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1、(10)授权公告号 CN 102382771 B (45)授权公告日 2013.07.17 CN 102382771 B *CN102382771B* (21)申请号 201110243864.2 (22)申请日 2011.08.25 CGMCC 5141 2011.08.16 C12N 1/14(2006.01) C12P 17/06(2006.01) C12R 1/685(2006.01) (73)专利权人 天津科技大学 地址 300457 天津市滨海新区经济技术开发 区第 13 大街 29 号 (72)发明人 李玉 荆玮 刘逸寒 刘晓光 王稳航 路福平 (74)专利代理机构 天津盛理知识。
2、产权代理有限 公司 12209 代理人 王来佳 (54) 发明名称 一种 - 葡萄糖苷酶产生菌及利用该菌转化 制备京尼平的方法 (57) 摘要 本发明涉及了一种利用体外微生物发酵法模 拟体内肠道微生物转化的方式对京尼平苷进行有 效的转化而生成京尼平， 即利用本实验室筛选保 藏的 - 葡萄糖苷酶的高产菌发酵中药栀子， 通 过单因素实验优化， 确定微生物转化得到产物京 尼平的最佳条件， 一方面在温和条件下水解其中 的京尼平苷， 避免了传统方法导致有效成分损失 的缺陷， 另一方面利用现代微生物发酵工程技术 使桅子的有效成分京尼平苷在体外可控条件下实 现规模转化， 具有较大的经济效益和社会效益， 市 。
3、场开发前景广阔。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. 审查员 丁海 权利要求书 1 页 说明书 5 页 附图 2 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书1页 说明书5页 附图2页 (10)授权公告号 CN 102382771 B CN 102382771 B *CN102382771B* 1/1 页 2 1. 一种 - 葡萄糖苷酶产生菌， 其特征在于 ： 名称为黑曲霉 Y-4， 其分类命名为黑曲霉 Aspergillus niger， 保藏编号为 CGMCC NO. 5141， 保藏日期 ： 2011 年 8 月 16 日， 保藏地址 为 ： 北京市朝。
4、阳区北辰西路 1 号院 3 号， 保藏单位 ： 中国微生物菌种保藏管理委员会普通微 生物中心。 2. 一种利用如权利要求 1 所述 - 葡萄糖苷酶产生菌转化制备京尼平的方法， 其特征 在于 ： 步骤如下 ： 将保存的黑曲霉 Y-4 孢子接种于斜面培养基上， 置 25-30恒温箱培养 1-5 天， 获得 孢子， 用无菌水溶解孢子获得孢子液， 将孢子液接入摇瓶发酵培养基 ； 所述摇瓶发酵培养基 ： 将栀子粉溶于去离子水中， 使料水比为 g/ml ： 10% ； 所述斜面培养基为 PDA 培养基 ； 转化制备京尼平 ： 在温度为 25-30、 pH7.0、 装液量为 45-55ml、 接种量为 8-。
5、12%、 转 速 150-200r/min 的条件下发酵 80-110h ； 所述黑曲霉 Y-4 孢子液的浓度为每毫升孢子 （1.00 士 0.05） 108个。 3. 根据权利要求 2 所述的 - 葡萄糖苷酶产生菌转化制备京尼平的方法， 特征在于 ： 所述转化制备京尼平的条件为 ： 温度为 28、 pH7.0、 装液量为 50ml、 接种量为 10%、 转速 180r/min 的条件下发酵 96h。 权 利 要 求 书 CN 102382771 B 2 1/5 页 3 一种 - 葡萄糖苷酶产生菌及利用该菌转化制备京尼平的 方法 技术领域 0001 本发明属于生物技术领域， 涉及微生物转化技术。
6、， 尤其是一种 - 葡萄糖苷酶产 生菌及利用该菌转化制备京尼平的方法。 背景技术 0002 京尼平是一种环烯醚萜类物质， 无毒， 易溶于乙醇、 丙酮、 乙酸乙酯等有机溶剂， 在 水中的溶解度较小。近年来， 由于京尼平在抗肿瘤、 治疗肝硬化等方面疗效显著， 同时作为 一种新兴的药物中间体具有很多新型的、 重要的药理价值， 因此在注射剂开发等方面具有 很好的应用前景。同时京尼平还作为一种新型的生物交联剂被应用于生物材料中， 它不仅 能形成稳定的交联制品， 并且具有细胞毒性小、 生物相容性好、 抗降解能力强和应用领域广 泛等优点， 是非常有前途的交联材料。 0003 京尼平在植物中含量非常低， 直接。
7、提取很难实现， 如京尼平在栀子中的含量约为 0.005， 且主要是以其前体形式京尼平苷形式存在。由于酸碱水解打断糖苷键生成苷元 的方法并不适用于京尼平， 其环烯醚萜结构在酸碱作用下会遭到破环， 影响其生物活性， 所 以， 目前制备京尼平的方法主要是酶解法， 即利用 - 葡萄糖苷酶水解大量存在于植物中 的京尼平苷生成苷元京尼平。- 葡萄糖苷酶作为纤维素酶的一个重要组成部分， 在医疗、 食品、 生物质转化中有重要的应用价值。 纤维素酶在自然界的分布很广泛， 昆虫、 软体动物、 高等植物、 细菌、 放线菌和真菌都能产生纤维素酶， 甚至哺乳动物中的反刍动物的瘤胃及猪 大肠中也有能够分解纤维素的菌群存在。
8、。 纤维素酶的产酶菌很多， 主要有细菌、 放线菌和丝 状真菌。丝状真菌的纤维素酶产量较高， 可达 20g/L 以上， 而且丝状真菌产酶具有诸多优 点 ： 产生的纤维素酶为胞外酶， 便于酶的分离和提取 ； 产酶效率高， 且产生的纤维素酶酶系 结构较为合理。 0004 国内近年来研究 - 葡萄糖苷酶已经成为热点， 已由过去的研究 - 葡萄糖苷酶 的简单提取到现在的产酶条件优化以及粗酶液的纯化。- 葡萄糖苷酶基因的克隆表达已 经得到实现， 新构建的工程菌已经应用到生产实践中。目前国内已有利用 一葡萄糖苷酶 对提取出的京尼平苷进行酶解。 但也同时存在很多不足， 如 ： 工艺复杂、 成本过高， 从而限制。
9、 了其进一步发展。 发明内容 0005 本发明的目的在于克服现有技术的不足之处， 提供一种 - 葡萄糖苷酶产生菌及 利用该菌转化制备京尼平的方法， 本方法利用体外微生物发酵法模拟人体内肠道微生物转 化的方式对京尼平苷进行有效的转化而生成京尼平。 0006 本发明的目的是通过以下技术方案实现的 ： 0007 一种 - 葡萄糖苷酶产生菌， 其特征在于 ： 名称为黑曲霉 Y-4， 其分类命名为黑曲 霉 Aspergillus niger， 保藏编号为 CGMCC NO.5141， 保藏日期 ： 2011 年 8 月 16 日， 保藏地 说 明 书 CN 102382771 B 3 2/5 页 4 址。
10、为 ： 北京市朝阳区北辰西路 1 号院 3 号， 保藏单位 ： 中国微生物菌种保藏管理委员会普通 微生物中心。 0008 一种 - 葡萄糖苷酶产生菌转化制备京尼平的方法， 步骤如下 ： 0009 (1) 将保存的黑曲霉 Y-4 孢子接种于斜面培养基上， 置 25-30恒温箱培养 1-5 天， 获得孢子， 用无菌水溶解孢子获得孢子液， 将孢子液接入摇瓶发酵培养基 ； 0010 所述摇瓶发酵培养基 ： 将栀子粉溶于去离子水中， 使料水比为 g/ml ： 10， 霉菌 ； 0011 所述斜面培养基为 PDA 培养基 ； 0012 (2) 转化制备京尼平 ： 在温度为 25-30、 pH7.0、 装液。
11、量为 45-55ml、 接种量为 8-12、 转速 150-200r/min 的条件下发酵 80-110h。 0013 而且， 所述黑曲霉 Y-4 孢子液的浓度为每毫升孢子 1.000.05108 个。 0014 而且， 所述转化制备京尼平的条件为 ： 温度为 28、 pH7.0、 装液量为 50ml、 接种量 为 10、 转速 180r/min 的条件下发酵 96h。 0015 本发明的优点和积极效果是 ： 0016 1、 本发明以实验室筛选保藏的菌种作为出发菌株， 采用栀子粉作为唯一碳源组 成的发酵培养基， 分别从接种量、 底物浓度、 装液量、 转化时间等几方面进行单因素实验分 析， 从而。
12、确定京尼平苷转化的最佳条件， 有效地提高了产量， 此方法为大量低价工业化生产 - 葡萄糖苷酶和京尼平提供一条可行途径， 这种生产方法降低了生产成本， 提高了生产效 率， 不仅具有经济效益， 还具有一定的社会效益。 0017 2、 本发明基于微生物具有多方面的产酶能力， 能够利用体内的酶系统完成重要的 催化及代谢功能的独特优点， 采用体外微生物发酵法模拟体内肠道微生物转化的方式对京 尼平苷进行有效的转化而生成京尼平， 即利用本实验室所筛选保藏的 一葡萄糖苷酶的 高产菌在优化条件下发酵中药桅子， 不仅可以降低生产成本， 使 - 葡萄糖苷酶广泛应用 于药物生产过程中， 而且使桅子的有效成分京尼平苷在。
13、体外可控条件下实现规模转化。 0018 3、 本发明利用本实验室筛选保藏的 - 葡萄糖苷酶的高产菌发酵中药栀子， 通过 单因素实验优化， 确定微生物转化得到产物京尼平的最佳条件， 一方面在温和条件下水解 其中的京尼平苷， 避免了传统方法导致有效成分损失的缺陷， 另一方面利用现代微生物发 酵工程技术使桅子的有效成分京尼平苷在体外可控条件下实现规模转化， 具有较大的经济 效益和社会效益， 市场开发前景广阔。 附图说明 ： 0019 图 1 为本发明的发酵液产物 TLC 分析图， 其中 ： 1、 京尼平标准品 ； 2、 栀子粉溶液 ； 3、 Y-1 发酵液 ； 4、 Y-2 发酵液 ； 5、 Y-3。
14、 发酵液 ； 6、 Y-4 发酵液 ； 0020 图 2 为本发明京尼平标品的高效液相色谱图 ； 0021 图 3 为本发明利用黑曲霉转化发酵得到产物京尼平的高效液相色谱图。 具体实施方式 0022 下面结合实施例， 对本发明进一步说明， 下述实施例是说明性的， 不是限定性的， 不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。 0023 一、 土壤的确定 说 明 书 CN 102382771 B 4 3/5 页 5 0024 土样取自天津武清养牛场多年堆积牛粪的土壤， 以 1的桅子浸液做酶反应底物， 配以土豆培养基配方形成初筛培养基， 利用栀子苷经 - 葡萄糖苷酶水解后生成京尼平与 甘氨酸反应生成蓝色。
15、， 判断是否存在产 - 葡萄糖苷酶真菌菌株， 工艺为 ： 0025 (1) 菌种初筛 ： 土壤经预处理后取 1mL 至盛有 (25mL/250mL) 富集培养基中培养， 28， 180r/min， 培养 36h ； 0026 富集培养基的组成以 g/100mL 计为 ： (NH4)2SO40.3， MgSO47H2O 0.05， NaCl0.2， KH2PO40.1， 纤维素 0.5， 氨苄霉素适量， 115灭菌 30min ； 0027 保藏培养基 ： PDA 琼脂斜面固体培养基 ； 0028 初筛培养基组成以 g/100mL 计为 ： PDA 中加入栀子粉水浸液 1， 甘氨酸 1， 培养 。
16、72h 后放入 50培养箱中保温 6h ； 0029 经过初筛 ( 含有栀子苷的 PDA 平板 )， 有四株菌株在初筛平板中有蓝色显色圈， 说 明这四株菌能够产生 - 葡萄糖苷酶， 将这四株菌命名为 Y-1， Y-2， Y-3， Y-4 ； 0030 (2) 菌种复筛 ： 初筛获得的菌种以栀子粉作为碳源发酵， 利用 DNS 法测定酶活 0031 种子培养基组成以 g/100mL 计为 ： 可溶性淀粉 2.0， 葡萄糖 1.0， KH2PO40.1， MgSO40.1， NaNO30.2， 酵母膏 0.5， pH 4 ； 0032 液体发酵培养基组成以 g/100mL 计为 ： 麦麸粉 3.0，。
17、 (NH4)2SO40.2， KH2PO40.2， CaCl20.04， MgSO47H2O 0.04， pH 自然 ； 0033 测得 Y-1， Y-2， Y-3， Y-4 的酶活以 IU 计为 ： 0.3262， 0.2463， 0.3947， 0.9410。 0034 二、 菌种的筛选、 鉴定、 及发酵条件的优化 0035 1、 - 葡萄糖苷酶产生菌的筛选 0036 (1) 取土样平摊于一干净的纸上， 从四个角和中央各取一点土， 混匀后， 取 10g 土 样， 加入 90mL 无菌水， 装入盛有玻璃珠的三角瓶中， 振摇片刻， 将菌分散。取 1mL 悬浮液放 入盛有 9mL 无菌水的试管中。
18、， 吹吸三次， 并振摇使之充分混匀， 取 1mL 至盛有 (25mL/250mL) 富集培养基中培养， 28， 180r/min， 培养 36h。 0037 将菌液接用三区划线的方法接种于含有抗生素的 PDA 平皿中， 放入 28培养箱中 培养 4d， 获得单菌落， 在培养皿中加入抗生素可以抑制细菌生长， 从而达到筛选真菌的目 的。 0038 (2)将获得的单菌落接于初筛培养基上， 培养72h后放入50培养箱中保温6h， 取 出。挑选出有蓝色显色圈的单菌落接至 PDA 斜面培养基。 0039 初筛培养基组成以 g/100mL 计为 ： PDA 中加入栀子粉水浸液 1， 甘氨酸 1， 培养 72。
19、h 后放入 50培养箱中保温 6h ； 0040 (3) 选用生长正常、 孢子丰富的斜面孢子加一定量的无菌水， 打散孢子后， 用显微 镜计数， 并调节为每毫升孢子 (1.00+0.05)108个， 接入发酵培养基， 利用 DNS 法测定酶活 力。 0041 (4) 用移液枪吸取 1mL 样品 ( 枪头剪口 ) 于 EP 管中， 15000 转 / 分离心 5min ； 取 栀子粉 1g， 加水溶解至 100mL 容量瓶中， 取 2mL， 加入 pH4.8 的乙酸缓冲液 1.0mL， 混匀后再 加入发酵液样品溶液 1.0mL， 50水浴 40min， 取样品点样， 利用 TLC 法分析。 004。
20、2 2、 菌种的鉴定 0043 (1) 菌落形态观察 ： 将斜面菌点接至有 PDA 培养基的平皿中， 于 28培养 2d， 观察 说 明 书 CN 102382771 B 5 4/5 页 6 菌落形态。 0044 (2) 菌体形态观察 ： 真菌的水浸片观察 ： 在载玻片上加一滴无菌水， 用解剖针从霉 菌菌落边缘处挑取少量已产孢子的霉菌菌丝 ( 菌体 )， 先置于 50乙醇中浸一下以吸取脱 落的孢子， 再放在载玻片上的无菌水中， 用解剖针小心的将菌丝分散开。盖上盖玻片， 置低 倍镜 (40) 下观察， 必要时换高倍镜观察。 0045 (3) 菌株的 18S rDNA 鉴定 ： 0046 a. 基。
21、因组 DNA 的提取， 本实验的引物采用 18S rDNA 通用引物。 0047 b. 采用 25L 的 PCR 扩增体系 ： 0048 0049 c. 用于扩增目的基因的 PCR 条件 ： 0050 0051 通过将18S rDNA序列的扩增后进行琼脂糖凝胶电泳， 得到其大小为1800bp左右， 符合使用霉菌 18S rDNA 引物的预期扩增结果。最终选取最好的条带进行回收， 将回收的 DNA 送至北京六合华大基因科技股份有限公司测序。通过 Nucleotide BLAST 分析， 与黑曲 霉菌株的 18S rDNA 序列同源性为 99， 可初步确定 Y-4 菌株为黑曲霉。 0052 筛选出。
22、的黑曲霉菌种的保藏信息如下 ： 名称为黑曲霉 Y-4， 其分类命名为黑曲霉 Aspergillus niger， 保藏编号为 CGMCC NO.5141， 保藏日期 ： 2011 年 8 月 16 日， 保藏地址 为 ： 北京市朝阳区北辰西路 1 号院 3 号， 保藏单位 ： 中国微生物菌种保藏管理委员会普通微 生物中心。 0053 3、 黑曲霉 Y-4 发酵桅子条件的优化 0054 (1) 培养基成分 ： 将含有 3京尼平苷的栀子粉按照不同的比例与去离子水混合 进行配置， 使料水比以 g/mL 计为 ： 5、 10、 15、 20、 25， 煮沸、 过滤， pH 自然 ； 0055 (2) 。
23、发酵时间的确定 ： 在温度为 28、 pH7.0、 料水比为 10、 装液量为 20， 接种 量 1mL， 转速 180r/min 的条件下分别发酵 48、 72、 84、 96、 108、 120h， 按 HPLC 法测定发酵液中 京尼平的含量 ； 说 明 书 CN 102382771 B 6 5/5 页 7 0056 (3) 接种量的确定 ： 在温度为 28、 pH7.0、 料水比为 10、 装液量为 20、 转速 180r/min 的条件下接种量分别为 1mL、 2mL、 4mL 的条件下发酵 120h， 按 HPLC 法测定发酵液 中京尼平的含量 ； 0057 (4) 装液量的确定 ：。
24、 在温度为 28、 pH7.0、 料水比为 10、 接种量 1mL、 转速 180r/ min 的条件下装液量分别为 30mL、 50mL、 70mL、 90mL 的条件下发酵 120h， 按 HPLC 法测定发酵 液中京尼平的含量 ； 0058 (5) 发酵料水比的确定 ： 在温度为 28、 pH7.0、 装液量为 20、 接种量 1mL、 转速 180r/min 的条件下， 料水比分别为 5、 10、 15、 20、 25的条件下发酵 120h， 按 HPLC 法测定发酵液中京尼平的含量 ； 0059 通过单因素实验优化、 HPLC 检测确定确定黑曲霉发酵转化京尼平苷的最佳发酵条 件为 ：。
25、 发酵时间 96h， 接种量为 10， 250mL 三角瓶中装液量 50mL， 料水比 10。 0060 4、 产物鉴定及转化率的测定分析 0061 用单因素实验确定的各因素最佳条件进行发酵， 然后取发酵液样品 1mL 于 EP 管 中， 加入等体积的乙酸乙酯萃取， 12000r/min 离心 5min， HPLC 法检测发酵液中京尼平苷转 化率 ： 取上清液于另一 EP 管， 待乙酸乙酯完全挥发后， 于甲醇水 45 55 溶解， 然后用 HPLC 法检测。 0062 色谱条件 ： ODS-2HPERSIL C18 色谱柱 (4.6mm250mm， 5.0m)， 甲醇、 去离子水超 声 15m。
26、in 脱气， 流动相甲醇水 45 55 ； 检测波长为 238nm ； 流速 1mL/min ； 柱温为 25； 进样量 20L。 0063 精密称取京尼平 1.00mg 置于 1.5mL 的 EP 管中， 加甲醇水 45 55 溶解， 精确 吸取20、 40、 60、 80、 100L的对照品溶液到1.5mL的EP管中， 并用甲醇水4555溶液 稀释至 100L， 然后吸取 20L 进行测定。以峰面积 (Y) 对含量 (X) 做回归计算。结果表 明， 在0.21mg/mL范围内， 京尼平有良好的线性关系， 回归方程为 ： Y7868.9X-389.19， R2 0.963。 0064 京尼平。
27、的产物 TLC 法分析 ： 以栀子粉溶液、 京尼平标准溶液作为对照品溶液， 分别 点样 5L 于 GF254 薄层板 (50100mm)， 以醋酸乙酯 ( 乙酸 ) ： 石油醚 (1 1) 为展开剂， 紫外灯 254nm 下检测。 0065 三、 利用黑曲霉 Y-4 转化发酵制备京尼平的方法， 步骤如下 ： 0066 (1) 培养基的配置 ： 斜面培养基 (PDA)(1000mL) ： 马铃薯 200g 切块， 加 1000mL 水 煮沸 30 分钟， 滤去马铃薯块， 将滤液补足至 1000mL， 加葡萄糖 20g， 琼脂 20g， 溶化后分装， 115灭菌， 15min ； 0067 摇瓶发。
28、酵培养基 ： 将 50g 栀子粉溶于 500mL 去离子水中， 使料水比为 (g/ml)10， 煮沸、 过滤， pH 自然， 分装到 10 个 250mL 的三角瓶中， 121灭菌， 20min ； 0068 (2)种子制备 ： 将保存的黑曲霉Y-4孢子接种于斜面培养基上， 置28恒温箱培养 3 天， 获得母斜面， 选用生长正常、 孢子丰富的斜面孢子加一定量的无菌水， 打散孢子后， 用 显微镜一一记数， 并调节为每毫升孢子 (1.000.05)108个， 接入摇瓶发酵培养基 ； 0069 (3) 微生物转化制备京尼平 ： 在温度为 28、 pH7.0、 料水比为 10、 装液量为 50ml、 接种量为 10、 转速 180r/min 的条件下发酵 96h， 按 HPLC 法测定发酵液中京尼平的 含量， 并计算其转化率。分析测定转化率， 转化率为 14。 说 明 书 CN 102382771 B 7 1/2 页 8 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 102382771 B 8 2/2 页 9 图 3 说 明 书 附 图 CN 102382771 B 9 。