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一种生长抑素的合成方法.pdf

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1、(10)授权公告号 CN 1552728 B (45)授权公告日 2012.04.18 CN 1552728 B *CN1552728B* (21)申请号 03128951.7 (22)申请日 2003.05.29 C07K 7/08(2006.01) C07K 1/04(2006.01) C07K 17/02(2006.01) (73)专利权人上海苏豪逸明制药有限公司地址 200333 上海市普陀区千阳路 57 号专利权人周逸明 (72)发明人周逸明 (74)专利代理机构上海世贸专利代理有限责任公司 31128 代理人叶克英 CN 1257871 A,2000.06.28, 。

2、全文 . 周贺钺等人 . 甲状旁腺素 1-34 肽的固相合成 .中国生化药物杂志 .2002, 第 23 卷 ( 第 3 期 ),109-111. 周逸明等人 . 加压素固相合成方法的研究 .中国医药工业杂志 .2000, 第 31 卷 ( 第 2 期 ),53-55. (54) 发明名称一种生长抑素的合成方法 (57) 摘要本发明公开一种生长抑素多肽的合成方法，将 Wang 树脂为起始原料，以 Fmoc 保护的氨基酸为单体，逐个接上氨基酸，用切肽试剂 (TFA/ EDT/H2O/TIS) 进行切肽，加入乙醚沉淀粗肽，在 pH7.0-10.0，于15-35下，通空气氧。

3、化，用C18柱进行分离纯化。该方法操作简单，生产成本明显降低，有利于生长抑素的国产化生产。 (51)Int.Cl. (56)对比文件审查员汪波莉 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利权利要求书 3 页说明书 8 页附图 1 页 CN 1552728 B1/3 页 2 1. 一种生长抑素的合成方法，其特征在于，该方法包括下列步骤： (1) 将 Wang 树脂为起始原料，以 Fmoc 保护的氨基酸为单体，逐个接上氨基酸； (2) 用切肽试剂进行切肽，加入乙醚沉淀粗肽； (3) 在 pH7.0-10.0，于 15-35下，通空气氧化； (。

4、4) 用 C18 柱进行分离纯化。 2. 根据权利要求 1 所述的生长抑素的合成方法，其特征在于，制备 Fmoc-Cys(Trt)-Wang 树脂；将 Wang 树脂装入反应容器中，用 DMF 浸泡、洗涤，加 Fmoc-Cys(Trt)-OH、 TBTU、 HOBT，用接肽试剂溶解，加入反应容器， 25-40反应 0.5-1 小时，滤干，用 DMF 洗涤三次，滤干，加入封头试剂， 25-40 C 反应 0.5-1 小时，同上洗涤，滤干。 3. 根据权利要求 1 或 2 所述的生长抑素。

5、的合成方法，其特征在于，制备 Fmoc-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Wang 树脂；在上述脱帽反应后的树脂中，加入 Fmoc-Ser(tBu)-OH、 TBTU、 HOBT，用接肽试剂溶解，加入反应容器， 25-40反应 0.5-1 小时，滤干，分别用DMF、无水乙醇、 DCM和DMF各洗涤三次，滤干，加入脱帽试剂， 25-40反应5-10 分钟，同上洗涤，滤干。 4.根据权利要3所述的生长抑素的合成方法，其特征在于，制备Fmoc-Thr(tBu)-Ser(t Bu)-Cys(Trt)-Wang 树脂；在上述脱帽。

6、反应后的树脂中，加 Fmoc-Thr(tBu)-OH、 TBTU、 HOBT，用接肽试剂溶解，加入反应容器 25-40反应 0.5-1 小时，滤干，分别用 DMF、无水乙醇、 DCM 和DMF各洗涤三次，滤干，加入脱帽试剂， 25-40反应5-10分钟滤干，用DMF、无水乙醇、 DCM 和 DMF 各洗涤三次，滤干。 5. 根据权利要求 4 所述的生长抑素的合成方法，其特征在于，制备 Fmoc-Phe-Thr(t Bu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Wang 树脂；在上述脱帽反应后的树脂中，加 Fmoc-Phe-OH、 TBTU、 HOBT，用接肽试剂。

7、溶解，加入反应容器， 25-40反应 0.5-1 小时，滤干，分别用 DMF、无水乙醇、 DCM 和 DMF 各洗涤三次，滤干，加入脱帽试剂， 25-40反应 5-10 分钟滤干，用 DMF、无水乙醇、 DCM 和 DMF 各洗涤三次，滤干。 6. 根据权利要求 5 所述的生长抑素的合成方法，其特征在于，制备 Fmoc-Thr(t Bu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Wang 树脂；在上述脱帽反应后的树脂中，加 Fmoc-Thr(tBu)-OH、 TBTU、 HOBT，用接肽试剂溶解，加入反应容器，。

8、25-40反应 0.5-1 小时，滤干，分别用DMF、无水乙醇、 DCM和DMF各洗涤三次，滤干，加入脱帽试剂， 25-40反应5-10 分钟滤干，用 DMF、无水乙醇、 DCM 和 DMF 各洗涤三次，滤干。 7. 根据权利要求 6 所述的生长抑素的合成方法，其特征在于，制备 Fmoc-Lys(Boc)-T hr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Wang 树脂；在上述脱帽反应后的树脂中，加 Fmoc-Lys(Boc)-OH、 TBTU、 HOBT，用接肽试剂溶解，加入反应容器， 25-40反应 0.5-1 小时，滤干，。

9、分别用DMF、无水乙醇、 DCM和DMF各洗涤三次，滤干，加入脱帽试剂， 25-40反应5-10 分钟滤干，用 DMF、无水乙醇、 DCM 和 DMF 各洗涤三次，滤干。 8. 根据权利要求 7 所述的生长抑素的合成方法，其特征在于，制备 Fmoc-Trp(Boc)- Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Wang 树脂；在上述脱帽反应后的树脂中，加 Fmoc-Trp(Boc)-OH、 TBTU、 HOBT，用接肽试剂溶解，加入反应容器， 25-40反应 0.5-1 小时，滤干，分别用 DMF、无水。

10、乙醇、 DCM 和 DMF 各洗涤三次，滤干，加入脱帽试剂， 25-40反应 5-10 分钟滤干，用 DMF、无水乙醇、 DCM 和 DMF 各洗涤三次，滤干。权利要求书 CN 1552728 B2/3 页 3 9. 根据权利要求 8 所述的生长抑素的合成方法，其特征在于，制备 Fmoc-Phe-Trp(B oc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Wang 树脂；在上述脱帽反应后的树脂中，加 Fmoc-Phe-OH、 TBTU、 HOBT，用接肽试剂溶解，加入反应容器， 25-40反应 0。

11、.5-1 小时，滤干，分别用 DMF、无水乙醇、 DCM 和 DMF 各洗涤三次，滤干，加入脱帽试剂， 25-40反应 5-10 分钟滤干，用 DMF、无水乙醇、 DCM 和 DMF 各洗涤三次，滤干。 10. 根据权利要求 9 所述的生长抑素的合成方法，其特征在于，制备 Fmoc-Phe-Phe-Tr p(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Wang 树脂；在上述脱帽反应后的树脂中，加 Fmoc-Phe-OH、 TBTU、 HOBT，用接肽试剂溶解，加入反应容器， 25-40反应 0.5。

12、-1 小时，滤干，分别用 DMF、无水乙醇、 DCM 和 DMF 各洗涤三次，滤干，加入脱帽试剂， 25-40反应 5-10 分钟滤干，用 DMF、无水乙醇、 DCM 和 DMF 各洗涤三次，滤干。 11.根据权利要求10所述的生长抑素的合成方法，其特征在于，制备Fmoc-Asn(Trt)-P he-Phe-Trp(Bot)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Wang 树脂；在上述脱帽反应后的树脂中，加 Fmoc-Asn(Trt)-OH、 TBTU、 HOBT，用接肽试剂溶解，加入反应容器， 25。

13、-40 C 反应 0.5-1 小时，滤干，分别用 DMF、无水乙醇、 DCM 和 DMF 各洗涤三次，滤干，加入脱帽试剂， 25-40反应 5-10 分钟滤干，用 DMF、无水乙醇、 DCM 和 DMF 各洗涤三次，滤干。 12. 根据权利要求 11 所述的生长抑素的合成方法，其特征在于，制备 Fmoc-Lys(Boc)- Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Wa ng 树脂；在上述脱帽反应后的树脂中，加 Fmoc-Lys(Boc)-OH、 TBTU、。

14、HOBT，用接肽试剂溶解，加入反应容器， 25-40反应 0.5-1 小时，滤干分别用 DMF、无水乙醇、 DCM 和 DMF 各洗涤三次，滤干，加入脱帽试剂， 25-40反应 5-10 分钟滤干，用 DMF、无水乙醇、 DCM 和 DMF 各洗涤三次，滤干。 13. 根据权利要求 12 所述的生长抑素的合成方法，其特征在于，制备 Fmoc-Cys(Trt)- Lys(Boc)-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cy s(Trt)-Wang 树脂；在上述脱帽反应后的树。

15、脂中，加 Fmoc-Cys(Trt)-OH、 TBTU、 HOBT，用接肽试剂溶解，加入反应容器， 25-40反应 0.5-1 小时，滤干，分别用 DMF、无水乙醇、 DCM 和 DMF 各洗涤三次，滤干，加入脱帽试剂， 25-40 C 反应 5-10 分钟滤干，用 DMF、无水乙醇、 DCM 和 DMF 各洗涤三次，滤干。 14.根据权利要求13所述的生长抑素的合成方法，其特征在于，制备Fmoc-Gly-Cys(Tr t)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(t。

16、Bu) -Cys(Trt)-Wang 树脂；在上述脱帽反应后的树脂中，加 Fmoc-Gly-OH、 TBTU、 HOBT，用接肽试剂溶解，加入反应容器， 25-40 C 反应 1 小时，滤干，分别用 DMF、无水乙醇、 DCM 和 DMF 各洗涤三次，滤干，加入脱帽试剂， 25-40反应 5-10 分钟滤干，用 DMF、无水乙醇、 DCM 和 DMF 各洗涤三次，滤干。 15. 根据权利要求 14 所述的生长抑素的合成方法，其特征在于，制备 Fmoc-Ala-Gly-C ys(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp(Boc)-Ly。

17、s(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser (tBu)-Cys(Trt)-Wang 树脂；在上述脱帽反应后的树脂中，加 Fmoc-Ala-OH、 TBTU、 HOBT，用接肽试剂溶解，加入反应容器， 25-40 C 反应 0.5-1 小时，滤干，分别用 DMF、无水乙醇、 DCM 和DMF各洗涤三次，滤干，加入脱帽试剂， 25-40反应5-10分钟滤干，用DMF、无水乙醇、 DCM 权利要求书 CN 1552728 B3/3 页 4 和 DMF 各洗涤三次，滤干。 16.根据权利要求1所述的生长抑素的合成方法，其特征在于，接肽反应结。

18、束后用DCM、 DMF、无水乙醇分别洗涤三次，滤干后，放入真空干燥器中干燥。 17. 根据权利要求 1 所述的生长抑素的合成方法，其特征在于，切肽方法是将保护十四肽树脂转移到 500ml 茄形瓶中，加入切肽试剂 TFA/EDT/H2O/TIS ； 25-35搅拌 1.5-2 小时，滤去树脂，树脂用20TFA的DCM溶液洗3次，合并滤液及洗涤液，加入适量乙醚沉淀，离心收集，用无水乙醚洗后， P2O5真空干燥，得还原型生长抑肽粗品。 18. 根据权利要求 1 所述的生长抑素的合成方法，其特征在于，将粗肽溶于 10冰醋酸，加一定量水，在搅拌下慢慢滴加 1.5M。

19、 NaOH 至 pH7.0-10.0，于 15-20下，通空气氧化 12-24 小时，用 50冰醋酸调至 pH4.5-5.0，加活性碳搅拌 30-60 分钟，过滤。 19.根据权利要求1所述的生长抑素的合成方法，其特征在于，用C18柱进行分离纯化，流动相为 6-8 2-4 的 0.1M NH4Ac 乙腈；检测波长为： 280nm，用液相色谱仪跟踪收集所需要的流出液，样品峰合并后冻干。权利要求书 CN 1552728 B1/8 页 5 一种生长抑素的合成方法技术领域 0001 本发明涉及多肽合成方法的改进，具体是指一种生长抑素的合成方法改进。背景技术。

20、0002 生长抑素的英文名： Somatostatin， Stilamin 0003 结构式： 0004 0005 分子式及分子量： C76H104N18O19S2， 1637.9。 0006 生长抑素是下丘脑的正中隆起和胰岛的细胞合成的。1973 年由 Burgus 和 Brazean 等人首先由下丘脑分离得到并阐明其结构。化学结构为分子内带有一对二硫键的十四肽。其生物功能可抑制腺体释放生长激素、抑制促甲状腺和肾上腺皮质激素、抑制胰腺的内分泌与外分泌、抑制胃粘膜释放胃泌素、抑制肠粘膜释放肠促胰激素和肾脏释放肾素，降低门静脉压力、松弛胆道口括约肌、刺激单核巨噬细胞系。

21、统而减轻内毒素血症，抑制血小板活化因子的释放，直接或间接调节细胞因子链产生细胞保护作用，并可增强抗癌药物的抗增殖作用。临床常应用于严重急性食管静脉曲张破裂出血，严重急性胃、十二指肠溃疡出血，急性糜烂性胃炎或出血性胃炎，胰、胆和肠屡的辅助治疗，糖尿病酮症酸中毒的辅助治疗。 0007 在国外，合成的生长抑素早已成为商品用于临床，并于 1997 年收载入欧洲药典。瑞士的 Serono 公司生产的生长抑素，其商品名为施他宁 (Stilamin)，迄今为止也是世界上唯一的生产公司，目前独占我国市场，注册证号为， X930471。 0008 现有合成方法为选用。

22、Wang 树脂作为起始物，采用片段固相缩合法合成 . 文献主要有片段固相缩合法合成生长激素释放抑制素 “生物化学与生物物理学报” 17， 1， 1985， 128-137。但该法需预先制备四个片段肽，反应周期较长，操作较繁琐 . 0009 国外文献的有关合成方法； Solid phase synthesis of partially protected and freepeptides containing disulphide bonds by simultaneous cysteine oxidatio n-releasefrom2-chlorotrityl resin(Int。

23、.J.Peptide Protein Res.38， 1991， 562-568)。发明内容 0010 本发明需要解决的技术问题是提供一种生长抑素的合成方法，此方法操作简便，适于工业化生产。 0011 一 . 采用 Wang 树脂为起始原料，以 Fmoc 保护的氨基酸为单体，逐个接上氨基酸的方法。其中： 0012 1. 制备 Fmoc-Cys(Trt)-Wang 树脂 0013 取 12-15gWang 树脂 (1.01mmol/g 树脂， 12.12mmol) 装入反应容器中，用 150mlDMF 浸泡、洗涤。说明书 CN 1552728 B2/8 页 6 0014 。

24、加入 17.92g(FW ： 585.7， 30.6mmol)Fmoc-Cys(Trt)-OH、 9.82g(FW ： 321， 30.6mmol) TBTU、 4.68g(FW ： 153， 30.6mmol)HOBT，用 150ml 接肽试剂溶解，加入反应容器， 25-40反应 0.5-1 小时。滤干，用 DMF 洗涤三次，滤干。 0015 Kaiser 方法检测氨基为阴性。若显阳性加入，则应用上述量的 1/2 量补接一次。 0016 加入 150ml 的封头试剂， 25-40反应 0.5-1 小时。同上洗涤，滤干。 0017 2. 制备 Fmoc-Ser(tBu)-Cys(T。

25、rt)-Wang 树脂 0018 在上述脱帽反应后的树脂中，加入13.50g(FW ： 383.4， 30mmol)Fmoc-Ser(tBu)-OH、 9.6g(30mmol)TBTU、 4.6g(30mmol)HOBT，用 150ml 接肽试剂溶解，加入反应容器。25-40反应 0.5-1 小时。滤干，分别用 DMF、无水乙醇、 DCM 和 DMF 各洗涤三次，滤干。加入 150ml 脱帽试剂， 25-40反应 5-10 分钟，同上洗涤，滤干。 0019 3. 制备 Fmoc-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Wang 树脂 0020 在上述脱。

26、帽反应后的树脂中，加 11.9-13.9g(FW ： 397.4， 30mmol) Fmoc-Thr(tBu)-OH、 9.6-10g(30mmol)TBTU、 4.6-5g(30mmol)HOBT，用 150ml 接肽试剂溶解，加入反应容器。25-40反应 0.5-1 小时。滤干，分别用 DMF、无水乙醇、 DCM 和 DMF 各洗涤三次，滤干。加入 150ml 脱帽试剂， 25-40反应 5-10 分钟滤干，用 DMF、无水乙醇、 DCM 和 DMF 各洗涤三次，滤干。 0021 4. 制备 Fmoc-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Tr。

27、t)-Wang 树脂 0022 在上述脱帽反应后的树脂中，加 11.6-13g(FW ： 387.4， 30mmol)Fmoc-Phe-OH、 9.6-10g(30mmol)TBTU、 4.6-5g(30mmol)HOBT，用 150ml 接肽试剂溶解，加入反应容器。 25-40反应 0.5-1 小时。其余操作同上。 0023 5. 制备 Fmoc-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Wang 树脂 0024 在上述脱帽反应后的树脂中，加 11.9-13.9g(FW ： 397.4， 30mmol) Fmoc-Thr(tB。

28、u)-OH、 9.6-10g(30mmol)TBTU、 4.6-5g(30mmol)HOBT，用 150ml 接肽试剂溶解，加入反应容器。25-40反应 0.5-1 小时。其余操作同上。 0025 6. 制备 Fmoc-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Wang 树脂 0026 在上述脱帽反应后的树脂中，加13.9-15g(FW ： 468.6， 30mmol)Fmoc-Lys(Boc)-OH、 9.6-10g(30mmol)TBTU、 4.6-5g(30mmol)HOBT，用 150ml 接肽试剂溶解，加入。

29、应容器。 25-40反应 0.5-1 小时。其余操作同上。 0027 7. 制备 Fmoc-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt) 4-Wang 树脂 0028 在上述脱帽反应后的树脂中，加 12.83-14.83g(FW ： 427.5， 30mmol) Fmoc-Trp(Boc)-OH、 9.6-10g(30mmol)TBTU、 4.6-5g(30mmol)HOBT，用 150ml 接肽试剂溶解，加入反应容器。25-40反应 0.5-1 小时。其余操作同上。 0029 8. 制备 F。

30、moc-Phe-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys( Trt)-Wang 树脂 0030 在上述脱帽反应后的树脂中，加 11.6-13.6g(FW ： 387.4， 30mmol)Fmoc-Phe-OH、 9.6-10g(30mmol)TBTU、 4.6-5.0g(30mmol)HOBT，用 150ml 接肽试剂溶解，加入反应容器。 25-40反应 0.5-1 小时。其余操作同上。 0031 9. 制备 Fmoc-Phe-Phe-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(t。

31、Bu)- 说明书 CN 1552728 B3/8 页 7 Cys(Trt)-Wang 树脂 0032 在上述脱帽反应后的树脂中，加 11.6-13.6g(FW ： 387.4， 30mmol)Fmoc-Phe-OH、 9.6-10g(30mmol)TBTU、 4.6-5g(30mmol)HOBT，用 150ml 接肽试剂溶解，加入反应容器。 25-40反应 0.5-1 小时。其余操作同上。 0033 10. 制备 Fmoc-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu) -Ser(tBu)-Cys(Trt)-Wang 。

32、树脂 0034 在上述脱帽反应后的树脂中，加 17.90-19.0g(FW ： 596.7， 30mmol) Fmoc-Asn(Trt)-OH、 9.6-10g(30mmol)TBTU、 4.6-5.0g(30mmol)HOBT，用 150ml 接肽试剂溶解，加入反应容器。25-40反应 0.5-1 小时。其余操作同上。 0035 11. 制备 Fmoc-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe -Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Wang 树脂 0036 在上述脱帽。

33、反应后的树脂中，加 13.9-15.0g(FW ： 468.6， 30mmol) Fmoc-Lys(Boc)-OH、 9.6-10g(30mmol)TBTU、 4.6-5.0g(30mmol)HOBT，用 150ml 接肽试剂溶解，加入反应容器。25-40反应 0.5-1 小时。其余操作同上。 0037 12. 制备 Fmoc-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Thr (tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Wang 树脂 0038 在上述脱帽反应后的。

34、树脂中，加 17.6-19.6(FW ： 585.7， 30mmol) Fmoc-Cys(Trt)-OH、 9.6-10g(30mmol)TBTU、 4.6-5.0g(30mmol)HOBT，用 150ml 接肽试剂溶解，加入反应容器。25-40反应 0.5-1 小时。其余操作同上。 0039 13. 制备 Fmoc-Gly-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp(Boc)-Lys(Boc) -Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Wang 树脂 0040 在上述脱帽反应后的树脂中，加 8.92-9.9。

35、2g(FW ： 297.3， 30mmol)Fmoc-Gly-OH、 9.6-10g(30mmol)TBTU、 4.6-5.0g(30mmol)HOBT，用 150ml 接肽试剂溶解，加入反应容器。 25-40反应 1 小时。其余操作同上。 0041 14. 制备 Fmoc-Ala-Gly-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp(Boc)-Lys( Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Wang 树脂 0042 在上述脱帽反应后的树脂中，加 9.34-10.34g(FW ： 311.3， 30mmo。

36、l)Fmoc-Ala-OH、 9.6-10g(30mmol)TBTU、 4.6-5.0g(30mmol)HOBT，用 150ml 接肽试剂溶解，加入反应容器。 25-40反应 0.5-1 小时。其余操作同上。 0043 接肽反应结束后用 DCM、 DMF、无水乙醇分别洗涤三次。滤干后，放入真空干燥器中干燥，称重，得保护的十四肽树脂约 26-30g(8.372mmol)，接肽总收率约为 86.13 -87，每步接肽收率在 98 -99。 0044 二.采用切肽试剂(TFA/EDT/H2O/TIS94 ： 2.5 ： 2.5 ： 1)进行切肽，加入乙醚沉淀粗品的方法。其中：。

37、 0045 取 26-30g 保护十四肽树脂转移到 500ml 茄形瓶中，加入切肽试剂 (TFA/EDT/H， O/ TIS 170.1ml/4.5ml/4.5ml/0.9ml)180-185ml， 25-35搅拌 1.5-2 小时。滤去树脂，树脂用 20 TFA 的 DCM 溶液洗 3 次，合并滤液及洗涤液，加入 1000ml 乙醚沉淀，离心收集，用无水乙醚洗后， P2O5真空干燥，得还原型生长抑肽粗品 11.5-13g(FW ： 1640， 7.02mmol)。收率 72.3 -74.5 ( 以 Fmoc-Cys(Trt)-Wang 树脂的 9.72mmol 计 )。说。

38、明书 CN 1552728 B4/8 页 8 0046 三 . 采用在 pH7.0-10.0，于 15-35下，通空气氧化的方法 ( 二硫键的形成 )。 0047 将粗肽溶于 10冰醋酸 100ml，加 4800ml 水，在搅拌下慢慢滴加 1.5M NaOH 至 pH7.8，于 15-20下，通空气氧化 24 小时。用 50冰醋酸调至 pH4.5-5.0，加活性碳搅拌 30 分钟，过滤。 0048 四 . 采用 C18 柱进行分离纯化，流动相为： 0.1MNH4Ac ：乙腈 (6-8 ： 2-4) ；检测波长为： 280nm 的方法。 0049 滤液分批经 C1。

39、8 柱 (50250mm) 纯化，流动相： 0.1MNH4Ac ：乙腈 (7.5 ： 2.5) ；流速为 50ml/min ；检测波长为： 280nm ；用液相色谱仪跟踪收集所需要的流出液，样品峰合并后冻干，约得 3.5-4.5g 白色疏松块状物成品。 0050 后处理收率： 30.5 -31.2，总收率约为： 22.1 22.9。 0051 本发明虽然总收率较低，但是操作简单，生产成本降低明显，有利于本品的国产化生产。附图说明 0052 附图为 Wang 树脂制备生长抑素的合成路线工艺流程图。具体实施方式 0053 实施例 1 0054 (1). 制备。

40、 Fmoc-Cys(Trt)-Wang 树脂 0055 取 12.0gWang 树脂 (1.01mmol/g 树脂， 12.12mmol) 装入反应容器中，用 150mlDMF 浸泡、洗涤。加入 17.92g(FW ： 585.7， 30.6mmol)Fmoc-Cys(Trt)-OH、 9.82g(FW ： 321， 30.6mmol)TBTU、 4.68g(FW ： 153， 30.6mmol)HOBT，用 150ml 接肽试剂溶解，加入反应容器， 25反应 1 小时。滤干，用 DMF 洗涤三次，滤干。Kaiser 方法检测氨基为阴性。若显阳性加入，则应用上述量的 1/。

41、2 量补接一次。加入 150ml 的封头试剂， 25反应 1 小时。同上洗涤，滤干。 0056 (2). 制备 Fmoc-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Wang 树脂 0057 在上述脱帽反应后的树脂中，加入11.50g(FW ： 383.4， 30mmol)Fmoc-Ser(tBu)-OH、 9.6g(30mmol)TBTU、 4.6g(30mmol)HOBT，用 150ml 接肽试剂溶解，加入反应容器。25反应 1 小时。滤干，分别用 DMF、无水乙醇、 DCM 和 DMF 各洗涤三次，滤干。加入 150ml 脱帽试剂， 25反应 10 分钟，同上洗涤，滤干。 0。

42、058 (3). 制备 Fmoc-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Wang 树脂 0059 在上述脱帽反应后的树脂中，加 11.9g(FW ： 397.4， 30mmol)Fmoc-Thr(tBu)-OH、 9.6g(30mmol)TBTU、 4.6g(30mmol)HOBT，用 150ml 接肽试剂溶解，加入反应容器。25反应 1 小时。滤干，分别用 DMF、无水乙醇、 DCM 和 DMF 各洗涤三次，滤干。加入 150ml 脱帽试剂， 25反应 10 分钟滤干，用 DMF、无水乙醇、 DCM 和 DMF 各洗涤三次，滤干。 0060 (4). 制备。

43、Fmoc-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Wang 树脂 0061 在上述脱帽反应后的树脂中，加 11.6g(FW ： 387.4， 30mmol)Fmoc-Phe-OH、 9.6g(30mmol)TBTU、 4.6g(30mmol)HOBT，用 150ml 接肽试剂溶解，加入反应容器。25反应 1 小时。其余操作同上。说明书 CN 1552728 B5/8 页 9 0062 (5). 制备 Fmoc-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Wang 树脂 0063 在上述脱帽反应后的树脂中，。

44、加 11.9g(FW ： 397.4， 30mmol)Fmoc-Thr(tBu)-OH、 9.6g(30mmol)TBTU、 4.6g(30mmol)HOBT，用 150ml 接肽试剂溶解，加入反应容器。25反应 1 小时。其余操作同上。 0064 (6). 制备 Fmoc-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Wang 树脂 0065 在上述脱帽反应后的树脂中，加 13.9g(FW ： 468.6， 30mmol)Fmoc-Lys(Boc)-OH、 9.6g(30mmol)TBTU、 4.6g(30mmol)HOBT，用。

45、 150ml 接肽试剂溶解，加入反应容器。25反应 1 小时。其余操作同上。 0066 (7). 制备 Fmoc-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Tr t)-Wang 树脂 0067 在上述脱帽反应后的树脂中，加 12.83g(FW ： 427.5， 30mmol)Fmoc-Trp(Boc)-OH、 9.6g(30mmol)TBTU、 4.6g(30mmol)HOBT，用 150ml 接肽试剂溶解，加入反应容器。25反应 1 小时。其余操作同上。 0068 (8). 制备 Fmoc-Phe-Trp(Boc)-Ly。

46、s(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cy s(Trt)-Wang 树脂 0069 在上述脱帽反应后的树脂中，加 11.6g(FW ： 387.4， 30mmol)Fmoc-Phe-OH、 9.6g(30mmol)TBTU、 4.6g(30mmol)HOBT，用 150ml 接肽试剂溶解，加入反应容器。25反应 1 小时。其余操作同上。 0070 (9). 制备 Fmoc-Phe-Phe-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu )-Cys(Trt)-Wang 树脂 0071 。

47、在上述脱帽反应后的树脂中，加 11.6g(FW ： 387.4， 30mmol)Fmoc-Phe-OH、 9.6g(30mmol)TBTU、 4.6g(30mmol)HOBT，用 150ml 接肽试剂溶解，加入反应容器。25反应 1 小时。其余操作同上。 0072 (10). 制备 Fmoc-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tB u)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Wang 树脂 0073 在上述脱帽反应后的树脂中，加 17.90g(FW ： 596.7， 30mmol)Fmoc-Asn(。

48、Trt)-OH、 9.6g(30mmol)TBTU、 4.6g(30mmol)HOBT，用 150ml 接肽试剂溶解，加入反应容器。25反应 1 小时。其余操作同上。 0074 (11). 制备 Fmoc-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-P he-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Wang 树脂 0075 在上述脱帽反应后的树脂中，加 13.9g(FW ： 468.6， 30mmol)Fmoc-Lys(Boc)-OH、 9.6g(30mmol)TBTU、 4.6g(30mmol)HOBT，用。

49、150ml 接肽试剂溶解，加入反应容器。25反应 1 小时。其余操作同上。 0076 (12). 制备 Fmoc-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp(Boc)-Lys(Boc)-T hr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Wang 树脂 0077 在上述脱帽反应后的树脂中，加 17.6(FW ： 585.7， 30mmol)Fmoc-Cys(Trt)-OH、 9.6g(30mmol)TBTU、 4.6g(30mmol)HOBT，用 150ml 接肽试剂溶解，加入反应容器。25反应 1 小时。其余操作同上。说明书 CN 1552728 B6/8 页 10 0078 (13). 制备 Fmoc-Gly-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp(Boc)-Lys(Bo c)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Wang 树脂 0079 在上述脱帽反应后的树脂中，加 8.92g(FW ： 297.3， 30mmol)Fmoc-Gly-OH、 9.6g(30mmol)TBTU、 4.6g(30mmol)HOBT，用 150ml 接肽试剂溶解，加入反应容器。。

摘要
申请专利号：	CN03128951.7	申请日：	20030529
公开号：	CN1552728B	公开日：	20120418
当前法律状态：		有效性：	有效
法律详情：
IPC分类号：	C07K7/08,C07K1/04,C07K17/02	主分类号：	C07K7/08,C07K1/04,C07K17/02
申请人：	上海苏豪逸明制药有限公司,周逸明
发明人：	周逸明
地址：	200333 上海市普陀区千阳路57号
优先权：	CN03128951A
专利代理机构：	上海世贸专利代理有限责任公司	代理人：	叶克英
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内容摘要

本发明公开一种生长抑素多肽的合成方法，将Wang树脂为起始原料，以Fmoc保护的氨基酸为单体，逐个接上氨基酸，用切肽试剂(TFA/EDT/H 2O/TIS)进行切肽，加入乙醚沉淀粗肽，在pH7.0-10.0，于15-35℃下，通空气氧化，用C18柱进行分离纯化。该方法操作简单，生产成本明显降低，有利于生长抑素的国产化生产。

权利要求书

1.一种生长抑素的合成方法，其特征在于，该方法包括下列步骤：(1)将Wang树脂为起始原料，以Fmoc保护的氨基酸为单体，逐个接上氨基酸；(2)用切肽试剂进行切肽，加入乙醚沉淀粗肽；(3)在pH7.0-10.0，于15-35℃下，通空气氧化；(4)用C18柱进行分离纯化。 2.根据权利要求1所述的生长抑素的合成方法，其特征在于，制备Fmoc-Cys(Trt)-Wang树脂；将Wang树脂装入反应容器中，用DMF浸泡、洗涤，加Fmoc-Cys(Trt)-OH、TBTU、HOBT，用接肽试剂溶解，加入反应容器，25-40℃反应0.5-1小时，滤干，用DMF洗涤三次，滤干，加入封头试剂，25-40～C反应0.5-1小时，同上洗涤，滤干。 3.根据权利要求1或2所述的生长抑素的合成方法，其特征在于，制备Fmoc-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Wang树脂；在上述脱帽反应后的树脂中，加入Fmoc-Ser(tBu)-OH、TBTU、HOBT，用接肽试剂溶解，加入反应容器，25-40℃反应0.5-1小时，滤干，分别用DMF、无水乙醇、DCM和DMF各洗涤三次，滤干，加入脱帽试剂，25-40℃反应5-10分钟，同上洗涤，滤干。 4.根据权利要3所述的生长抑素的合成方法，其特征在于，制备Fmoc-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Wang树脂；在上述脱帽反应后的树脂中，加Fmoc-Thr(tBu)-OH、TBTU、HOBT，用接肽试剂溶解，加入反应容器25-40℃反应0.5-1小时，滤干，分别用DMF、无水乙醇、DCM和DMF各洗涤三次，滤干，加入脱帽试剂，25-40℃反应5-10分钟滤干，用DMF、无水乙醇、DCM和DMF各洗涤三次，滤干。 5.根据权利要求4所述的生长抑素的合成方法，其特征在于，制备 Fmoc-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Wang树脂；在上述脱帽反应后的树脂中，加Fmoc-Phe-OH、TBTU、HOBT，用接肽试剂溶解，加入反应容器，25-40℃反应0.5-1小时，滤干，分别用DMF、无水乙醇、DCM和DMF各洗涤三次，滤干，加入脱帽试剂，25-40℃反应5-10分钟滤干，用DMF、无水乙醇、DCM和DMF各洗涤三次，滤干。 6.根据权利要求5所述的生长抑素的合成方法，其特征在于，制备Fmoc-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Wang树脂；在上述脱帽反应后的树脂中，加Fmoc-Thr(tBu)-OH、TBTU、HOBT，用接肽试剂溶解，加入反应容器，25-40℃反应0.5-1小时，滤干，分别用DMF、无水乙醇、DCM和DMF各洗涤三次，滤干，加入脱帽试剂，25-40℃反应5-10分钟滤干，用DMF、无水乙醇、DCM和DMF各洗涤三次，滤干。 7.根据权利要求6所述的生长抑素的合成方法，其特征在于，制备Fmoc-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Wang树脂；在上述脱帽反应后的树脂中，加Fmoc-Lys(Boc)-OH、TBTU、HOBT，用接肽试剂溶解，加入反应容器，25-40℃反应0.5-1小时，滤干，分别用DMF、无水乙醇、DCM和DMF各洗涤三次，滤干，加入脱帽试剂，25-40℃反应5-10分钟滤干，用DMF、无水乙醇、DCM和DMF各洗涤三次，滤干。 8.根据权利要求7所述的生长抑素的合成方法，其特征在于，制备Fmoc-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Wang树脂；在上述脱帽反应后的树脂中，加Fmoc-Trp(Boc)-OH、TBTU、HOBT，用接肽试剂溶解，加入反应容器，25-40℃反应0.5-1小时，滤干，分别用DMF、无水乙醇、DCM和DMF各洗涤三次，滤干，加入脱帽试剂，25-40℃反应5-10分钟滤干，用DMF、无水乙醇、DCM和DMF各洗涤三次，滤干。 9.根据权利要求8所述的生长抑素的合成方法，其特征在于，制备Fmoc-Phe-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Wang树脂；在上述脱帽反应后的树脂中，加Fmoc-Phe-OH、TBTU、HOBT，用接肽试剂溶解，加入反应容器，25-40℃反应0.5-1小时，滤干，分别用DMF、无水乙醇、DCM和DMF各洗涤三次，滤干，加入脱帽试剂，25-40℃反应5-10分钟滤干，用DMF、无水乙醇、DCM和DMF各洗涤三次，滤干。 10.根据权利要求9所述的生长抑素的合成方法，其特征在于，制备Fmoc-Phe-Phe-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Wang 树脂；在上述脱帽反应后的树脂中，加Fmoc-Phe-OH、TBTU、HOBT，用接肽试剂溶解，加入反应容器，25-40℃反应0.5-1小时，滤干，分别用DMF、无水乙醇、DCM和DMF各洗涤三次，滤干，加入脱帽试剂，25-40℃反应5-10分钟滤干，用DMF、无水乙醇、DCM和DMF各洗涤三次，滤干。 11.根据权利要求10所述的生长抑素的合成方法，其特征在于，制备Fmoc-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp(Bot)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Wang树脂；在上述脱帽反应后的树脂中，加Fmoc-Asn(Trt)-OH、TBTU、HOBT，用接肽试剂溶解，加入反应容器，25-40～C反应0.5-1小时，滤干，分别用DMF、无水乙醇、DCM和DMF各洗涤三次，滤干，加入脱帽试剂，25-40℃反应5-10分钟滤干，用DMF、无水乙醇、DCM和DMF各洗涤三次，滤干。 12.根据权利要求11所述的生长抑素的合成方法，其特征在于，制备Fmoc-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Wang树脂；在上述脱帽反应后的树脂中，加Fmoc-Lys(Boc)-OH、TBTU、HOBT，用接肽试剂溶解，加入反应容器，25-40℃反应0.5-1小时，滤干分别用DMF、无水乙醇、DCM和DMF各洗涤三次，滤干，加入脱帽试剂，25-40℃反应5-10分钟滤干，用DMF、无水乙醇、DCM和DMF各洗涤三次，滤干。 13.根据权利要求12所述的生长抑素的合成方法，其特征在于，制备Fmoc-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Wang树脂；在上述脱帽反应后的树脂中，加Fmoc-Cys(Trt)-OH、TBTU、HOBT，用接肽试剂溶解，加入反应容器，25-40℃反应0.5-1小时，滤干，分别用DMF、无水乙醇、DCM和DMF各洗涤三次，滤干，加入脱帽试剂，25-40～C反应5-10分钟滤干，用DMF、无水乙醇、DCM和DMF各洗涤三次，滤干。 14.根据权利要求13所述的生长抑素的合成方法，其特征在于，制备Fmoc-Gly-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Wang树脂；在上述脱帽反应后的树脂中，加Fmoc-Gly-OH、TBTU、HOBT，用接肽试剂溶解，加入反应容器，25-40～C反应1小时，滤干，分别用DMF、无水乙醇、DCM和DMF各洗涤三次，滤干，加入脱帽试剂，25-40℃反应5-10分钟滤干，用DMF、无水乙醇、DCM和DMF各洗涤三次，滤干。 15.根据权利要求14所述的生长抑素的合成方法，其特征在于，制备Fmoc-Ala-Gly-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Wang树脂；在上述脱帽反应后的树脂中，加Fmoc-Ala-OH、TBTU、HOBT，用接肽试剂溶解，加入反应容器，25-40～C反应0.5-1小时，滤干，分别用DMF、无水乙醇、DCM和DMF各洗涤三次，滤干，加入脱帽试剂，25-40℃反应5-10分钟滤干，用DMF、无水乙醇、DCM和DMF各洗涤三次，滤干。 16.根据权利要求1所述的生长抑素的合成方法，其特征在于，接肽反应结束后用DCM、DMF、无水乙醇分别洗涤三次，滤干后，放入真空干燥器中干燥。 17.根据权利要求1所述的生长抑素的合成方法，其特征在于，切肽方法是将保护十四肽树脂转移到500ml茄形瓶中，加入切肽试剂TFA/EDT/HO/TIS；25-35℃搅拌1.5-2小时，滤去树脂，树脂用20％TFA的DCM溶液洗3次，合并滤液及洗涤液，加入适量乙醚沉淀，离心收集，用无水乙醚洗后，PO真空干燥，得还原型生长抑肽粗品。 18.根据权利要求1所述的生长抑素的合成方法，其特征在于，将粗肽溶于10％冰醋酸，加一定量水，在搅拌下慢慢滴加1.5M NaOH至pH7.0-10.0，于15-20℃下，通空气氧化12-24小时，用50％冰醋酸调至pH4.5-5.0，加活性碳搅拌30-60分钟，过滤。 19.根据权利要求1所述的生长抑素的合成方法，其特征在于，用C18柱进行分离纯化，流动相为6-8∶2-4的0.1M NH4Ac∶乙腈；检测波长为：280nm，用液相色谱仪跟踪收集所需要的流出液，样品峰合并后冻干。

说明书

技术领域

本发明涉及多肽合成方法的改进，具体是指一种生长抑素的合成方法改进。

背景技术

生长抑素的英文名：Somatostatin，Stilamin

结构式：

分子式及分子量：C76H104N18O19S2，1637.9。

生长抑素是下丘脑的正中隆起和胰岛的δ细胞合成的。1973年由Burgus和 Brazean等人首先由下丘脑分离得到并阐明其结构。化学结构为分子内带有一对二硫键的十四肽。其生物功能可抑制腺体释放生长激素、抑制促甲状腺和肾上腺皮质激素、抑制胰腺的内分泌与外分泌、抑制胃粘膜释放胃泌素、抑制肠粘膜释放肠促胰激素和肾脏释放肾素，降低门静脉压力、松弛胆道口括约肌、刺激单核巨噬细胞系统而减轻内毒素血症，抑制血小板活化因子的释放，直接或间接调节细胞因子链产生细胞保护作用，并可增强抗癌药物的抗增殖作用。临床常应用于严重急性食管静脉曲张破裂出血，严重急性胃、十二指肠溃疡出血，急性糜烂性胃炎或出血性胃炎，胰、胆和肠屡的辅助治疗，糖尿病酮症酸中毒的辅助治疗。

在国外，合成的生长抑素早已成为商品用于临床，并于1997年收载入欧洲药典。瑞士的Serono公司生产的生长抑素，其商品名为施他宁(Stilamin)，迄今为止也是世界上唯一的生产公司，目前独占我国市场，注册证号为， X930471。

现有合成方法为选用Wang树脂作为起始物，采用片段固相缩合法合成.文献主要有《片段固相缩合法合成生长激素释放抑制素》“生物化学与生物物理学报”17，1，1985，128-137。但该法需预先制备四个片段肽，反应周期较长，操作较繁琐.

国外文献的有关合成方法；Solid phase synthesis of partially protected and free peptides containing disulphide bonds by simultaneous cysteine oxidation-release from2-chlorotrityl resin(Int.J.Peptide Protein Res.38，1991，562-568)。

发明内容

本发明需要解决的技术问题是提供一种生长抑素的合成方法，此方法操作简便，适于工业化生产。

一.采用Wang树脂为起始原料，以Fmoc保护的氨基酸为单体，逐个接上氨基酸的方法。其中：

1.制备Fmoc-Cys(Trt)-Wang树脂

取12-15gWang树脂(1.01mmol/g树脂，12.12mmol)装入反应容器中，用 150mlDMF浸泡、洗涤。

加入17.92g(FW：585.7，30.6mmol)Fmoc-Cys(Trt)-OH、9.82g(FW：321， 30.6mmol)TBTU、4.68g(FW：153，30.6mmol)HOBT，用150ml接肽试剂溶解，加入反应容器，25-40℃反应0.5-1小时。滤干，用DMF洗涤三次，滤干。

Kaiser方法检测氨基为阴性。若显阳性加入，则应用上述量的1/2量补接一次。

加入150ml的封头试剂，25-40℃反应0.5-1小时。同上洗涤，滤干。

2.制备Fmoc-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Wang树脂

在上述脱帽反应后的树脂中，加入13.50g(FW：383.4，30mmol)Fmoc- Ser(tBu)-OH、9.6g(30mmol)TBTU、4.6g(30mmol)HOBT，用150ml接肽试剂溶解，加入反应容器。25-40℃反应0.5-1小时。滤干，分别用DMF、无水乙醇、DCM和DMF各洗涤三次，滤干。加入150ml脱帽试剂，25-40℃ 反应5-10分钟，同上洗涤，滤干。

3.制备Fmoc-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Wang树脂

在上述脱帽反应后的树脂中，加11.9-13.9g(FW：397.4，30mmol)Fmoc- Thr(tBu)-OH、9.6-10g(30mmol)TBTU、4.6-5g(30mmol)HOBT，用150ml接肽试剂溶解，加入反应容器。25-40℃反应0.5-1小时。滤干，分别用DMF、无水乙醇、DCM和DMF各洗涤三次，滤干。加入150ml脱帽试剂，25-40℃反应5-10 分钟滤干，用DMF、无水乙醇、DCM和DMF各洗涤三次，滤干。

4.制备Fmoc-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Wang树脂

在上述脱帽反应后的树脂中，加11.6-13g(FW：387.4，30mmol)Fmoc-Phe-OH、 9.6-10g(30mmol)TBTU、4.6-5g(30mmol)HOBT，用150ml接肽试剂溶解，加入反应容器。25-40℃反应0.5-1小时。其余操作同上。

5.制备Fmoc-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Wang树脂

在上述脱帽反应后的树脂中，加11.9-13.9g(FW：397.4，30mmol) Fmoc-Thr(tBu)-OH、9.6-10g(30mmol)TBTU、4.6-5g(30mmol)HOBT，用150ml 接肽试剂溶解，加入反应容器。25-40℃反应0.5-1小时。其余操作同上。

6.制备Fmoc-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt) -Wang树脂

在上述脱帽反应后的树脂中，加13.9-15g(FW：468.6，30mmol) Fmoc-Lys(Boc)-OH、9.6-10g(30mmol)TBTU、4.6-5g(30mmol)HOBT，用150ml 接肽试剂溶解，加入应容器。25-40℃反应0.5-1小时。其余操作同上。

7.制备Fmoc-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt) 4-Wang树脂

在上述脱帽反应后的树脂中，加12.83-14.83g(FW：427.5，30mmol)Fmoc- Trp(Boc)-OH、9.6-10g(30mmol)TBTU、4.6-5g(30mmol)HOBT，用150ml接肽试剂溶解，加入反应容器。25-40℃反应0.5-1小时。其余操作同上。

8.制备Fmoc-Phe-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu) -Cys(Trt)-Wang树脂

在上述脱帽反应后的树脂中，加11.6-13.6g(FW：387.4，30mmol)Fmoc-Phe-OH、 9.6-10g(30mmol)TBTU、4.6-5.0g(30mmol)HOBT，用150ml接肽试剂溶解，加入反应容器。25-40℃反应0.5-1小时。其余操作同上。

9.制备Fmoc-Phe-Phe-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu) -Cys(Trt)-Wang树脂

在上述脱帽反应后的树脂中，加11.6-13.6g(FW：387.4，30mmol)Fmoc-Phe-OH、 9.6-10g(30mmol)TBTU、4.6-5g(30mmol)HOBT，用150ml接肽试剂溶解，加入反应容器。25-40℃反应0.5-1小时。其余操作同上。

10.制备Fmoc-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe -Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Wang树脂

在上述脱帽反应后的树脂中，加17.90-19.0g(FW：596.7，30mmol)Fmoc-Asn (Trt)-OH、9.6-10g(30mmol)TBTU、4.6-5.0g(30mmol)HOBT，用150ml接肽试剂溶解，加入反应容器。25-40℃反应0.5-1小时。其余操作同上。

11.制备Fmoc-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp(Boc)-Lys(Boc) -Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Wang树脂

在上述脱帽反应后的树脂中，加13.9-15.0g(FW：468.6，30mmol)Fmoc- Lys(Boc)-OH、9.6-10g(30mmol)TBTU、4.6-5.0g(30mmol)HOBT，用150ml接肽试剂溶解，加入反应容器。25-40℃反应0.5-1小时。其余操作同上。

12.制备Fmoc-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp(Boc)-Lys(Boc)- Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Wang树脂

在上述脱帽反应后的树脂中，加17.6-19.6(FW：585.7，30mmol)Fmoc-Cys(Trt)- OH、9.6-10g(30mmol)TBTU、4.6-5.0g(30mmol)HOBT，用150ml接肽试剂溶解，加入反应容器。25-40℃反应0.5-1小时。其余操作同上。

13.制备Fmoc-Gly-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp(Boc)-Lys(Boc) -Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Wang树脂

在上述脱帽反应后的树脂中，加8.92-9.92g(FW：297.3，30mmol)Fmoc-Gly-OH、 9.6-10g(30mmol)TBTU、4.6-5.0g(30mmol)HOBT，用150ml接肽试剂溶解，加入反应容器。25-40℃反应1小时。其余操作同上。

14.制备Fmoc-Ala-Gly-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp(Boc)- Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Wang树脂

在上述脱帽反应后的树脂中，加9.34-10.34g(FW：311.3，30mmol)Fmoc-Ala- OH、9.6-10g(30mmol)TBTU、4.6-5.0g(30mmol)HOBT，用150ml接肽试剂溶解，加入反应容器。25-40℃反应0.5-1小时。其余操作同上。

接肽反应结束后用DCM、DMF、无水乙醇分别洗涤三次。滤干后，放入真空干燥器中干燥，称重，得保护的十四肽树脂约26-30g(8.372mmol)，接肽总收率约为86.13％-87％，每步接肽收率在98％-99％。

二.采用切肽试剂(TFA/EDT/H2O/TIS＝94：2.5：2.5：1)进行切肽，加入乙醚沉淀粗品的方法。其中：

取26-30g保护十四肽树脂转移到500ml茄形瓶中，加入切肽试剂 (TFA/EDT/H，O/TIS＝170.1ml/4.5ml/4.5ml/0.9ml)180-185ml，25-35℃搅拌1.5- 2小时。滤去树脂，树脂用20％TFA的DCM溶液洗3次，合并滤液及洗涤液，加入1000ml乙醚沉淀，离心收集，用无水乙醚洗后，P2O5真空干燥，得还原型生长抑肽粗品11.5-13g(FW：1640，7.02mmol)。收率72.3％-74.5％(以Fmoc- Cys(Trt)-Wang树脂的9.72mmol计)。

三.采用在pH7.0-10.0，于15-35℃下，通空气氧化的方法(二硫键的形成)。

将粗肽溶于10％冰醋酸100ml，加4800ml水，在搅拌下慢慢滴加1.5M NaOH 至pH7.8，于15-20℃下，通空气氧化24小时。用50％冰醋酸调至pH4.5-5.0，加活性碳搅拌30分钟，过滤。

四.采用C18柱进行分离纯化，流动相为：0.1MNH4Ac：乙腈(6-8：2-4)；检测波长为：280nm的方法。

滤液分批经C18柱(50×250mm)纯化，流动相：0.1MNH4Ac：乙腈(7.5：2.5)；流速为50ml/min；检测波长为：280nm；用液相色谱仪跟踪收集所需要的流出液，样品峰合并后冻干，约得3.5-4.5g白色疏松块状物成品。

后处理收率：30.5％-31.2％，总收率约为：22.1％～22.9％。

本发明虽然总收率较低，但是操作简单，生产成本降低明显，有利于本品的国产化生产。

附图说明

附图为Wang树脂制备生长抑素的合成路线工艺流程图。

具体实施方式

实施例1

(1).制备Fmoc-Cys(Trt)-Wang树脂

取12.0gWang树脂(1.01mmol/g树脂，12.12mmol)装入反应容器中，用 150mlDMF浸泡、洗涤。加入17.92g(FW：585.7，30.6mmol)Fmoc-Cys(Trt)-OH、 9.82g(FW：321，30.6mmol)TBTU、4.68g(FW：153，30.6mmol)HOBT，用150ml 接肽试剂溶解，加入反应容器，25℃反应1小时。滤干，用DMF洗涤三次，滤干。Kaiser方法检测氨基为阴性。若显阳性加入，则应用上述量的1/2量补接一次。加入150ml的封头试剂，25℃反应1小时。同上洗涤，滤干。

(2).制备Fmoc-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Wang树脂

在上述脱帽反应后的树脂中，加入11.50g(FW：383.4，30mmol)Fmoc- Ser(tBu)-OH、9.6g(30mmol)TBTU、4.6g(30mmol)HOBT，用150ml接肽试剂溶解，加入反应容器。25℃反应1小时。滤干，分别用DMF、无水乙醇、 DCM和DMF各洗涤三次，滤干。加入150ml脱帽试剂，25℃反应10分钟，同上洗涤，滤干。

(3).制备Fmoc-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Wang树脂

在上述脱帽反应后的树脂中，加11.9g(FW：397.4，30mmol)Fmoc-Thr(tBu)- OH、9.6g(30mmol)TBTU、4.6g(30mmol)HOBT，用150ml接肽试剂溶解，加入反应容器。25℃反应1小时。滤干，分别用DMF、无水乙醇、DCM和DMF 各洗涤三次，滤干。加入150ml脱帽试剂，25℃反应10分钟滤干，用DMF、无水乙醇、DCM和DMF各洗涤三次，滤干。

(4).制备Fmoc-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Wang树脂

在上述脱帽反应后的树脂中，加11.6g(FW：387.4，30mmol)Fmoc-Phe-OH、9.6g (30mmol)TBTU、4.6g(30mmol)HOBT，用150ml接肽试剂溶解，加入反应容器。 25℃反应1小时。其余操作同上。

(5).制备Fmoc-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Wang树脂

在上述脱帽反应后的树脂中，加11.9g(FW：397.4，30mmol)Fmoc-Thr(tBu)- OH、9.6g(30mmol)TBTU、4.6g(30mmol)HOBT，用150ml接肽试剂溶解，加入反应容器。25℃反应1小时。其余操作同上。

(6).制备Fmoc-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt) -Wang树脂

在上述脱帽反应后的树脂中，加13.9g(FW：468.6，30mmol)Fmoc-Lys(Boc)- OH、9.6g(30mmol)TBTU、4.6g(30mmol)HOBT，用150ml接肽试剂溶解，加入反应容器。25℃反应1小时。其余操作同上。

(7).制备Fmoc-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu) -Cys(Trt)-Wang树脂

在上述脱帽反应后的树脂中，加12.83g(FW：427.5，30mmol)Fmoc-Trp(Boc)- OH、9.6g(30mmol)TBTU、4.6g(30mmol)HOBT，用150ml接肽试剂溶解，加入反应容器。25℃反应1小时。其余操作同上。

(8).制备Fmoc-Phe-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu) -Cys(Trt)-Wang树脂

在上述脱帽反应后的树脂中，加11.6g(FW：387.4，30mmol)Fmoc-Phe-OH、9.6g (30mmol)TBTU、4.6g(30mmol)HOBT，用150ml接肽试剂溶解，加入反应容器。 25℃反应1小时。其余操作同上。

(9).制备Fmoc-Phe-Phe-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu) -Ser(tBu)-Cys(Trt)-Wang树脂

在上述脱帽反应后的树脂中，加11.6g(FW：387.4，30mmol)Fmoc-Phe-OH、9.6g (30mmol)TBTU、4.6g(30mmol)HOBT，用150ml接肽试剂溶解，加入反应容器。 25℃反应1小时。其余操作同上。

(10).制备Fmoc-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe -Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Wang树脂

在上述脱帽反应后的树脂中，加17.90g(FW：596.7，30mmol)Fmoc-Asn(Trt)-OH、 9.6g(30mmol)TBTU、4.6g(30mmol)HOBT，用150ml接肽试剂溶解，加入反应容器。25℃反应1小时。其余操作同上。

(11).制备Fmoc-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp(Boc)-Lys(Boc) -Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Wang树脂

在上述脱帽反应后的树脂中，加13.9g(FW：468.6，30mmol)Fmoc-Lys(Boc)- OH、9.6g(30mmol)TBTU、4.6g(30mmol)HOBT，用150ml接肽试剂溶解，加入反应容器。25℃反应1小时。其余操作同上。

(12).制备Fmoc-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp(Boc)-Lys(Boc)- Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Wang树脂

在上述脱帽反应后的树脂中，加17.6(FW：585.7，30mmol)Fmoc-Cys(Trt)-OH、 9.6g(30mmol)TBTU、4.6g(30mmol)HOBT，用150ml接肽试剂溶解，加入反应容器。25℃反应1小时。其余操作同上。

(13).制备Fmoc-Gly-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp(Boc) -Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Wang树脂

在上述脱帽反应后的树脂中，加8.92g(FW：297.3，30mmol)Fmoc-Gly-OH、9.6g (30mmol)TBTU、4.6g(30mmol)HOBT，用150ml接肽试剂溶解，加入反应容器。 25℃反应1小时。其余操作同上。

(14).制备Fmoc-Ala-Gly-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp(Boc)- Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Wang树脂

在上述脱帽反应后的树脂中，加9.34g(FW：311.3，30mmol)Fmoc-Ala-OH、9.6g (30mmol)TBTU、4.6g(30mmol)HOBT，用150ml接肽试剂溶解，加入反应容器。 25℃反应1小时。其余操作同上。

接肽反应结束后用DCM、DMF、无水乙醇分别洗涤三次。滤干后，放入真空干燥器中干燥，称重，得保护的十四肽树脂约26g(8.372mmol)，接肽总收率约为86.13％，每步接肽收率在98％。

取26g保护十四肽树脂转移到500ml茄形瓶中，加入切肽试剂 (TFA/EDT/H2O/TIS＝170.1ml/4.5ml/4.5ml/0.9ml)180ml，25℃搅拌2小时。滤去树脂，树脂用20％TFA的DCM溶液洗3次，合并滤液及洗涤液，加入1000ml 乙醚沉淀，离心收集，用无水乙醚洗后，P2O5真空干燥，得还原型生长抑肽粗品11.5g(FW：1640，7.02mmol)。收率72.3％(以Fmoc-Cys(Trt)-Wang树脂的 9.72mmol计)。

将粗肽溶于10％冰醋酸100ml，加4800ml水，在搅拌下慢慢滴加1.5M NaOH 至pH7.8，于15℃下，通空气氧化24小时。用50％冰醋酸调至pH5.0，加活性碳搅拌30分钟，过滤滤液分批经C18柱(50×250mm)纯化，流动相：0.1MNH4Ac∶ 乙腈(7.5∶2.5)；流速为50ml/min；检测波长为：280nm；用液相色谱仪跟踪收集所需要的流出液，样品峰合并后冻干，约得3.5g白色疏松块状物成品。3.5 ÷1638＝2.14mmol

后处理收率：30.5％，总收率约为：22.1％。

实施例2

(1).制备Fmoc-Cys(Trt)-Wang树脂

取15.0gWang树脂(1.01mmol/g树脂，12.12mmol)装入反应容器中，用 150mlDMF浸泡、洗涤。加入17.92g(FW：585.7，30.6mmol)Fmoc-Cys(Trt)-OH、 9.82g(FW：321，30.6mmol)TBTU、4.68g(FW：153，30.6mmol)HOBT，用150ml 接肽试剂溶解，加入反应容器，40℃反应0.5小时。滤干，用DMF洗涤三次，滤干。Kaiser方法检测氨基为阴性。若显阳性加入，则应用上述量的1/2 量补接一次。加入150ml的封头试剂，40℃反应0.5小时。同上洗涤，滤干。

(2).制备Fmoc-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Wang树脂

在上述脱帽反应后的树脂中，加入13.50g(FW：383.4，30mmol)Fmoc- er(tBu)-OH、9.6g(30mmol)TBTU、4.6g(30mmol)HOBT，用150ml接肽试剂溶解，加入反应容器。40℃反应0.5小时。滤干，分别用DMF、无水乙醇、 DCM和DMF各洗涤三次，滤干。加入150ml脱帽试剂，40℃反应5分钟，同上洗涤，滤干。

(3).制备Fmoc-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Wang树脂

在上述脱帽反应后的树脂中，加13.9g(FW：397.4，30mmol)Fmoc-Thr(tBu)- OH、10g(30mmol)TBTU、5g(30mmol)HOBT，用150ml接肽试剂溶解，加入反应容器。40℃反应0.5小时。滤干，分别用DMF、无水乙醇、DCM和DMF 各洗涤三次，滤干。加入150ml脱帽试剂，40℃反应5分钟滤干，用DMF、无水乙醇、DCM和DMF各洗涤三次，滤干。

(4).制备Fmoc-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Wang树脂

在上述脱帽反应后的树脂中，加13.6g(FW：387.4，30mmol)Fmoc-Phe-OH、10g (30mmol)TBTU、5g(30mmol)HOBT，用150ml接肽试剂溶解，加入反应容器。 40℃反应0.5小时。其余操作同上。

(5).制备Fmoc-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Wang树脂

在上述脱帽反应后的树脂中，加13.9g(FW：397.4，30mmol)Fmoc-Thr(tBu)- OH、10g(30mmol)TBTU、5g(30mmol)HOBT，用150ml接肽试剂溶解，加入反应容器。40℃反应0.5小时。其余操作同上。

(6).制备Fmoc-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt) -Wang树脂

在上述脱帽反应后的树脂中，加15g(FW：468.6，30mmol)Fmoc-Lys(Boc)-OH、 10g(30mmol)TBTU、5g(30mmol)HOBT，用150ml接肽试剂溶解，加入反应容器。40℃反应0.5小时。其余操作同上。

(7).制备Fmoc-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu) -Cys(Trt)-Wang树脂

在上述脱帽反应后的树脂中，加14.83g(FW：427.5，30mmol)Fmoc-Trp(Boc)- OH、10g(30mmol)TBTU、5g(30mmol)HOBT，用150ml接肽试剂溶解，加入反应容器。40℃反应0.5小时。其余操作同上。

(8).制备Fmoc-Phe-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu) -Cys(Trt)-Wang树脂

在上述脱帽反应后的树脂中，加13.6g(FW：387.4，30mmol)Fmoc-Phe-OH、10g (30mmol)TBTU、5g(30mmol)HOBT，用150ml接肽试剂溶解，加入反应容器。 40℃反应0.5小时。其余操作同上。

(9).制备Fmoc-Phe-Phe-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu) -Ser(tBu)-Cys(Trt)-Wang树脂

在上述脱帽反应后的树脂中，加13.6g(FW：387.4，30mmol)Fmoc-Phe-OH、10g (30mmol)TBTU、5g(30mmol)HOBT，用150ml接肽试剂溶解，加入反应容器。 40℃反应0.5小时。其余操作同上。

(10)-制备Fmoc-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe -Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Wang树脂

在上述脱帽反应后的树脂中，加19.0g(FW：596.7，30mmol)Fmoc-Asn(Trt)-OH、 10g(30mmol)TBTU、5g(30mmol)HOBT，用150ml接肽试剂溶解，加入反应容器。40℃反应0.5小时。其余操作同上。

(11).制备Fmoc-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp(Boc)-Lys(Boc) -Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Wang树脂

在上述脱帽反应后的树脂中，加15g(FW：468.6，30mmol)Fmoc-Lys(Boc)-OH、 10.0g(30mmol)TBTU、5.0g(30mmol)HOBT，用150ml接肽试剂溶解，加入反应容器。40℃反应0.5小时。其余操作同上。

(12).制备Fmoc-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp(Boc)-Lys(Boc)- Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Wang树脂

在上述脱帽反应后的树脂中，加19.6(FW：585.7，30mmol)Fmoc-Cys(Trt)-OH、 10g(30mmol)TBTU、5g(30mmol)HOBT，用150ml接肽试剂溶解，加入反应容器。40℃反应0.5小时。其余操作同上。

(13).制备Fmoc-Gly-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp(Boc) -Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Wang树脂

在上述脱帽反应后的树脂中，加9.92g(FW：297.3，30mmol)Fmoc-Gly-OH、10g (30mmol)TBTU、5g(30mmol)HOBT，用150ml接肽试剂溶解，加入反应容器。 40℃反应0.5小时。其余操作同上。

(14).制备Fmoc-Ala-Gly-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp(Boc)- Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Wang树脂

在上述脱帽反应后的树脂中，加10.34g(FW：311.3，30mmol)Fmoc-Ala-OH、10g (30mmol)TBTU、5g(30mmol)HOBT，用150ml接肽试剂溶解，加入反应容器。 40℃反应0.5小时。其余操作同上。

接肽反应结束后用DCM、DMF、无水乙醇分别洗涤三次。滤干后，放入真空干燥器中干燥，称重，得保护的十四肽树脂约30g(8.372mmol)，接肽总收率约为87％，每步接肽收率在98.5％。

取30g保护十四肽树脂转移到500ml茄形瓶中，加入切肽试剂 (TFA/EDT/H2O/TIS＝170.1ml/4.5ml/4.5ml/0.9ml)185ml，35℃搅拌1.5小时。滤去树脂，树脂用20％TFA的DCM溶液洗3次，合并滤液及洗涤液，加入1000ml 乙醚沉淀，离心收集，用无水乙醚洗后，P2O5真空干燥，得还原型生长抑肽粗品13.5g(FW：1640，7.02mmol)。收率74.5％(以Fmoc-Cys(Trt)-Wang树脂的 9.72mmol计)。

将粗肽溶于10％冰醋酸100ml，加4800ml水，在搅拌下慢慢滴加1.5M NaOH 至pH10.0，于20℃下，通空气氧化24小时。用50％冰醋酸调至pH4.5，加活性碳搅拌30分钟，过滤滤液分批经C18柱(50×250mm)纯化，流动相：0.1MNH4Ac∶ 乙腈(7.5∶2.5)；流速为50ml/min；检测波长为：280nm；用液相色谱仪跟踪收集所需要的流出液，样品峰合并后冻干，约得4.5g白色疏松块状物成品。后处理收率：31.2％，总收率约为：22.9％。