-4396.；Bedir E，et al.J Nat Prod，2000，63：1699-1701.]。13C-NMR谱示有δ44.79(C-5)，54.47(C-9)和12.44(C-19)碳信号，推测A/B环trans构型，5α-呋甾皂苷[WooMH，et al.J Nat Prod，1992，55：1129-1135.；Sautour M，et al.JNat Prod，2005，68：1489-1493.]。NOESY谱显示5-H/9-H，5-H/14-H，9-H/14-H，11-H/19-H3，11-H/18-H3，16-H/17-H相关信号，推测A/B环trans，B/C和C/D环trans，D/E环cis构型。综合解析以上数据并和文献[Yokosuka A，et al.J Nat Prod，2002，65：1293-1298.]对照，鉴定化合物(3)苷元为25(S)-5a-呋甾-20(22)-烯-3β，26-二醇。
1H-NMR示有四个糖端基质子信号δ4.84(1H，d，J＝7.7Hz)，4.94(1H，d，J＝7.8Hz)，5.40(1H，d，J＝0.8Hz)和5.64(1H，br s)，两个鼠李糖特征甲基质子信号δ1.67(3H，d，J＝6.2Hz)和1.71(3H，d，J＝6.2Hz)；13C-NMR示有四个糖端基碳信号δ102.19，102.32，102.94和105.21，两个鼠李糖特征甲基碳信号δ18.58和18.76。化合物(3)经酸水解后HPLC法鉴定结构中存在D-葡萄糖和L-鼠李糖[Guo H Z，et al.Phytochemistry，2004，65：481-484.]；1H-NMR显示葡萄糖端基质子偶和常数J＝7.7和J＝7.8Hz推测葡萄糖为β构型，13C-NMR显示鼠李糖C-5位化学位移分别为δ69.92和70.72推测鼠李糖为α构型[Shao B，et al.Phytochemistry，2007，68：623-630.]。综合解析1H-NMR，13C-NMR，DEPT，HMQC，HMBC谱并和文献对照，化合物(3)糖部分数据与Riparoside A相同[LiJ，et al.Chem PharmBull，2006，10：1451-1454.]。HMBC谱显示葡萄糖端基质子δ4.84与苷元26位碳δ75.37远程相关信号，推测结构中存在26-O-β-D-吡喃葡萄糖基。HMBC谱显示葡萄糖端基质子δ4.94与苷元3位碳δ78.03，鼠李糖端基质子δ5.40与葡萄糖6位碳δ67.42，鼠李糖端基质子δ5.64与葡萄糖2位碳δ79.71远程相关信号，推测结构中存在3-O-α-L鼠李糖-(1→2)-[a-L-鼠李糖-(1→6)]-β-D-吡喃葡萄糖基。综合分析以上数据，鉴定化合物(3)为26-O-β-D-吡喃葡萄糖-(25S)-5α-呋甾-20(22)-烯-3β，26-二醇-3-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-[α-L-吡喃鼠李糖基-(1→6)]-β-D-吡喃葡萄糖苷。该化合物未见文献报道。1H-NMR和13C-NMR数据数据如表3。
表3化合物(3)1H-NMR和13C-NMR数据(C5D5N)
化合物(4)：新替告皂苷元3-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-[α-L-吡喃鼠李糖基-(1→6)]-β-D-吡喃葡萄糖苷
白色粉末，Liebermann-Burchard反应呈蓝绿色，Molish反应呈紫色，Ehrlich试剂反应呈阴性，1H-NMR和13C-NMR谱显示甾体皂苷类化合物的特征，推测化合物(4)为螺甾皂苷类化合物。
HR-ESI MS显示准分子离子峰m/z 869.4877[M-H]-，结合13C-NMR数据推测分子式为C45H74O16(计算值C45H73O16相对分子质量869.4899)。1H-NMR谱示有甲基质子信号δ0.67(3H，s)，0.82(3H，s)，1.09(3H，d，J＝7.2Hz)，1.20(3H，d，J＝7.1Hz)。13C-NMR谱示有45个碳信号，其中27个甾体母核碳信号，结合HMQC谱推测结构中含有4个CH3，11个CH2，9个CH(其中2个与氧相连δ77.87，81.27)，3个季碳。13C-NMR谱示有δ16.36(C-27)碳信号，推测25S构型，而25R构型δ17.06(C-27)[SautourM，et al.J Nat Prod，2005，68：1489-1493.；Sautour M，et al.Planta Med，2006，72：667-670.]。13C-NMR谱示有δ44.68(C-5)，54.44(C-9)和12.35(C-19)碳信号，推测A/B环trans构型，5α-螺甾皂苷[Roboson V P，et al.Phytochemistry，1996，43：465-469.]。NOESY谱显示5-H/9-H，5-H/14-H，9-H/14-H，11-H/19-H3，11-H/18-H3，16-H/17-H相关信号，推测A/B环trans，B/C和C/D环trans，D/E环cis构型。综合以上数据并与文献对照[Roboson V P，et al.Phytochemistry，1996，43：465-469.]，鉴定化合物(4)苷元为新替告皂苷元。
1H-NMR示有三个糖端基质子信号δ4.92(1H，d，J＝7.8Hz)，5.38(1H，br s)和5.63(1H，br s)，两个鼠李糖特征甲基质子信号δ1.65(3H，d，J＝6.2Hz)和1.70(3H，d，J＝6.2Hz)；13C-NMR示有三个糖端基碳信号δ102.12，102.28和102.90，两个鼠李糖特征甲基碳信号δ18.51和18.69。化合物(4)经酸水解后HPLC法鉴定结构中存在D-葡萄糖和L-鼠李糖[Guo H Z，et al.Phytochemistry，2004，65：481-484.]；1H-NMR显示葡萄糖端基质子偶和常数J＝7.8Hz推测葡萄糖为β构型，13C-NMR显示鼠李糖C-5位化学位移分别为δ69.84和70.64推测鼠李糖为α构型[Shao B，et al.Phytochemistry，2007，68：623-630.]。综合解析1H-NMR，13C-NMR，HMQC，HMBC谱并和文献对照，化合物(4)糖部分数据与Riparoside A相同[Li J，et al.Chem Pharm Bull，2006，10：1451-1454.]。HMBC谱显示显示葡萄糖端基质子δ4.92与苷元3位碳δ77.87，鼠李糖端基质子δ5.38与葡萄糖6位碳δ67.34，鼠李糖端基质子δ5.64与葡萄糖2位碳δ79.68远程相关信号，推测结构中存在3-O-α-L鼠李糖-(1→2)-[α-L-鼠李糖-(1→6)]-β-D-吡喃葡萄糖基。综合分析以上数据，鉴定化合物(4)为新替告皂苷元3-O-α-L-吡喃鼠李糖基-(1→2)-[α-L-吡喃鼠李糖基-(1→6)]-β-D-吡喃葡萄糖苷。该化合物未见文献报道。1H-NMR和13C-NMR数据数据如表4。
表4化合物(4)1H-NMR和13C-NMR数据(C5D5N)
本发明的牛尾菜甾体皂苷提取物在制备预防和/或治疗类风湿性关节炎产品中的用途。
本发明采用注射弗氏完全佐剂建立实验性类风湿关节炎大鼠模型，该模型是评价抗类风湿关节炎药物对免疫性炎症作用的经典模型，当大鼠足趾内注射弗氏完全佐剂致敏后，其病变分为原发性和继发性两种：原发性病变主要表现为早期致炎局部的炎症反应，致炎后18h右足肿胀达峰值，持续3d后逐渐减轻；继发性病变出现于致炎后15d左右，表现为对侧(左后肢)和前肢脚的肿胀，耳和尾部出现“关节炎”小结，变应性角膜翳以及体重下降等。细胞因子是一组由机体免疫细胞和非免疫细胞合成、分泌产生的小分子物质，具有多种生物学功能。与类风湿性关节炎密切相关的细胞因子大部分由单核细胞、巨噬细胞、成纤维细胞和T细胞分泌，其中TNF-α、IL-1、IL-6为致病因子，IL-10、IL-4为保护因子。采用佐剂性关节炎大鼠模型研究牛尾菜甾体皂苷提取物对继发性炎症的作用，结果表明，牛尾菜甾体皂苷提取物800mg·kg-1和400mg·kg-1剂量组对佐剂关节炎大鼠继发性炎症有明显抑制作用，所给药剂量范围内有明显量效关系，可明显降低血清中TNF-α、IL-1β和IL-6含量。角叉菜胶性大鼠足肿胀模型是一个常用于评价药物抗炎作用的经典的急性炎症模型，当给大鼠足跖内注射角叉菜胶时能使大鼠局部毛细血管扩张、血管通透性增高、渗出、水肿等一系列类似于人体急性炎症的反应。采用角叉菜胶性大鼠足肿胀模型研究牛尾菜甾体皂苷提取物对急性炎症的作用，结果表明，牛尾菜甾体皂苷提取物800mg·kg-1和400mg·kg-1剂量组对角叉菜胶性足肿胀大鼠急性炎症有明显抑制作用，所给药剂量范围内有明显量效关系。醋酸扭体法小鼠模型和热板法小鼠模型是常用的镇痛药筛选模型，操作简便、便于观察、效果明显，其优点是刺激部位和刺激性质的特异性较强。舔后足反射和扭体反射是小鼠受到伤害性刺激时发生的一种反应，表现为受到热的刺激造成疼痛，小鼠会表现舔后足的反应。腹腔受到醋酸地刺激造成疼痛，小鼠会表现收缩腹部，伸展后肢，抬高臀部等扭体反应，此类反射的初级中枢位于脊髓，反射弧较简单，刺激与反应之间的对应性好。因此，常作为反映大鼠肢体存在伤害性感受的客观指标，采用醋酸扭体法小鼠模型和热板法小鼠模型研究牛尾菜甾体皂苷提取物镇痛作用，结果表明，牛尾菜甾体皂苷提取物1000mg·kg-1和500mgkg-1剂量组对醋酸所致小鼠疼痛反应有明显抑制作用，其中1000mg·kg-1剂量组作用强于阿司匹林组100mg·kg-1，所给药剂量范围内有明显量效关系，对热板所致小鼠疼痛反应同样有明显抑制作用。福尔马林大鼠模型是一个较好的慢性疼痛模型，当皮下注射福尔马林立即引致C纤维自发活动剧增，经快速的单突出递质传递到脊髓投射神经元，并继以第二相传入爆发，反映为广动力背角神经元激活，引发疼痛。此外持续的C纤维刺激使广动力细胞对C纤维传入表现出过强的放电，诱发中枢神经痛觉易化状态。其疼痛特点是疼痛分两个时相，I相是由于直接刺激外周神经末稍所致，II相则主要为炎症介质的产生释放引起，采用福尔马林大鼠模型研究牛尾菜甾体皂苷提取物镇痛作用，结果表明，牛尾菜甾体皂苷提取物800mg·kg-1，400mg·kg-1和200mg·kg-1剂量组对福尔马林所致大鼠疼痛反应的第一时相和第二时相均有明显抑制作用。疼痛和炎症是类风湿性关节炎的两大主要症状，实验结果表明牛尾菜甾体皂苷提取物对免疫病理性炎症及非特异性炎症具有明显的抑制作用，同时具有明显的镇痛作用。上述结果表明牛尾菜甾体皂苷提取物可用于制备预防和/或治疗类风湿性关节炎产品，也可以含有牛尾菜甾体皂苷提取物的药物组合物制备预防和/或治疗类风湿性关节炎产品中。
本发明牛尾菜甾体皂苷提取物的制备方法工艺简单，操作方便，技术易掌握，能耗小，溶剂可回收循环使用，生产成本低。
本发明牛尾菜甾体皂苷提取物的制备方法优点为其中甾体皂苷重量百分含量为50～95％，含有4种新化合物的一种或多种，这是以前技术尚未报道的，由于含量高，从而提高了疗效，满足制备预防和/或治疗类风湿性关节炎产品的需要。
本发明还提供用本发明的牛尾菜甾体皂苷提取物以及药学上可接受的载体或赋形剂制备的药物制剂。这些药物制剂选自以下剂型：片剂、糖衣片剂、薄膜衣片剂、肠溶衣片剂、泡腾片剂、舌下片剂、胶囊剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、微囊剂、微球剂、颗粒剂、丸剂、滴丸剂、散剂、膏剂、口服液、混悬剂、溶液剂、气雾剂、注射剂，注射乳剂、冻干粉针，还可以根据需要制备成缓释或控释制剂。
本发明的含有牛尾菜甾体皂苷提取物的药物制剂，在制备药物制剂时可加入药物可接受的载体，所述药物可接受的载体来自：抗氧剂、鏊合剂、表面活性剂、填充剂、崩解剂、湿润剂、溶剂、缓释材料、肠溶材料、pH调节剂、矫味剂、色素等，常用载体如：甘露糖醇、右旋糖苷、乳糖、葡萄糖、山梨醇、木糖醇、注射用水、注射用乙醇、氯化钠、硅衍生物、纤维素、纤维素衍生物、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、甘油、吐温80、琼脂、碳酸钙、聚乙二醇、环糊精、磷脂类材料、滑石粉、硬脂酸镁、硬脂酸钙等。
以下通过具体实施例对本发明作进一步的说明，并非对本发明的限定，依照本领域公知的现有技术，本发明的实施方式并不限于具体实施例。
【具体实施方式】
实施例1
取牛尾菜根和根茎粗粉20Kg，加8倍量水回流提取3次，每次2小时，滤过，提取液合并，减压回收乙醇得提取物。取提取物加水溶解，加于HPD100大孔吸附树脂柱上，用水洗脱至洗脱液近无色，弃去洗脱液，用10％乙醇洗脱至洗脱液近无色，弃去洗脱液，用90％乙醇洗脱至洗脱液近无色，收集洗脱液，90％乙醇洗脱液加于D941脱色树脂柱上，用6倍柱体积90％乙醇洗脱，收集洗脱液，减压浓缩、干燥得牛尾菜甾体皂苷提取物215g，其中甾体皂苷含量52％。
实施例2
取牛尾菜根和根茎粗粉20Kg，加8倍量30％乙醇回流提取3次，每次2小时，滤过，提取液合并，减压回收乙醇得提取物。取提取物加水溶解，加于HPD300大孔吸附树脂柱上，用水洗脱至洗脱液近无色，弃去洗脱液，用50％乙醇洗脱至洗脱液近无色，弃去洗脱液，用90％乙醇洗脱至洗脱液近无色，收集洗脱液，90％乙醇洗脱液加于D941脱色树脂柱上，用6倍柱体积90％乙醇洗脱，收集洗脱液，减压浓缩、干燥得牛尾菜甾体皂苷提取物72g，其中甾体皂苷含量95％。
实施例3
取牛尾菜根和根茎粗粉20Kg，加8倍量50％乙醇回流提取3次，每次2小时，滤过，提取液合并，减压回收乙醇得提取物。取提取物加水溶解，加于HPD400大孔吸附树脂柱上，用水洗脱至洗脱液近无色，弃去洗脱液，用30％乙醇洗脱至洗脱液近无色，弃去洗脱液，用70％乙醇洗脱至洗脱液近无色，收集洗脱液，70％乙醇洗脱液加于D941脱色树脂柱上，用6倍柱体积90％乙醇洗脱，收集洗脱液，减压浓缩、干燥得牛尾菜甾体皂苷提取物136g，其中甾体皂苷含量88％。
实施例4
取牛尾菜根和根茎粗粉20Kg，加8倍量70％乙醇回流提取3次，每次2小时，滤过，提取液合并，减压回收乙醇得提取物。取提取物加水溶解，加于D101大孔吸附树脂柱上，用水洗脱至洗脱液近无色，弃去洗脱液，用30％乙醇洗脱至洗脱液近无色，弃去洗脱液，用70％乙醇洗脱至洗脱液近无色，收集洗脱液，70％乙醇洗脱液加于D941脱色树脂柱上，用6倍柱体积90％乙醇洗脱，收集洗脱液，减压浓缩、干燥得牛尾菜甾体皂苷提取物124g，其中甾体皂苷含量84％。
实施例5
取牛尾菜根和根茎粗粉20Kg，加8倍量90％乙醇回流提取3次，每次2小时，滤过，提取液合并，减压回收乙醇得提取物。取提取物加水溶解，加于D101大孔吸附树脂柱上，用水洗脱至洗脱液近无色，弃去洗脱液，用10％乙醇洗脱至洗脱液近无色，弃去洗脱液，用60％乙醇洗脱至洗脱液近无色，收集洗脱液，60％乙醇洗脱液加于D941脱色树脂柱上，用6倍柱体积90％乙醇洗脱，收集洗脱液，减压浓缩、干燥得牛尾菜甾体皂苷提取物166g，其中甾体皂苷含量73％。
实施例6
取牛尾菜根和根茎粗粉20Kg，加8倍量90％乙醇回流提取3次，每次2小时，滤过，提取液合并，减压回收乙醇得提取物。取提取物加水溶解，加于D101大孔吸附树脂柱上，用水洗脱至洗脱液近无色，弃去洗脱液，用30％乙醇洗脱至洗脱液近无色，弃去洗脱液，用80％乙醇洗脱至洗脱液近无色，收集洗脱液，80％乙醇洗脱液加于D941脱色树脂柱上，用6倍柱体积90％乙醇洗脱，收集洗脱液，减压浓缩、干燥得牛尾菜甾体皂苷提取物159g，其中甾体皂苷含量69％。
实施例7
牛尾菜甾体皂苷提取物用药学上可接受的载体或赋形剂制备的药物制剂。这些药物制剂选自以下剂型：片剂、糖衣片剂、薄膜衣片剂、肠溶衣片剂、泡腾片剂、舌下片剂、胶囊剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、微囊剂、微球剂、颗粒剂、丸剂、滴丸剂、散剂、膏剂、口服液、混悬剂、溶液剂、气雾剂、注射剂，注射乳剂、冻干粉针，还可以根据需要制备成缓释或控释制剂，在制备药物制剂时可加入药物可接受的载体，所述药物可接受的载体来自：抗氧剂、鏊合剂、表面活性剂、填充剂、崩解剂、湿润剂、溶剂、缓释材料、肠溶材料、pH调节剂、矫味剂、色素等，常用载体如：甘露糖醇、右旋糖苷、乳糖、葡萄糖、山梨醇、木糖醇、注射用水、注射用乙醇、氯化钠、硅衍生物、纤维素、纤维素衍生物、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、甘油、吐温80、琼脂、碳酸钙、聚乙二醇、环糊精、磷脂类材料、滑石粉、硬脂酸镁、硬脂酸钙。上述制备工艺均为本领域常规操作，在此不加赘述。
实施例8
牛尾菜甾体皂苷提取物为原料制得的药物制剂不仅包括单独使用牛尾菜甾体皂苷提取物的药物制剂，还包括添加牛尾菜甾体皂苷提取物作为活性成分的药物制剂。
实施例9
牛尾菜甾体皂苷提取物对佐剂关节炎大鼠足肿胀的影响
取雄性大鼠48只，其中40只大鼠右后足跖皮下注射弗氏完全佐剂(每毫升液体石蜡含8mgH37RV人型结核菌)100μL致敏，正常对照组8只给予100μL液体石蜡，13d后致敏大鼠随机分为模型对照组，雷公藤多苷组(25mg·kg-1)，牛尾菜甾体皂苷提取物高剂量组(800mg·kg-1)，中剂量组(400mg·kg-1)和低剂量组(200mg·kg-1)。各组动物致敏后13d-24d每天ig给药1次，对照组给予同体积蒸馏水(10mL·kg-1)。分别于致敏后第18d、21d和24d测量大鼠右后足跖部周径，计算大鼠右后足跖在不同时间内的足跖肿胀度，足跖肿胀度＝致炎后足跖周径-致炎前足跖周径，结果见表5。
表5牛尾菜甾体皂苷提取物对佐剂关节炎大鼠足肿胀的影响
与模型对照组比较：*P＜0.05 **P＜0.01
结果表明，牛尾菜甾体皂苷提取物800mg·kg-1和400mg·kg-1剂量组对佐剂关节炎大鼠继发性炎症有明显抑制作用，所给药剂量范围内有明显量效关系。
实施例10
牛尾菜甾体皂苷提取物对佐剂关节炎大鼠炎性细胞因子的影响
致敏后24d腹腔注射3％水合氯醛300mg·kg-1麻醉，腹主动脉采血，离心5min(3000rpm)分离血清。采用ELISA试剂盒分别测定TNF-α、IL-1β和IL-6含量，结果见表6。
表6牛尾菜甾体皂苷提取物对佐剂关节炎大鼠血清TNF-α、IL-1β和IL-6的影响
与模型对照组比较：*P＜0.05 **P＜0.01；与正常对照组比较：#P＜0.05
结果表明，牛尾菜甾体皂苷提取物800mg·kg-1和400mg·kg-1剂量组可明显降低佐剂关节炎大鼠血清中TNF-α、IL-1β和IL-6含量。
实施例11
牛尾菜甾体皂苷提取物对角叉菜胶性大鼠足肿胀的影响
取雄性大鼠50只，随机分成模型对照组，布洛芬组(80mg·kg-1)，牛尾菜甾体皂苷提取物高剂量组(800mg·kg-1)，中剂量组(400mg·kg-1)和低剂量组(200mg·kg-1)。每天ig给药1次，连续6d，对照组给予同体积蒸馏水(10mL·kg-1)。各组动物末次给药1h后，右后足跖皮下注射无菌的1％角叉菜胶100μL致炎。分别于致炎后2h、3h和4h测量大鼠右后足跖部周径，计算大鼠右后足跖在不同时间内的肿胀度，足跖肿胀度＝致炎后足跖周径-致炎前足跖周径，结果见表7。
表7牛尾菜乙醇提取物对角叉菜胶性大鼠足肿胀的影响
与模型对照组比较：*P＜0.05 **P＜0.01
结果表明，牛尾菜乙醇提取物800mg·kg-1和400mg·kg-1剂量组对角叉菜胶性足肿胀大鼠急性炎症有明显抑制作用，所给药剂量范围内有明显量效关系。
实施例12
牛尾菜甾体皂苷提取物对醋酸所致小鼠疼痛反应的影响
取雄性小鼠70只，随机分成模型对照组，阿司匹林组(100mg·kg-1)，牛尾菜甾体皂苷提取物高剂量组(1000mg·kg-1)，中剂量组(500mg·kg-1)和低剂量组(250mg·kg-1)，每天ig给药1次，连续6d，对照组给予同体积蒸馏水(10mL·kg-1)。各组动物末次给药后1h，腹腔注射0.8％的冰醋酸溶液0.3mL，注射醋酸后5min开始记录10min内小鼠的扭体次数，以腹部收缩、伸展后肢与躯干、臀部抬高为扭体反应阳性，结果见表8。
表8牛尾菜甾体皂苷提取物对醋酸所致小鼠疼痛反应的影响
与模型对照组比较：*P＜0.05 **P＜0.01.
结果表明，牛尾菜甾体皂苷提取物1000mg·kg-1和500mg·kg-1剂量组对醋酸所致小鼠疼痛反应有明显抑制作用，其中1000mg·kg-1剂量组作用强于阿司匹林100mg·kg-1，所给药剂量范围内有明显量效关系。
实施例13
牛尾菜甾体皂苷提取物对热板所致小鼠疼痛反应的影响
取雌性小鼠，预先进行痛阈值筛选，取痛阈值在5-30s小鼠70只，兼顾体重与痛阈值随机分成模型对照组，盐酸吗啡组(5mg·kg-1)，牛尾菜甾体皂苷提取物高剂量组(1000mg·kg-1)，中剂量组(500mg·kg-1)和低剂量组(250mg·kg-1)。每天ig给药1次，连续6d，对照组给予同体积蒸馏水(10mL·kg-1)。末次给药后1h热板仪(50±0.5℃)测定小鼠痛阈值，小鼠60s后仍无反应，取出小鼠，以60s计算。每只小鼠测定2次痛阈值，取其均值作为投药前的痛阈值，结果见表9。
表9牛尾菜甾体皂苷提取物对热板所致小鼠疼痛反应的影响
与模型对照组比较：*P＜0.05 **P＜0.01
结果表明，牛尾菜甾体皂苷提取物1000mg·kg-1和500mg·kg-1剂量组对热板所致小鼠疼痛反应有明显抑制作用。
实施例14
牛尾菜甾体皂苷提取物对福尔马林所致大鼠疼痛反应的影响
取雄性大鼠48只，随机分成模型对照组，盐酸吗啡组(5mg·kg-1)，阿司匹林组(100mg·kg-1)，牛尾菜甾体皂苷提取物高剂量组(800mg·kg-1)，中剂量组(400mg·kg-1)和低剂量组(200mg·kg-1)，各组动物每天ig给药1次，连续6d，对照组给予同体积蒸馏水(10mL·kg-1)。各组动物末次给药后1h，右后足趾皮下注射2.0％的福尔马林溶液100μL，观察注射后0-5min(第一时相)和15-30min(第二时相)大鼠的疼痛反应(舔致炎足)累积时间，结果见表10。
表10牛尾菜甾体皂苷提取物对福尔马林所致大鼠疼痛反应的影响
与模型对照组比较：*P＜0.05 **P＜0.01
结果表明，牛尾菜甾体皂苷提取物800mg·kg-1，400mg·kg-1和200mg·kg-1各剂量组对甲醛所致大鼠疼痛反应的第一时相和第二时相均有明显抑制作用，说明其对中枢及外周疼痛均有明显抑制作用。