发明背景
青光眼是与眼内压升高以致功能异常有关的眼疾，可引起不可逆的 视力丧失。若不治疗，青光眼甚至可导致失明。现在许多眼科医生相信， 眼高压症，即无视觉神经损伤或以青光眼性视野缺陷为特征的眼内压高 的病症是青光眼的最早表现。
通式I的化合物：
它们的各个非对映异构体，各个对映异构体或它们的混合物，或眼科 可以接受的它们的盐，为美国专利4,797,413和5,157,129中的已知化合 物。
其中：A为碳或氮；
Z为NHR或-OR；
R为C1-6直链或支链烷基；
R1为
a)C1-5直链或支链烷基，尤其为正丙基或异丁基；
b)C3-5烯基，尤其为烯丙基；
c)C3-5炔基，尤其为炔丙基；
d)氢；或
e)C1-4烷氧基-C1-4烷基；以及
X为-SO2-或-C(O)-；
这些化合物已知是用于眼高压症局部治疗的有效的碳酸酐酶抑制剂 (TCAI’s)。这些化合物的合成包括将砜-酮还原成上面提到的化合物 的前体反式羟基砜。不过制备它们的合成方法却生成非对映异构体或外 消旋产物，因而必须分离或拆分，要得到最活泼的对映异构体同时就要 至少损失50％产品。
本发明提供一种新的微生物方法，将砜-酮中间体生物转化为反式- 羟基砜中间体。
发明概述
本发明涉及使用新的微生物转化方法合成具有下面的结构式的反式 -羟基砜：
其中A和R1的定义同上。该反式-羟基砜是目标物、即上面通式I的 碳酸酐酶抑制剂的前体。这些目标物对于眼高压症和青光眼的局部治疗 有效。该方法包括将砜-酮底物在微生物深红酵母(ATCC74283)或 piliminae红酵母(ATCC32762)存在下发酵，最好在染红酵母存在下发 酵。生物转化在需氧条件下完成，以含有氮营养素的碳水化合物水溶液 作为发酵介质，介质的pH为4.5至8.0，最好为6.0，生物转化的时间 应充分以便生成结构式为通式II的化合物。
生成的反式-羟基砜类似物显示的非对映异构体过量值在95％以 上。该新方法中的关键步骤(即控制羟基砜的非对映异构体过量)是控 制生物转化反应介质中的残留砜-酮浓度。
这样，本发明的目标是提供合成反式-羟基砜中间体的微生物方法。
本发明的详细描述
本发明涉及合成下面结构式的化合物：
反式-羟基砜-II
其中A为碳或氮，R1为
a)C1-5的直链或支链烷基，尤其是正丙基或异丁基；
b)C3-5烯基，尤其是烯丙基；
c)C3-5炔基，尤其是炔丙基；
d)氢；或
e)C1-4烷氧基-C1-4烷基，
它们是下面通式I化合物，各非对映异构体，各对映异构体或它们的混 合物，或眼科可以接受的它们的盐的前体，
其中：
A为碳或氮；
Z为NHR或-OR；
R为C1-6直链或支链烷基；
R1为
a)C1-5直链或支链烷基，尤其是正丙基或异丁基；
b)C3-5烯基，尤其是烯丙基；
c)C3-5炔基，尤其是炔丙基；
d)氢；或
e)C1-4烷氧基-C1-4烷基；以及
X为-SO2-或-C(O)-；
本发明的新方法包括在底物化合物III的存在下用微生物piliminae红 酵母或深红酵母进行发酵，最好用深红酵母进行发酵：
砜-酮-III
其中R2为
a)C1-5直链或支链烷基，尤其是正丙基或异丁基；
b)C3-5烯基，尤其是烯丙基；
c)C3-5炔基，尤其是炔丙基；
d)氢；或
e)C1-4烷氧基-C1-4烷基
发酵在营养素的介质中在需氧条件下进行，直至有显著量的化合物II 生成，使用常规方法分离生成的化合物。结构式I的化合物用于治疗青光 眼。
本发明的优选的实施方案包括在含有可吸收的氮源和碳源及底物化 合物III的营养素介质中培养微生物深红酵母，ATCC74283，其中通式 II的化合物是通式I化合物，它的各个非对映异构体、各个对映异构体或 它们的混合物，或眼科可以接受的它们的盐的前体，在通式II中，
A为碳或氮，R1为
a)C1-5直链或支链烷基，尤其是正丙基或异丁基；
b)C3-5烯基，尤其是烯丙基；
c)C3-5炔基，尤其是炔丙基；
d)氢；或
e)C1-4烷氧基-C1-4烷基
在通式I中：
A为碳或氮；
Z为NHR或-OR；
R为C1-6直链或支链烷基；
R1为
a)C1-5直链或支链烷基，尤其是正丙基或异丁基；
b)C3-5烯基，尤其是烯丙基；
c)C3-5炔基，尤其是炔丙基；
d)氢；或
e)C1-4烷氧基-C1-4烷基；以及
X为-SO2-或-C(O)-；
在通式III中，R2为
a)C1-5直链或支链烷基，尤其是正丙基或异丁基；
b)C3-5烯基，尤其是烯丙基；
c)C3-5炔基，尤其是炔丙基；
d)氢；或
e)C1-4烷氧基-C1-4烷基，
培养在需氧条件下进行，直至生成显著量的化合物II，分离生成的化 合物II，培养时将底物溶在以体积百分数大约1％至15％乙醇、甲醇或 DMSO中，底物的含量为大约1g/L至3g/L，培养温度为大约20℃至 50℃，pH为大约4.5至80。
底物化合物III可以按照以下的非限制性方法制备：
3(R)-羟基己酸甲酯
3-酮己酸甲酯(44.7g，310mmol)用甲醇(75mL)和0.2N HCl(2mL)稀 释。加入Et2NH2+Ru2Cl5(BINAP)2(200mg)，反应混合物在100磅/平方英 寸的氢气压下于60℃加热2小时。加入甲苯(100mL)，将混合物浓缩， 得75g油状物。
3(R)-甲苯磺酰氧基己酸甲酯
3(R)-羟基己酸甲酯(310mmol)粗品溶在吡啶(100mL)中，加入对甲苯 磺酰氯(59g，310mmol)。反应混合物先于5℃搅拌24小时，再于15℃ 搅拌16小时。缓慢加水(5mL)破坏过量的试剂，加水时间超过1小时。 混合物倾入20％甲苯/己烷(600mL)中，并用水洗涤(3×250mL)。有机层 浓缩，得83g油状产物，纯度为95％。
3(S)-(2-噻吩硫代)己酸甲酯
在-20℃将正丁基锂(1.64M，97.6mL，160mmol)加到噻吩(15.1g， 180mmol)与四氢呋喃(100mL)的混合物中。搅拌30分钟后分次加入硫 (5.23g)。1小时后加脱氧的甲酰胺(100mL)，接着加3(R)-甲苯磺酰氧基 己酸甲酯(40g，33.3mmol)。反应混合物室温搅拌24小时，然后用乙酸乙 酯(100mL)和水(50mL)稀释。分离的水层用乙酸乙酯(100mL)反萃取。合 并有机层，浓缩后得到黄色油状产物23.9g。按3-酮己酸甲酯计算，总 收率为74％。
5，6-二氢-6(S)-(丙基)-4H-噻吩并〔2，3b〕噻喃-4-酮
3(S)-(2-噻吩硫代)己酸甲酯(125g，513mmol)与乙酸(150mL)和浓盐酸 (150mL)混合后于100℃加热96小时。混合物用甲苯(2×300mL)萃取。 合并有机层，洗涤，浓缩，得暗棕色油状物，该油状物溶于甲苯(1200mL) 中。混合物冷却至0℃，加三氟乙酸酐(126g，600mmol)。45分钟后混 合物用水(2×200mL)洗，浓缩，得151g油状物，不经纯化，直接用于下 步反应。
5，6-二氢-6(S)-(丙基)-4H-噻吩并〔2，3b〕噻喃-4-酮-7，7-二氧化物。
5，6-二氢-6(S)-(3-丙基)-4H-噻吩并〔2，3b〕噻喃-4-酮(4.25g，20mmol) 溶于乙酸乙酯(80mL)中。加入钨酸钠(660mg，2mmol)，30％过氧化氢 (8.2mL，80mmol)和10滴硫酸。24小时后反应混合物用乙酸乙酯(100mL) 稀释，用10％Na2SO3溶液洗涤，用饱和的NaHCO3溶液洗涤。有机层 浓缩，用乙醇研磨，得到4.5g产物(95％)。
微生物
生物纯的piliminae红酵母样品从夏威夷pilimanae果蝇幼虫中分离 得到，现在按照布达佩斯条约可以从ATCC的永久培养物中心得到， 12301 Parklawn Drive，马里兰的Rockville，登记号为ATCC32762。生 物纯的深红酵母样品目前可以从ATCC的永久培养物中心得到，12301 Parklawn Drive，马里兰州Rockville，登记号为ATCC74283。授予专 利权后，对于公众使用微生物的任何限制都将永远取消。深红酵母ATCC 74283从污染的酸乳酪中分离得到。
本发明一般使用的分析方法当然是非限制性的，现描述如下：
分析方法
生物量测定：
用光密度和细胞干重测定生物量。用Hewlett Packard 8451A型二级 管阵列分光光度计在660nm波长测定光密度。细胞干重用HA型 Millipore滤膜测定，滤孔为0.45μm。
葡萄糖
葡萄糖用液相色谱监测，液相色谱上装有Macintosh经典计算机用于 控制和收集数据，装有折射率检测器Al-2 Dynamax自动进样器，分析 型HP泵，压力组件和Biorad Aminex HPX87H离子排阻柱(300×78mm)， 于60℃加热。洗脱剂为0.005M硫酸，流速为0.7mL/分
肉汤萃取
全部肉汤用等体积乙酸乙酯萃取。混合物在振荡器上振荡5分钟后 在Beckman TJ-6离心机上于2000rpm离心10分钟。得到的上层清液干 燥，再用甲醇混悬，作薄层色谱分析或HPLC分析。
薄层色谱
使用Kiesel预涂的硅胶60薄层色谱板F254。流动相由94％二氯甲 烷、5％甲醇和1％氢氧化铵组成。样品点在板上，吹干。板的一边浸 到流动相中，直至溶剂爬到离板上沿1英寸处。
高效液相色谱
HPLC用Rainin系统在室温下完成，配备有Macintosh经典计算机以 便控制和获得数据，Dynamax吸收检测器UV-M，Al-2 Dynamax自动进 样器，两个分析型HP泵，装有Zorbax RX-C8柱(4.6×250nm)的压力系 统。使用2种洗脱剂，甲醇和水(0.1％v/vH3PO4)，组合流速为1.5mL/ 分，UV检测波长为254nm.由30/70的甲醇/酸化水(v/v)在15分钟内变 至70/30的甲醇/酸化水(v/v)的梯度洗脱。在70/30(v/v)保持5分钟，然后 至30/70(v/v)平衡5分钟。这样，分别在9.5分时分离收集顺式-羟基砜， 10分时分离收集反式-羟基砜，12.8分时分离收集砜-酮。
实施例1
培养方法
在筛分或振荡烧瓶培养的过程中生成反式-羟基砜，深红酵母ATCC 74283细胞最初由Sabouraud葡萄糖(Difco)斜面培养液或后来由冷冻甘 油悬浮液(1mL)接种到含50mL Sabouraud葡萄糖肉汤的250mL Erlenmever烧瓶中。Sabouraud葡萄糖肉汤是可以买到的商品，由10g/L Difco新胨(neopeptone)和20g/L Bacto葡萄糖构成。烧瓶在28℃培育24 小时，同时在每分钟220转速度下搅动，以便得到作用接种物必须的充 分的生物量。将接种物转移(5％/25mL)到含500mL Sabouraud葡萄糖肉 汤的2升Erlenmeyer烧瓶中。然后将培养物在28℃培育42小时，同时 在每分钟180转速下搅动。细胞离心分离，用pH6.0的MES缓冲液洗 涤，加砜-酮之前再悬浮到pH6.0的MES缓冲液中。
在23升的发酵罐中进行生物反应器的培养，发酵罐用含深红酵母 ATCC74283的Sabouraud葡萄糖肉汤的2升烧瓶接种并象前面描述的 那样培养42小时。发酵罐参数如下：温度28℃，搅拌速度每分钟200 转(最低设定速度)，通入空气的速度为10L/分，反压力为0.6磅/平方 英寸(0.0422千克/厘米2)。通过搅拌，控制溶解的氧气压在40％的 最小值。当吸氧速度降到5mmoles/升/小时以下时，在无菌条件下收获 细胞。
反应参数
最佳生物转化参数是这样一些参数，其中使用3-〔N-吗啉代〕丙磺 酸(MOPS)或2-〔N-吗啉代〕乙磺酸(MES)缓冲液(0.5M)，温度为大约 20℃至40℃，pH范围为大约4.5至8.0，产生的生物转化速率为大约 0.011g/g CDW/小时至大约0.150g/g CDW/小时。温度范围为大约20℃ 至大约50℃，最好是大约30℃至大约35℃。为溶解砜-酮底物使用的 溶剂为乙醇、甲醇或DMSO，最好是DMSO，用量分别为1％至15％ v/v，最好是1％至3％。底物的量为大约1至3g/L，最好是1.5g/L，这 样反式-羟基砜的回收率可达66％，非对映异构体过量可达95％；令细 胞老化大约16小时至60小时，最好为大约40小时至60小时，对应于 氧的吸收速度降到低于5mmoles/L/小时。
反式-羟基砜II(5，6-二氢-4(S)-羟基-6(S)-丙基-4H-噻吩并-〔2，3-b〕噻 喃，7，7-二氧化物)的生物转化和分离
含深红酵母细胞的肉汤(10或50mL)用Beckman TJ-6离心机在每分 钟4000转的速度下离心10分钟后倾出上清液。沉积的小丸再悬浮到pH 6.0的0.5M 2-〔N-吗啉代〕乙磺酸(MES)缓冲溶液中再离心。洗涤过的 细胞再悬浮到50mL MES缓冲溶液中。需要时将细胞稀释，以便更好地 分析生物转化反应速率。将相当于1g/L纯砜-酮的粗砜-酮底物(纯度为 56％)的乙醇溶液(3％v/v)加到装有洗涤过的细胞的烧瓶中。该烧瓶在 32.5℃的水浴中培育并继续振摇。用氯仿(按1∶1，v/v)或乙酸乙酯(按1∶1， v/v)萃取肉汤以便收获产品，萃取液干燥，并再悬浮到甲醇中。同时用 薄层色谱和高效液相色谱(HPLC)分析萃取液。反式-羟基砜、顺式-羟基 砜和砜酮的HPLC保留时间分别为9.5、10.0和12.8。反式-羟基砜的 1HNMR(250MHz，CDCl3)如下：
δ7.58(d，J＝5.1Hz，1H)，7.08(d，J＝5.1Hz，1H)，4.94(t，J＝3.6Hz，1H)， 3.66(m，1H)，2.6-2.1(m，3H)，1.7-1.5(m，，3H)，1.01(t，J＝7.01，3H)。
使用生物反应器培养细胞时，当吸氧速度低于5mmoles/L/小时便可 收获细胞，离心分离和用pH6.0的0.5M MES缓冲液洗涤。将收获的细 胞再悬浮到pH6.0的0.5M MES缓冲液中，然后再放回到发酵罐中。为 完成生物转化，发酵罐的参数调至：温度32.5℃，搅拌速度为每分钟 400转，通空气的量为6L/分，反压力为0.6磅/平方英寸(0.0422千克/ 厘米2)。砜-酮(1.5g/L)溶于DMSO并加到发酵罐中(3％，v/v)。定时取 样以便用HPLC监测生物转化活性。收获时应达到1.14g/L/hr或0.126g/g CDW/hr的生物转化速率，反式-羟基砜的终产率为1.04g/L-1，非对映异 构体过量值为96.4％。肉汤用乙酸乙酯(按0.5∶1，v/v)萃取，溶剂相用旋 转蒸发器浓缩。
实施例2 反式-羟基砜(5，6-二氢-4(S)-羟基-6(S)-甲基-4H-噻吩并〔2，3b〕噻 喃，7，7-二氧化物的生物转化
将4℃保存在Sabouraud葡萄糖琼脂斜面上的接种ATCC74283细胞 在含50ml Sabouraud葡萄糖肉汤的250ml Erlenmever烧瓶中培育。于 28℃振摇下培育20小时后，将溶于乙醇中的砜-酮(33.3mg/ml)加到烧瓶 中(每个烧瓶1ml)。将培养物调回原来的条件再培育24小时。使用1 体积的氯仿萃取残留的砜-酮和生成的羟基砜。TLC和HPLC分析指示 砜-酮完全转化为反式-羟基砜。用NMR分析证实反式-羟基砜的结构：
δ7.6(d，1H，C2-H)，7.1(d，1H，C3-H)，4.9(m，1H，C4-H)，3.8(m，1H，C6-H)， 3.5-3.0(brs，1H，OH)，2.6(m，1H，C5-H)，2.4(m，1H，C5-H)，1.5(d，3H，C6- CH3)。
实施例3
通过实施例，制备通式I的化合物〔5，6-二氢-6-(S)-丙基-4(S)-1-乙氨 基-4H-噻吩并〔2.3-b〕噻喃-2-磺酰氨-7，7-二氧化物〕表述如下：
步骤1：方法
在装有电磁搅拌器、热电偶探针和氮气导管的100mL园底烧瓶中将 反式-羟基砜(7.32g，29.7mmol)悬浮于乙腈(38mL)中。溶液冷至0℃，分 次加入硫酸(5ml，88.7mmol)。然后反应混合物室温搅拌。化合物冷至 0-5℃。在500mL的烧瓶中装有水(34mL)和乙腈(43mL)，然后将混合物 冷至0-5℃，并充分搅拌。再将反应混合物小心地加入，使淬火温度保 持在5℃以下。加入饱和碳酸钾溶液(30mL)直至水层pH在7-8之间或 直至不再有二氧化碳逸出。有机层浓缩成粗油状物(14.1g)，测定的含量 为42.5％(重量)。产率为5.99g(73％)。
步骤2：方法
在装有电磁搅拌和热电偶探针的100mL园底烧瓶中装入氯磺酸 (13.14mL)并冷至0-5℃。用30分钟将乙酰氨基砜(6.57g)滴加到烧瓶中， 以便保持内温度在15℃以下。黑色的反应混合物先在33℃加热16小 时，然后在50℃加热5小时。当HPLC表明存留的乙酰氨基砜(相当 于磺酸和磺酰氯)少于0.5％时，混合物冷至室温。滴加亚硫酰氯 (13.14mL)。加完后，黑色的混合物加热至45℃。16小时后磺酸的峰面 积小于0.5％。混合物冷至0-5℃。在1升的烧瓶中装水(325mL)。并冷 至0℃。将氯化的反应混合物滴加到充分搅拌的淬火溶液中，滴加时间 不得少于30分钟，以便保持内温低于5℃。混合物搅拌45分钟后过滤。 湿滤饼用冷水(10mL)洗涤并在氮气流下干燥。往装有电磁搅拌和热电偶 探针的250mL烧瓶中装浓氨水(24mL)和四氢呋喃(43mL)。混合物冷至大 约-10℃。在内温低于0℃下往里分次加粗磺酰氯的湿固体，加样时间 超过1小时。2小时后存留的磺酰氯少于18％。用盐酸水溶液(大约 50mL)中和过量的氨。水层用四氢呋喃洗涤2次。合并四氢呋喃层并浓 缩。残留物再悬浮到四氢呋喃中，并小心地加水。形成的结晶为棕色， 水溶液保持黄色。混合物过滤，结晶真空干燥。乙酰氨基磺酰氨的产量 为5.58g(66％)。
步骤3：方法
在250mL烧瓶中乙酰氨基磺酰氨(4.21g，11.5mmol)用四氢呋喃 (2×100mL)蒸馏进行干燥。烧瓶装有电磁搅拌，热电偶探针和氮气导管。 乙酰氨基磺酰氨与22.5mL四氢呋喃的悬浮液然后冷至0-5℃。往里滴 加甲硼烷-四氢呋喃(51mL，51mmol)，内温保持在5℃以下，滴加时间45 分钟。氢气完全逸出后(20分钟)，溶液升温至30-35℃。反应完全后 (3小时)，混合物冷至室温。在装有电磁搅拌、热电偶探针和氮气导 管的250mL园底烧瓶中装硫酸(60mL)并冷至0-5℃。反应混合物小 心地计量并加到充分搅拌的酸溶液中，内温保持在20℃以下。加完之 后混合物在室温搅拌直至氢气释放完。然后将烧瓶装好，在1大气压下 蒸馏使混合物浓缩至蒸馏的内温高于97℃。蒸馏完毕后，混合物冷至 20℃。混合物用碳酸氢钾水溶液中和并用乙酸乙酯(100ml)萃取。有机 层浓缩得3.45g 5，6-二氢-6-(S)-丙基-4(S)-1-乙氨基-4H-噻吩并〔2，3-b〕 噻喃-2-磺酰氨7，7-二氧化物。