与PKR激酶结构域特异性结合的多肽及其应用.pdf

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1、(10)授权公告号 CN 101293917 B (45)授权公告日 2010.12.01 CN 101293917 B *CN101293917B* (21)申请号 200810053528.X (22)申请日 2008.06.16 C07K 7/08(2006.01) G01N 33/68(2006.01) (73)专利权人 南开大学 地址 300071 天津市南开区卫津路 94 号 (72)发明人 曹又佳 张宏恺 常云松 杜明娟 张翠竹 (74)专利代理机构 天津佳盟知识产权代理有限 公司 12002 代理人 侯力 CN 1763082 A,2006.04.26, 全文 . CN 101。

2、113164 A,2008.01.30, 全文 . 朱蓉 等 . 牙鲆 eIF2 激酶基因 HRI 和 PKR 的克隆、 表达及功能分析 . 湖北省遗传学会、 江西 省遗传学会 2006 年学术年会暨学术讨论会论文 摘要集 .2006,(2006),167. 唐钧 等 . 单纯疱疹病毒的 ICP34.5 蛋白的 保守区域对于调节哺乳动物细胞内的蛋白磷酸酶 的复合物功能的研究 . 第七届全国病毒学会研 讨会暨第二届武汉现代病毒学国际研讨会论文 集 .2007,80. (54) 发明名称 与 PKR 激酶结构域特异性结合的多肽及其应 用 (57) 摘要 一种能够与 PKR 激酶结构域特异性结合的多。

3、 肽及其应用。 本发明涉及PKR激酶结构域(PKRcat) 的抑制 12 肽序列， 其氨基酸序列为 ： Ser-Val-His -Leu-Tyr-His-Ser-Thr-Lys-Thr-Leu-Arg。 本发明 应用噬菌体展示文库， 筛选能够与 PKRcat特异性 结合的 12 肽， 该 12 肽具有与 PKRcat特异性结合的 特性， 并且能够抑制其激酶活性。 因此， 该12肽对 研究 PKRcat在细胞调亡中的作用及 PKRcat抑制剂 的开发具有实用价值。 (51)Int.Cl. (56)对比文件 审查员 孙薇 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利 权利要求书 1 页 。

4、说明书 9 页 附图 4 页 CN 101293917 B1/1 页 2 1. 与 PKR 激酶结构域 PKRcat特异性结合的多肽， 其氨基酸序列如下 ： Ser-Val-His-Leu-Tyr-His-Ser-Thr-Lys-Thr-Leu-Arg。 2. 如权利要求 1 所述的多肽， 其特征在于， 能与 PKR 激酶结构域特异性结合， 并且能够 抑制 PKRcat磷酸化 eIF2 的能力， IC50为 2.5M。 3. 权利要求 1 所述的多肽在开发 PKRcat抑制剂中的应用。 权 利 要 求 书 CN 101293917 B1/9 页 3 与 PKR 激酶结构域特异性结合的多肽及其应。

5、用 技术领域 0001 本发明属于生物工程与生物医药技术领域， 涉及利用噬菌体展示技术筛选能与 PKR 激酶结构域 (PKRcat) 特异性结合的多肽及其应用。 背景技术 0002 PKR 是一种由干扰素诱导的依赖于双链 RNA 的蛋白激酶， 是真核翻译起始因子 eIF2 激酶家族成员之一。它是一种有 551 个氨基酸组成的丝氨酸 - 苏氨酸激酶， 而近期 研究也发现其具有酪氨酸激酶的活性 Su， Q.et al.Tyrosine phosphorylation acts as a molecular switch tofull-scale activation of the eIF2 RNA。

6、-dependent protein kinase.2006.PNAS。结构上， 主要包括 2 个功能性结构域 ： N 端与 RNA 结合的调节性结构 域和C端的催化结构域。 PKR在干扰素诱导的抗病毒防御应答中发挥主要的作用， 被认为是 IFN 诱导的最具有特征性的抗病毒路径。 0003 PKR 也可能是治疗多种神经退行性病变的药物靶标 Peel， Alyson L.PKR Activation inNeurodegenerative Disease。其中， 阿尔茨海默症 (AD) 是一种以进行性 认知障碍和记忆力损害为主的中枢神经系统退行性疾病， 老年斑， 神经纤维丝缠结和神经 细胞死亡等。

7、病理变化为病理特征。- 淀粉诱导的神经细胞凋亡中半胱天冬酶 Caspase 从 PKR的Asp251切掉PKR的调节结构域， 释放出组成型激活的eIF2激酶结构域从而导致神 经细胞蛋白合成的抑制 Rohn TT.et al.Activation of caspase-8 in the Alzheimer s disease brain.2001.Neurobiol Dis.。以 PKRcat作为靶蛋白筛选抑制剂可以用于开发延 缓老年痴呆病中神经细胞的死亡， 缓解和治疗老年痴呆的药物。 0004 在过去的 10 年间， 多肽疗法对医药行业来说， 被认为是一项很有前途的新开发。 全球范围内有 60。

8、0-700 种多肽正处于开发阶段。其中， 在细胞信号通路的基础研究和药物 研发方面， 激酶多肽类抑制剂已成为一个非常有前途的领域。例如， 多肽 PKI 抑制 PKA 的 激酶活性被用于研究人淋巴细胞的调亡通路 Zhang， B.et al.Racl inhibits apoptosis in human lymphoma cells bystimulating Bad phosphorylation on Ser-75.2004.Mol. Cell.Biol.。豆蔻酰基化蛋白激酶 C 的抑制肽在细胞水平和动物水平都能够特异的抑 制 PKC 的 活 性。Spyridopoulos， I.et a。

9、l.Divergence of angiogenic and vascular permeability signaling by VEGF inhibition of proteinkinase C suppresses VEGF-induced angiogenesis but promotes VEGF-induced， NO-dependentvascular permeability.2002.Aterioscler.Thromb.Vasc.Biol.。尽管 PKR 激酶结构域在老年痴呆 等疾病中发挥作用， 但目前还未有 PKR 抑制剂和 PKR 多肽类抑制剂的报道。 0005 多肽。

10、药物设计中， 利用噬菌体呈现技术构建不同容量的随机肽库， 从这些肽库中 快速筛选出活性多肽， 并鉴定其结构， 可以简便快速地获得与靶分子具有强亲和力和特异 性的小肽或新型蛋白， 这些肽段可以作为候选药物进行开发。 说 明 书 CN 101293917 B2/9 页 4 发明内容 0006 本发明目的是提供一种能够与 PKR 激酶结构域特异性结合的多肽及其应用。 0007 PKR 是神经细胞凋亡相关疾病， 如老年痴呆症药物开发的新靶点。本发明应用 12 肽噬菌体展示文库对 PKRcat进行五轮筛选， 获得了能与 PKRcat特异性结合的 12 肽， 并且该 12 肽能够抑制 PKRcat的激酶活。

11、性。 0008 本发明应用噬菌体展示文库对神经细胞凋亡相关蛋白 PKRcat进行筛选， 获得了一 个特异性结合 PKRcat的 12 肽， 其氨基酸序列如下 ： 0009 Ser-Val-His-Leu-Tyr-His-Ser-Thr-Lys-Thr-Leu-Arg。 0010 上述多肽， 能与PKR激酶结构域特异性结合， 并且能够抑制PKRcat磷酸化eIF2的 能力， IC50为 2.5M。 0011 所述的多肽可以用于抑制 PKRcat激酶活性。可应用于开发 PKRcat抑制剂。 0012 本发明提供的与 PKR 激酶结构域特异性结合的多肽的筛选和鉴定步骤如下 ： 0013 经过对人 P。

12、KRcat进行五轮筛选， 获得与 PKR 结合的重组噬菌体 ； 0014 ELISA 法检测噬菌体与 PKRcat的结合 ； 0015 单克隆噬菌体的分离制备 ； 0016 噬菌体基因组单链 DNA 的提取和获得寡肽序列 ； 0017 多肽固相合成， 竞争 ELISA 检测多肽与 PKRcat的结合 ； 0018 应用体外生物化学方法研究 12 肽对 PKRcat激酶活性的影响。 0019 本发明的有益效果是 ： 本发明提供的 12 肽能够特异性的与 PKRcat结合并抑制 PKRcat的激酶活性， 可应用于 PKRcat抑制剂的药物设计。 附图说明 0020 图 1. 是免疫印迹法 (Wes。

13、tern Blot) 检测纯化 PKRcat的激酶活性， 0021 图 2. 是噬菌体展示中每轮洗脱的噬菌体数， 以空孔作为对照， 0022 图 3. 是 ELISA 法检测筛选得到的噬菌体和原噬菌体库与包被 PKRcat的孔和空孔 的结合， 0023 图 4. 是 ELISA 法检测 10 个噬菌体单克隆与 PKRcat及空孔的结合， 0024 图 5. 是竞争 ELISA 法检测合成 12 肽与 PKRcat的结合， 0025 图 6. 是体外酶学方法检测合成 12 肽对 PKRcat激酶活性的影响。 具体实施方式 0026 实施例 1 ： 重组 PKRcat的表达纯化及活性的初步研究 0。

14、027 1. 重组 PKRcat质粒的构建 0028 利用已有的 pET28a-PKR 模板， 下面的 PCR 引物和 Pfu 聚合酶 PCR 扩增 PKRcat： 0029 正向引物 ： 5 -CATGCCATGGGCGACATGAAAGAAACAAAGTATACTG-3 0030 反向引物 ： 5 -GGCTCTCGAGACATGTGTGTCGTTCATTTTTCTC-3 0031 利用Nco I/Xho I消化扩增DNA片段， 并且克隆进入质粒pET28a(Novagen)。 将这 样构建的重组质粒命名为 pET28a-PKRcat并且导入大肠杆菌 BL21。重组质粒 pET28a-PK。

15、Rcat 允许在成熟的 PKRcat的 N 末端具有另外一个甲基硫氨酸残基和在 C 末端具有另外 6 个组氨 说 明 书 CN 101293917 B3/9 页 5 酸的重组 PKRcat的表达。 0032 2. 重组 PKRcat的纯化 0033 . 接含有 pET28a-PKRcat的 BL21 于 5mL LB 培养基 (50g/ml 卡那霉素 )， 37， 250rpm 摇菌过夜。 0034 .1 50 的比例转接到 4 个大瓶中 ( 每瓶 250mL LB 培养基， 50g/ml 卡那霉 素 )， 37， 250rpm 摇菌 2 小时。加入 300MIPTG， 27， 250rpm，。

16、 过夜诱导。 0035 .将诱导过夜的菌液10000rpm， 离心15分钟。 用Lysis Buffer(20mM Tris-HCl， 500mM NaCl， pH7.5) 重悬沉淀， 10000rpm， 离心 15 分钟。 0036 . 用 40mL Lysis Buffer 重悬所有沉淀， 加入 PMSF 蛋白酶抑制剂至终浓度为 1mM， 在冰浴中超声破碎 ( 功率 300W， 超声 5s， 停 15s， 90 循环 )。 0037 . 将裂解液 12000rpm， 15 分钟离心两次。将离心后的上清与 4mL Ni 树脂 4结 合 1 小时。 0038 . 在蛋白与树脂结合的同时， 清洗。

17、蛋白纯化仪 ： 先用清水清洗 B 管道， 再清洗 A 管道 (5mL/ 分钟 ) ； 再用 Elution Buffer(20mM Tris-HCl， 500mM NaCl， 250mM 咪唑， pH7.5) 清洗 B 管道 (0.5mL/ 分钟 ) ； 最后用 Lysis Buffer 清洗 A 管道 (0.5mL/ 分钟 )。 0039 . 将结合蛋白的树脂离心， 弃上清， 装柱， 连接于 AKTA prime plus 蛋白纯化仪 ( 通用电气 )。用 Lysis Buffer 漂洗 Beads， 洗下非特异结合的蛋白。用 Elution Buffer 梯度洗脱目的蛋白。 0040 . 。

18、根据蛋白峰的位置， 收集相应管的洗脱液， 跑 SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE)， 考马斯亮兰染色验证。 0041 3.PKRcat 激酶活性的初步分析 ： 0042 反应体系为 40L ： 0043 . 将 50ng 纯化 PKRcat加入置于冰上的试管中， 其终浓度为 25nM。 0044 .混合底物纯化的eIF2， ATP， 5Buffer A(100mM Tris-HCl， 200mM KCl， 10mM MgCl2) 和双蒸水使反应液中含终浓度为 20mMTris-HCl， 40mMKCl， 2mMMgCl2， 500nMeIF2， 100M ATP， 以此混合液启始。

19、反应。 0045 . 以混合液启始反应， 30水浴准确反应 10 分钟。加 8L 6Loading Buffer 终止反应。 0046 .90沸水中煮 5 分钟。样品冷却至室温， 微型离心机短暂离心 ( 15s)。 0047 . 上样， 进行 SDS-PAGE 电泳。 0048 .Western Blot 法检测 eIF2 的磷酸化状态。 0049 方法如下 ： 0050 100mA， 电转移 1.5 小时。 0051 用3的脱脂牛奶封闭膜， 室温摇床轻摇1小时。 加入第一抗体(磷酸化eIF2抗 体， 兔源， Invitrogen)， 室温摇床轻摇 1 小时。1TBST( 含 0.1 Twee。

20、n 的 TBS， pH7.4) 洗 膜3次， 每次5分钟。 与第二抗体反应(HRP偶联羊抗兔二抗， Santa Cruz Biotechnology)， 室温摇床轻摇 40 分钟。1TBST 洗膜 3 次， 每次 5 分钟。去离子水洗 5 分钟。加化学发光 底物 (ECL) 曝光。曝光强度经凝胶成像系统 Chemidoc XRS System(Bio-Rad) 定量。 0052 Stripe Buffer(7M盐酸胍， 10mMDTT)处理膜30分钟。 去离子水洗膜3次， 每次5分 说 明 书 CN 101293917 B4/9 页 6 钟。 用3的脱脂牛奶封闭膜， 室温摇床轻摇1小时。 加入。

21、第一抗体(anti-eIF2antibody， 兔源， Santa CruzBiotechnology)， 室温摇床轻摇 1 小时。1T BST( 含 0.1 Tween 的 TBS， pH7.4) 洗膜 3 次， 每次 5 分钟。与第二抗体反应 (HRP 偶联羊抗兔二抗， Santa Cruz Biotechnology)， 室温摇床轻摇 40 分钟。1TBST 洗膜 3 次， 每次 5 分钟。去离子水洗 5 分 钟。 加化学发光底物(ECL)曝光。 曝光强度经凝胶成像系统Chemidoc XRS System(Bio-Rad) 定量。 0053 eIF2 磷酸化程度磷酸化 eIF2 曝光强。

22、度 / 全 eIF2 曝光强度。 0054 结果 ： 从 1L 菌液中纯化出 4.8mg 的 PKRcat蛋白， 酶活分析表明纯化蛋白具有激酶 活性， 能够磷酸化 eIF2 ； 对照组未加入 PKRcat， eIF2 未被磷酸化 ( 图 1)。 0055 实施例 2 ： 经过五轮筛选获得能与 PKRcat 特异性结合的重组噬菌体 0056 1. 第一轮筛选与洗脱 ： 0057 . 用 NaHCO3溶液稀释 PKRcat蛋白至 100g/mL 的溶液， 要求 NaHCO3的终浓度为 0.1M。加 100L 该溶液到 96 孔板的一个孔中， 4包被过夜。 0058 . 加 150L 新鲜配制的含 。

23、0.5 (w/v)BSA 的 TBS(BTBS) 溶液到上步包被蛋白 的孔中， 室温摇摆平台放置 1 小时。 0059 . 与此同时， 将噬菌体 (1011 pfu) 加到 100L BTBS 中， 加到一个空孔中， 室温 摇摆平台放置 1 小时， 目的是将可以与 ELISA 板非特异性结合的噬菌体吸收掉。 0060 .倒掉蛋白/BTBS溶液， 用200LTBST(含 0.1Tween的TBS， pH7.4)洗6遍， 注意每次都不要让孔干了。最后一次洗完后， 将先前与板吸收过的噬菌体 /BTBS 溶液转移 到这个孔中。室温摇摆平台放置 1 小时。 0061 . 倒掉噬菌体 /BTBS 溶液， 。

24、用 200L TBST 洗 10 遍。 0062 . 加 100L 0.2M Glysine 洗脱结合的噬菌体， 室温摇摆平台放置 8 分钟， 立即 转移到小离心管中， 并用Tris-HCl buffer中和到pH为7-8。 4保存直到测定噬菌体浓度 或扩增。 0063 . 对照 ： 另一孔不包被蛋白按相同方法操作， 得到洗脱噬菌体并测定浓度。 0064 2. 扩增， 第二轮及之后几轮筛选与洗脱 ： 0065 .保留10-20L上步得到的噬菌体洗脱液用于测噬菌体滴度， 将剩余的噬菌体 全部扩增产生用于下一轮筛选的噬菌体。 0066 提前将大肠杆菌 ER2738F lacIq(lacZ)M15 。

25、proA+B+ zzf:Tn10(TetR)/fhuA2 supE thi(lac-proAB)(hsdMS-mcrB)5(rk-mk-McrBC-)菌株保存在含50甘油的LB培养 基中， 存于 -70 接到 LB 培养基中， 摇床培养到 OD600nm为 0.5 时， 取 1mL 大肠杆菌 ER2738 转接到含有 30mLLB 培养基的三角瓶中， 同时将要扩增的噬菌体加入， 37摇床培养 4.5 小 时。 0067 . 转移上步的培养物到离心管中， 室温， 10000rpm 离心 15 分钟。将 80的上清 吸到新的离心管中， 加入 1/6 上清体积的 PEG 溶液， 4沉淀过夜。 006。

26、8 .4， 10000rpm 离心 30 分钟， 缓慢倒出上清， 再小心的将管壁上的液体离心下 来， 用微量移液器小心弃掉。 0069 . 用 200L TBS 重悬沉淀， 转移悬液到 0.5mL 离心管中， 室温 10000rpm 离心 5 分钟。 说 明 书 CN 101293917 B5/9 页 7 0070 . 上清转移到新的 0.5mL 离心管中， 这就是扩增了的噬菌体。4保存用于测浓 度和下一轮筛选。 0071 . 包被 ELISA 板的另一个孔， 加入 1011 pfu 第一轮扩增噬菌体。按第一轮的方 法进行第二轮及之后几轮的筛选和扩增， 每轮噬菌体的加入量要保持与第一轮一致。 。

27、0072 3. 噬菌体滴度的测定的具体实施 ： 0073 .大肠杆菌ER2738接种到5mL LB培养基中， 37摇床培养至对数早中期(OD600nm 大约 0.5)。 0074 . 融化上层胶 ( 含有 0.7琼脂粉的 LB 培养基 )， 分装 3mL/ 管， 45水浴平衡， 准备好使用。 0075 . 用 LB 培养基将洗脱 ( 或扩增 ) 后的噬菌体进行 10 倍系列稀释。 0076 稀释比例如下 ： 0077 对于扩增的噬菌体液， 稀释 1010和 1011倍。 0078 对于洗脱下来的噬菌体液， 第一轮按102和103稀释， 以后每多一轮就增加10倍稀 释度。 0079 将 10L 。

28、噬菌体稀释液加入到 200L 第一步的 ER2738 菌液中， ， 轻轻混匀， 室温 放置 1-5 分钟。 0080 .转移第三步噬菌体感染的ER2738菌液到第二步中45平衡的上层胶中， 迅速 摇动， 立即倒入 37预温的 LB 平板 ( 涂有 IPTG 和 X-gal) 上， 均匀铺平。 0081 . 冷却 5 分钟， 反转平板， 37培养过夜。 0082 . 计数器统计平板上的噬菌斑数量， 根据稀释倍数计算噬菌体的浓度。 0083 结果 ： 进行 5 轮富集筛选， 每轮从 PKRcat上洗脱下来的噬菌体量在总体上逐渐升 高， 与对照孔比较实现了 104倍富集 ( 表 1)。表 1 中五轮。

29、的噬菌体数用图 1 表示。图 1 中 ： 纵坐标用对数值表示， 横坐标代表轮数。 0084 表 1 筛选对 PKRcat特异性结合的噬菌体 0085 PKRcat(pfu) 空白 (pfu) 第一轮 3.0104 8.0102 第二轮 9.0105 2.0103 第三轮 2.0107 3.2103 第四轮 6.0108 4.7103 第五轮 7.0108a 5.0103 0086 a. 第五轮洗脱下的噬菌体量与第四轮持平说明对 PKRcat结合噬菌体的富集已经 达到饱和， 更多轮的筛选并不能增加富集程度。 0087 实施例 3 ： ELISA 检测筛选到的噬菌体对 PKRcat 及对照结合能力。

30、 0088 . 用 NaHCO3溶液稀释蛋白为 100g/mL 的溶液， 要求 NaHCO3的终浓度为 0.1M。 说 明 书 CN 101293917 B6/9 页 8 加 100L 该溶液到 96 孔板的两个孔中， 4过夜固定。同时按照同样的方法将 BSA 加入另 两个孔作对照。 0089 . 每孔加 100uL 3的 BSA 封闭未结合蛋白的部分， 室温摇摆平台放置 1 小时。 0090 . 根据所测的第五轮洗脱下的噬菌体的浓度， 将噬菌体用 TBST 稀释， 每孔加 100L， 噬菌体约 109-1010。室温摇摆平台放置 1 小时。 0091 . 每个孔用 200l TBST 洗 6。

31、 次。 0092 .HRP- 抗 M13 抗体 (Pharmacia Biotech 公司 ) 按 1 5000 用 TBST 稀释， 每孔 加 100L， 室温摇摆平台放置 1 小时。 0093 . 每个孔用 TBST 洗 6 次。 0094 . 按 60L 四氨基联苯胺 (TMB， Sigma 公司， 10mg/mL 溶于 DMSO) 加到 10mL 柠 檬酸 - 醋酸钠 (Critate-Ac) 中， 再加入 3L H2O2配制底物， 每孔加 100L 所配制的底物 显色。 0095 .1 分钟后加 100L 1M H2SO4终止反应。 0096 . 用酶标仪在 OD450nm下测定吸光。

32、值。 0097 结果 ： 第五轮得到的特异性噬菌体库与 PKRcat结合能力远远大于原始噬菌体库， 第五轮得到的特异性噬菌体库与 PKRcat结合能力也远远大于其与 BSA 结合能力， 即第五轮 得到的噬菌体库能够特异性与 PKRcat结合 ( 图 2)。图 2 中 ： 横坐标代表不同的噬菌体库， 纵 坐标表示平均净吸光值， lib 代表文库噬菌体， R5 代表第五轮筛选到的特异性噬菌体， 白色 柱代表与 PKRcat的结合， 黑色柱代表与对照的结合。 0098 实施例 4 ： 单克隆噬菌体的分离制备 0099 1. 特异性结合的噬菌体克隆的确定 0100 . 在测定第五轮洗脱噬菌体的平板上挑。

33、取 10 个单克隆鉴定多肽序列。 0101 . 用灭菌的牙签挑取一个蓝色噬菌斑转接于含培养至对数中期的大肠杆菌 ER2738 的试管中。 0102 .37摇床培养 4-5 小时。 0103 . 转移培养物到 7mL 离心管中， 10000rpm 离心 10 分钟。 0104 .将80的上清吸到新的离心管中， 加1/6上清体积的PEG溶液， 4沉淀2小时。 0105 .4， 10000rpm 离心 30 分钟， 缓慢倒出上清， 用微量移液器小心将残留的液体 吸弃。 0106 . 用 200L TBS 重悬沉淀， 转移悬液到 0.5mL 离心管中， 4， 10000rpm 离心 5 分钟。 010。

34、7 . 上清转移到新的 0.5mL 离心管中， 这就是所挑取的噬菌体单克隆。4保存用 于测浓度， 如果要长期保存， 加 50甘油， 冻于 -20。 0108 2. 通过 ELISA 检测挑取的单克隆 0109 . 用 NaHCO3溶液稀释蛋白为 100g/mL 的溶液， 要求 NaHCO3的终浓度为 0.1M。 对于每个单克隆要包被至少两个孔， 一个孔包被所筛的蛋白， 另一个孔包被 BSA 作对照。每 孔加 100L 蛋白， 4过夜固定。 0110 .每孔加100L 3的BSA封闭未结合蛋白的部分， 室温摇摆平台放置1小时。 0111 . 根据所测的噬菌体单克隆浓度， 将一定量的噬菌体单克隆用。

35、 TBST 稀释， 每孔 说 明 书 CN 101293917 B7/9 页 9 加 100L， 使噬菌体加入量在 109-1010。室温摇摆平台放置 1 小时。 0112 . 每个孔用 200l TBST 洗 6 次。 0113 . 抗体按 1 5000 用 TBST 稀释， 每孔加 100L， 室温摇摆平台放置 1 小时。 0114 . 每个孔用 TBST 洗 6 次。 0115 .按60L TMB(10mg/mL溶于DMSO)加到10mL Critate-Ac中， 再加入3L H2O2 配制底物， 每孔加 100L 显色。 0116 .1 分钟后加 100L 1M H2SO4终止反应。 。

36、0117 . 用酶标仪在 OD450nm下测定吸光值。 0118 结果 ： 10 个单克隆都表现出对 PKRcat的高结合性 ( 图 3)。图 3 中 ： 横坐标表示不 同的噬菌体单克隆， 纵坐标表示平均净吸光值 ； 白色柱表示 PKRcat孔的平均净吸光值 ； 黑色 柱表示 BSA 孔的平均净吸光值。图 3 中每个噬菌体单克隆均与 PKRcat及 BSA 结合。洗涤后， 用辣根过氧化物酶偶联 M13 抗体及其底物 TMB 对每个孔进行 ELISA 反应， 并检测 OD450nm。对 每个克隆进行了两组检测， 图中数据为两组检测的平均值。 0119 实施例 5 ： 噬菌体基因组单链 DNA 的。

37、提取和 12 肽序列的获得 0120 . 将所挑取的 10 个单克隆噬菌体进行扩增。 0121 . 取 60L 扩增后的单克隆噬菌体溶液， 加入 20L PEG 溶液， 置于 4冰箱内 沉淀过夜。 0122 .10000rpm 离心 10 分钟， 弃上清并倒扣离心管， 使液体流尽。 0123 . 加入 200L 碘化物缓冲液， 再加入 500L 无水乙醇， 室温孵育 10 分钟。 0124 .10000rpm 离心 10 分钟， 弃上清， 用 70乙醇洗沉淀。 0125 .10000rpm 离心 10 分钟， 弃上清， 干燥， 让残余液体蒸发完全。 0126 . 重悬沉淀于 30L 去离子水中。

38、， 该溶液即该单克隆噬菌体的基因组单链 DNA。 0127 . 以 -96gIII 引物 (5 -C CCTCATAGTTAGCGTAACG-3 ， New England Biolabs 随 机十二肽噬菌体展示文库产品 ) 测序。测序结果用 Prime Primier 软件翻译， 得到多肽序 列。序列如下 ： 0128 Ser-Val-His-Leu-Tyr-His-Ser-Thr-Lys-Thr-Leu-Arg 0129 Asp-Tyr-Met-Ser-Thr-Leu-Phe-Met-Ala-His-Gln-Thr 0130 实施例 6 ： 固相多肽合成 0131 . 采用 Fmoc 保护。

39、氨基酸合成的策略， 在固相载体上合成多肽 ； 合成完成后用 TFA( 三氟乙酸 ) 切割， 乙醚沉淀得到多肽粗产品。 0132 . 用制备色谱 (HPLC) 纯化多肽， 得到多肽纯品。 0133 用 Merck C18 色谱柱， 含 0.05的 TFA 的乙腈线性梯度洗脱 ( 乙腈浓度在 30min 内从 5变化到 35 )， 紫外 210nm 波长检测， 收集单一组分的峰。 0134 质谱测试 (MS)。 0135 结果 ： HPLC 峰面积积分比较得到两种多肽纯度均大于 95， 质谱中目标肽的分子 离子峰和设计肽的理论分子量一致， 两个试验结果表明获得了高纯度的目标肽。 0136 实施例 。

40、7 ： 合成多肽的竞争 ELISA 实验 0137 . 用 NaHCO3溶液稀释蛋白为 20g/mL 的溶液， 要求 NaHCO3的终浓度为 0.1M。 每孔加 60L， 共 48 个孔， 4过夜固定。 说 明 书 CN 101293917 B8/9 页 10 0138 . 倒掉蛋白液， 每个孔用 200L TBS 洗四遍。 0139 .每孔加200L 3的BSA封闭未结合蛋白的部分， 室温摇摆平台放置1小时。 0140 .倒掉BSA液， 加入不同浓度梯度的多肽1和多肽2(6个梯度)， 每孔加100L， 室温摇摆平台放置 1 小时。多肽 1 和多肽 2 分别以无关序列 (Scrambled S。

41、equence) 为对 照， 其它步骤相同。 0141 . 每个孔对应加入 109的噬菌体 ( 如加入多肽 1 的孔用带有多肽 1 的噬菌体去 竞争 )， 让其和多肽竞争与蛋白的结合， 室温摇摆平台放置 1 小时。 0142 . 每个孔用 200L TBST 洗 8 次。 0143 . 抗体按 1 5000 用 TBST 稀释， 每孔加 60L， 室温摇摆平台放置 1 小时。 0144 . 每个孔用 TBST 洗 8 次。 0145 .60L TMB(10mg/mL 溶于 DMSO) 加入到 10mL Critate-Ac(PH6.0) 中， 再加入 3L H2O2即为底物， 每孔加 100L。

42、 显色。90s 后加 50L 1M H2SO4终止反应。 0146 . 用酶标仪在 OD450nm下测定吸光值。 0147 结果 ： 随着多肽1和多肽2浓度增加， 表征噬菌体与PKRcat结合的OD450nm逐渐降低 ； 而无关序列多肽的加入并不引起 OD450nm的降低 ( 图 4)。表明合成多肽 1 和合成多肽 2 能够 与对应噬菌体竞争结合 PKRcat。 0148 实施例 8 ： 多肽对 PKRcat激酶活性的影响 0149 . 用 DMSO 配制 5mg/ml 多肽 ( 多肽 1， 多肽 2， 对照多肽 ) 储液， 保存于 -70冰 箱。 0150 .用缓冲液TBS稀释多肽1至100。

43、g/mL， 对照多肽至100g/mL ； 用含2DMSO 的 TBS 稀释多肽 2 至 10g/mL。用含 2 DMSO 的 TBS 连续稀释多肽 1 至浓度为 50g/mL， 10g/mL， 5g/mL， 1g/mL ； 稀释多肽 2 至 5g/mL， 2.5g/mL， 1g/mL， 0.5g/mL。 0151 .10L 不同浓度多肽与 50ng 纯化 PKRcat混合， 冰上孵育 15 分钟。 0152 . 其余步骤与实施例 1(3)PKRcat活性的初步分析相同， 求得 eIF2 的磷酸化程 度。 0153 结果 ： 对照多肽对 PKRcat激酶活性没有影响， 多肽 1 和多肽 2 抑制。

44、 PKRcat对 eIF2 的磷酸化反应 ( 图 5)。多肽 1 的 IC50约为 2.5M， 多肽 2 的 IC50约为 250nM。 0154 SEQUENCE LISTING 0155 南开大学 0156 与 PKR 激酶结构域特异性结合的多肽及其应用 0157 2 0158 1 0159 12 0160 PRT 0161 人工序列 0162 0163 PEPTIDE 0164 (1).(12) 0165 说 明 书 CN 101293917 B9/9 页 11 0166 1 0167 Ser Val His Leu Tyr His Ser Thr Lys Thr Leu Arg 016。

45、8 1 5 10 0169 2 0170 12 0171 PRT 0172 人工序列 0173 0174 PEPTIDE 0175 (1).(12) 0176 0177 2 0178 Asp Tyr Met Ser Thr Leu Phe Met Ala His Gln Thr 0179 1 5 10 说 明 书 CN 101293917 B1/4 页 12 图 1 图 2 说 明 书 附 图 CN 101293917 B2/4 页 13 图 3 图 4 说 明 书 附 图 CN 101293917 B3/4 页 14 图 5 说 明 书 附 图 CN 101293917 B4/4 页 15 图 6 说 明 书 附 图 。