技术领域
本发明属于植物细胞培养技术领域，具体涉及一种具有高产10-DAB特性的红豆杉细胞株（Taxus wallichiana var. mairei）及其应用。
背景技术
10-去乙酰巴卡亭Ⅲ (10-deacetyl baccatinⅢ，简写为10-DAB )是从红豆杉短枝叶中分离、提取得到的一种紫杉烷二萜类化合物，不但自身有抗癌活性，而且是生物合成与化学半合成紫杉醇和多烯紫杉醇的重要前体化合物，在解决临床治疗和科学研究用紫杉醇和多烯紫杉醇药源问题中起着不可替代的作用。国内外学者对红豆杉细胞悬浮培养生产紫杉醇进行了大量的基础性研究工作，但离工业化生产还有很大的距离。有关红豆杉细胞培养生产10-DAB的研究报道很少。本发明通过红豆杉细胞培养生产10-DAB，再经过化学半合成生产紫杉醇和多烯紫杉醇，是一条在不破坏红豆杉野生植物资源基础上能实现资源再生利用的有效途径。
10-DAB即10-脱乙酰基巴卡丁Ⅲ（10-Deacetylbaccatin Ⅲ，CAS NO: 32981-86-5），可以从红豆杉中提取，其最主要的作用是作为多烯紫杉醇的合成前体。多烯紫杉醇同紫杉醇一样是抗癌药物，但由于紫杉醇的水溶性差，阻碍了活性的发挥，所以溶解性更好的多烯紫杉醇成为了紫杉醇的替代品。相较于紫杉醇，多烯紫杉醇具有如下特点：
1、水溶性更优，是紫杉醇的数十倍；
2、活性更高，其活性是相同剂量的紫杉醇的数倍；
3、所需治疗的总费用远远小于紫杉醇
但是目前多烯紫杉醇无法通过天然植物提取，只能通过生产10-DAB后利用化学物理合成方法进行生产。因此开发10-DAB的大规模细胞培养生产具有良好的市场前景。
发明内容
本发明的目的是提供一种高产10-DAB的红豆杉细胞株。为了解决此问题，本发明所采用的技术方案是：
一种具有高产10-DAB特性的红豆杉细胞株（Taxus wallichiana var. mairei），命名为：南方红豆杉植物细胞系N12#，由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号CGMCC No.10001。
本发明进一步公开了具有高产10-DAB特性的红豆杉细胞株（Taxus wallichiana var. mairei），保藏号CGMCC No.10001在用于制备多烯紫杉醇合成前体药物方面的应用。特别是用于制备紫杉醇和多西紫杉醇原料药前体的生产方面的应用。
本发明更进一步公开了具有高产10-DAB特性的红豆杉细胞株（Taxus wallichiana var. mairei），保藏号CGMCC No.10001的筛选方法，其特征在于按如下的步骤进行：
（1）外植体诱导愈伤细胞。
（2）愈伤组织稳定继代生长
（3）固体愈伤细胞小细胞团法选种和启动液体悬浮培养自然选种。
本发明还公开了采用10-DAB特性的红豆杉细胞株，生产10-去乙酰巴卡亭Ⅲ的方法，其特征在于：
（1）固体愈伤细胞自然生产。
（2）液体悬浮培养自然生产。
（3）液体悬浮培养组合调控的方法获得高产。
具体是将14代悬浮细胞接种按照称重法接种鲜细胞至PN调控培养基，培养基用100ml三角瓶装量20ml，接种量6g/瓶，分两步法培养，周期28天，暗培养，100转/分，采用25℃培养。在细胞培养的第4天添加甲基茉莉酸100μM，第10天添加硝酸银10μM，第28天收获细胞和培养液。结果：10-DAB产量达150mg/L，产物还有紫杉醇50mg/l和微量巴卡亭Ⅲ
本发明还公开了具有高产10-DAB特性的红豆杉细胞株（Taxus wallichiana var. mairei）通过特异性扩增18S的部分ITS片段与南方红豆杉序列进行比对，序列一致，其特征在于从基因角度证明该10-DAB高产细胞系属于南方红豆杉。
本发明更加详细的技术内容如下：
（1）本发明提供的具有高产10-DAB特性的红豆杉细胞株（Taxus wallichiana var. mairei），命名为：南方红豆杉植物细胞系N12#，所述的细胞系是由北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏，命名南方红豆杉植物细胞系N12#，保藏日期2014年11月19日，保藏号CGMCC No.10001，分类学名称，曾用名Taxus mairei，Taxus chinensis var.mairei Cheng et L.K，最新分类学名Taxus wallichiana var. mairei。
（2）10-DAB特性的红豆杉细胞株（Taxus wallichiana var. mairei）的培养特征及生理生化指标：
1）本细胞株生长缓慢稳定，生长量2倍/14天，不易染菌，适应生长温度25℃，暗培养，生长最适PH值5.8，糖浓度20g/L。
2）本细胞株固体细胞偏干，棕色，培养基底部无分泌物；
3) 本细胞株悬浮细胞，细胞颗粒饱满，大小均匀，像小米粒，上清培养液乳白色，浑浊。
(3) 10-DAB特性的红豆杉细胞株（Taxus wallichiana var. mairei）的18S DNA ITS基因序列见图10 18S DNA ITS序列的blast比较图。
（4）10-DAB特性的红豆杉细胞株（Taxus wallichiana var. mairei）的筛选方法：首先进行外植体诱导，将固体愈伤组织多次继代，直至生长稳定，采用自然选种和组合调控两种方法进行选种。
固体自然选种，选择5代生长稳定，细胞状态颜色均匀的细胞团作为选种的出发细胞株，用小细胞团的方法来将一个2g左右的大细胞团通过称重法分成几个小的0.5g的小细胞团，培养一个周期后，取每个细胞团的一半检测一半继续继代培养。目的是通过小细胞团，将不同特性的细胞分开，达到选种的目的。
液体悬浮培养自然选种，选择5代生长稳定，细胞状态均已一致的的固体愈伤细胞进行各种激素培养基的液体悬浮，采用称重法接种，多次继代培养，每次继代检测细胞培养上清液和细胞样。目的是通过激素的变化刺激细胞株，达到选种的目的。
液体悬浮培养组合调控方法选种，仍然采用液体悬浮的方法将细胞进行悬浮培养放大，再去组合调控，通过添加前体、调控剂等，刺激细胞，达到选种目的。
本发明公开的10-DAB特性的红豆杉细胞株（Taxus wallichiana var. mairei）所具有的有益效果在于：
（1）本文通过红豆杉细胞培养生产10-DAB，再经过化学半合成生产紫杉醇和多烯紫杉醇，是一条在不破坏红豆杉野生植物资源基础上能实现资源再生利用的有效途径。
(2)产量高，成本低。本细胞株具有高产10-DAB 的特性，产量高达120mg/L,据报道，新鲜红豆杉外植体叶片中10-DAB含量3mg/g（干重），本发明中1L的产量需要40g干重的红豆杉叶片，即需要大约400g的新鲜叶片。本细胞株生成1L产物的成本远远小于种植红豆杉的土地，人工等费用。解决了红豆杉资源的频繁砍伐和种植。
(3)提取分离纯化简单，收率高。本细胞株生成10-DAB ,细胞培养结束后，下游提取分离纯化简单，收率高达80%以上。再次保护了红豆杉自然资源，并且为合成紫杉醇和多西紫杉醇提供了原料。
附图说明：
图1为样品检测图谱；愈伤细胞悬浮培养14天后，培养基上清液中的10-DAB的UPLC检测图谱；
图2为样品+STD 图谱；图1中W422样品加10-DAB标准品后的UPLC检测图谱。
图3为外植体图；自然界生长的红豆杉的嫩茎；
图4 为诱导成功愈伤细胞的外植体图；外植体嫩茎经过诱导后，含有愈伤细胞的外植体状态；
图5为14代的愈伤细胞图；外植体诱导的愈伤组织细胞，经过14代稳定继代后的细胞；
图6 为15代悬浮细胞图；细胞在液体培养基生长15代的悬浮状态；
图7为400倍放大镜检细胞图片；悬浮细胞在显微镜下物镜40倍放大，目镜10倍观察的细胞；
图8为纯化样品色谱图； 经过调控的28天悬浮细胞和上清液，去除部分杂质后的10-DAB的UPLC图谱；
图9为纯化样品中10-DAB质谱图；其中保留时间为0.545min色谱峰的545.3([M+H]+)及591.3([M+2Na+H]+)可以判断该峰对应的化合物为10-DAB；
图10 18S DNA ITS序列及blast比对图；其中特异性扩增片段都分布在南方红豆杉属中，序列覆盖范围(Query coverage)均达到99％，最大相似性(Max identity)均在99％以上。
具体实施方式：
具体实施方式：
下面结合实施例说明本发明，这里所述实施例的方案，不限制本发明，本领域的专业人员按照本发明的精神可以对其进行改进和变化，所述的这些改进和变化都应视为在本发明的范围内，本发明的范围和实质由权利要求来限定。下面通过实例来进一步阐明10-DAB特性的红豆杉细胞株的制备方法。本发明所用到的试剂除特别指出外均有市售。
实施例1
产10-DAB高产细胞株保藏号CGMCC No.10001的诱导
（1）由南方红豆杉外植体诱导细胞株的愈伤组织保藏号CGMCC No.10001
将外植体进行清洗、75%酒精消毒、0.1%氯化汞消毒，接种、培养。
1、 外植体消毒
1.1清洗
将外植体放入清水盆中，加少量洗洁精，用手轻轻搓洗外植体表面，然后用干净的自来水冲洗3遍，用纯化水冲洗3遍，最后用超纯水冲洗3遍。洗干净后放置在干净的滤纸上，将叶片和嫩茎分开，叶片放在有干净滤纸的平皿内，吸取多余的水分，并盖上盖子。嫩茎用剪刀剪成小段，同样放在有干净滤纸的平皿内盖好盖子等待消毒备用。
1.2消毒
将洗干净的叶片和嫩茎，倒入烧杯内，先用75%酒精消毒30s，将酒精倒掉，用无菌水清洗2遍，每遍1-2min。再用氯化汞溶液消毒15min，再用无菌水清洗3遍，每遍1-2min。消毒完毕后，放入无菌平皿内，接种备用。
2、 接种
2.1叶片的接种
用镊子夹取叶片，用剪刀将叶片中间剪若干小口。将剪好的叶片接种至诱导培养基内，每个平皿内接种5-6个叶片。
2.2 嫩茎的接种
将消毒好的嫩茎段，用镊子夹取，并用剪刀剪成适当长度的小段，接种至诱导培养基内，每个平皿内接种5-6个茎段。
3、 培养及诱导：将接种好叶片和茎段的平皿用封口膜包好，放置在25±1℃培养箱，暗培养，周期30天
（1）诱导结果 诱导培养基及诱导率：将叶片和茎段接入B5优化、WPM、B5-PVP、WR、B5-US五种培养基 (详见诱导培养基见表1)
pH至5.8,115℃,15min灭菌，倒平板培养基备用。
叶片的诱导：WR培养基诱导率最高，愈伤细胞量很大，细胞黄绿色，透明；
茎段的诱导：除了B5-US外，诱导率均很高，愈伤细胞量大，细胞黄或黄绿色；见附图4。
实施例2
产10-DAB细胞株愈伤组织的继代。
细胞诱导成功后，每21天继代一次，在继代过程中，细胞出现褐变、变干的现象。通过调整继代培养基和添加抗褐变剂解决褐变问题，经过一系列实验，添加了VC、PVP 、L-谷氨酰胺等，继代调整后转入B5+2,4-D(1mg/l)+6-BA(0.1mg/l)+L-谷氨酰胺(0.2928g/l)+VC(100mg/l)后，细胞状态稳定，褐变减轻；细胞稳定继代
愈伤细胞共继代13代，其中在WR培养基继代7次，之后转入B5-15即标记为B5-15(12#WR茎转5代)，继代愈伤组织。见附图5。
实施例3
菌株的分类学鉴定：
（1）鉴定方法选择18S DNA ITS测序，再根据序列进行系统进化分析，
从遗传的生物信息进行种属鉴定。植物细胞全基因组DNA提取：按上海生工公司 Ezup柱式植物基因组DNA抽提试剂盒SK8261说明书操作；无液氮，在材料中直接加热的 Buffer PCB溶液研磨，植物全基因组TE溶解后，放在-20℃冻存；PCR与核酸电泳：引物对：rDNA-18S-F序列：5’- GCG GTA GGA TCA TTG TCG-3’；ITS4-R序列：5’- TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3’ 上海生工公司合成，底物就是提取并纯化的植物细胞全基因DNA。按上海生工公司 Taq PCR Master Mix试剂盒BS9293说明书操作，进行PCR；PCR之后，进行1%w/v琼脂糖凝胶电泳，电压150V，恒电流电泳后，EB染色。结果：PCR产物明亮单一，分子量估计为1100bp。PCR产物放在-20℃冻存，之后低温下运输到上海生工公司测序。根据生工返回的序列打印稿与emal返回的电子稿；使用MEGA5.2软件，进行R序列的反向互补序列与F序列对齐；如果2个序列不一致，则650序列之前以F序列为准，之后以R序列为准；合并2个序列，即得完整序列。确定本细胞系的18S DNA ITS序列直接在MEGA5.2上Blast Sequence,连接ncbi网络，返回结果见图10。由网站搜索结果和图10，可得结论：此细胞系属于Taxus mairei， Taxus wallichiana var. mairei，即俗称的南方红豆杉，当前分类学上的须弥红豆杉南方变种。
（2）愈伤细胞进行固转液悬浮继代培养：14天，100rpm，25℃,暗培养。挑选3次继代稳定的WR培养基的茎段愈伤细胞进行固转液悬浮，用镊子夹取固体细胞转入WR液体培养基，用100ml三角瓶装20ml培养基，称重法量取细胞，接种量2.2g/瓶。14天后，接种至新鲜的培养基内进行培养
前三代细胞生长量低，褐变严重，从第4代开始部分转入B5-15，并添加1:1细胞培养液为条件液，直到第7代时，WR培养基细胞没有生长，褐变严重；B5-15培养基细胞生长量稳定在2倍，没有褐变，并可以转入250ml(持液量50ml，接种量5g)三角瓶培养去放大
在250ml三角瓶生长稳定3代，转入500ml三角瓶(持液量100ml，接种量10g)。悬浮细胞，见附图6。
实施例4
产物的定量检测和定性鉴定
1）检测材料
样品：第14代悬浮第14天细胞；
10-DAB标准品
乙醇、甲醇、去离子水
超声清洗仪、细胞破碎仪
UPLC
检测方法：
液体样品处理
1 抽滤后，量取培养基15ml于45ml离心管中。
2 加入15ml乙酸乙酯，震荡涡旋萃取，静置分层。
3 分层明显后，取上层乙酸乙酯层。
4 将乙酸乙酯提取液减压蒸干，水浴温度不超过50℃。
5 将萃取物用色谱甲醇定容至1ml，置于EP管中
6 12000rpm，离心10min。取100ml，转入装有内存管的液相小瓶中，待测。
加标样验证：取180μl样品溶液(W422-Y、W418-Y、W419-Y)，加入20μl 120μg/ml 的10-DAB标准品，混匀，4℃保存备用。
3)UPLC 检测
色谱条件：Waters H class UPLC 方法名称：10-DAB
检测波长：230nm 柱温：35℃； 进样量:1 μl；
色谱柱：ACE EXCEL 2 CN 100x2.1mm EXL-104-1002U
4）检测结果
通过检测图谱，证明样品中有10-DAB,原始细胞悬浮上清有10-DAB 1.3ug/ml，证明细胞株有产10-DAB的基因见附图1，附图2。
对悬浮细胞进行调控，第28天收集细胞和培养液，按以上流程处理，获得10-DAB结果是120mg/l。附图8。为了验证10-DABD的存在，对样品进行了提纯，达到LC-MS的进样要求（浓度达到270μg/ml，且样品溶液为无色透明状），所以通过LC-MS对样品进一步分析，根据附图9中保留时间为0.5min色谱峰的545.3（[M+H]+）及591.3（[M+2Na+H]+）可以判断该峰对应的化合物为
实施例5
本发明获得的10-DAB细胞株在生产10-DAB的情况
方法：液体悬浮培养组合调控
步骤：将14代悬浮细胞接种按照称重法接种鲜细胞至PN调控培养基培养基用100ml三角瓶装量20ml，接种量6g/瓶，分两步法培养，周期28天，暗培养，100转/分，采用25℃培养。在细胞培养的第4天添加甲基茉莉酸100μM，第10天添加硝酸银10μM，第28天收获细胞和
结果：10-DAB产量达150mg/L，产物还有紫杉醇50mg/l和微量巴卡亭Ⅲ。
实施例6
10-DAB细胞株生产10-DAB后再经过化学半合成生产紫杉醇和多烯紫杉醇(多西他赛)的情况：
方法：化学合成紫杉醇：如崔正华等研究得到的方法为选择性乙酰化形成巴卡亭Ⅲ，在用三乙基硅选择性保护C-7基团得到7-TES-巴卡亭Ⅲ，最后与侧链酸缩合后在甲醇中开环去保护得到紫杉醇，具体化学合成路线如下：
化学合成多西他赛：如陈允裔得到的方法为选择性酯化保护C-7和C-10羟基，然后与特定的酮进行C-13缩合反应，最后出去C-7、C-10和C-13的保护基团形成多西他赛，经过柱层析分离后用无水乙醇-水体系重结晶得到稳定的多西他赛三水化合物，具体化学合成路线如下：
步骤：
化学合成紫杉醇：以崔正华等研究为例，以10-DAB为起始物料，以三氯化铈为催化剂，5-10℃条件下与醋酐反应3小时，生成巴卡亭Ⅲ;以咪唑为缚酸剂，将巴卡亭Ⅲ与2倍摩尔量的三乙基氯硅烷反应生成7-O-三乙基硅巴卡亭Ⅲ;产物经1.2倍摩尔量EDC·HCl/DMAP催化下，与1.2倍摩尔量的紫杉醇侧链酸缩合生成紫杉醇缩合物，最后在25-30℃条件下与7倍摩尔量盐酸作用，缩合物母核脱去保护、侧链开环，生成紫杉醇粗品，经二氯甲烷-丙酮-石油醚体系精制两次得紫杉醇成品。
化学合成多西他赛：以陈允裔等研究为例，10-DAB与三氯乙氧甲酞氯进行酯化反应，将10-DAB中的C-7和C-10的经基保护起来，形成7，10-二(2,2,2三氯乙氧羰基)-10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ，然后与1-叔丁氧羰基-3-三乙基硅基-4-苯基-2-吖啶酮在C-13进行缩合反应，形成2-(三乙基硅基)-7，10-二(2,2,2三氯乙氧羰基)多西紫杉醇，接着在乙酸-水-锌-盐酸的体系中同时脱掉母核C-7和C-10以及C-13侧链上的保护基，得到多西他赛粗品。以乙酸乙酷-石油醚为洗脱剂，对多西他赛粗品进行柱层析分离，最后用乙醇-水重结晶，得到多西他赛三水化合物。
结果：
化学合成紫杉醇：总收率65%，纯度99.7%。
化学合成多西他赛：总收率35.9%，精制所得多西他赛三水化合物的纯度为94.3%，折算为多西他赛无水化合物的纯度达到100.7%。
参考文献：
SEQUENCE LISTING
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